DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

1、DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化DNA1组DNAS组基因重组是指,由不同DNA连的断裂和连接而产生DNA>t段的交换和重新组合,形成新DN心子的过程.原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式.受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNAt段,并使它整合到自己的基因组中,从而获得供体细胞局部遗传性状的现象,称为转化.通过噬菌体媒介,将供体细胞DNAt段带进受体细胞中,使后者获得前者的局部遗传性状的现象,称为转导.自然界中转导现象较普遍,可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种根本方式.高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行,即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的局部遗

2、传物质可实现交换,导致基因重组.基因重组是杂交育种的生物学根底,对生物圈的繁荣兴盛起重要作用,也是基因工程中的关键性内容.基因工程的特点是基因体外重组,即在离体条件下对DN份子切割并将其与载体DNA分子连接,得到重组DNA并将其导入到受体中微生物或高等动植物,从而使受体获得某些有益性状.1977年美国科学家首次用重组的人生长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功.此后,运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果.质粒把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体Vector.YAGBAC噬菌体、细菌质粒等

3、是重组DN破术中常用的载体.一个理想的克隆载体大致应有以下一些特性：1分子量小、多拷贝、松驰限制型；2具有多种常用的限制性内切酶的单切点；3能插入较大的外源DNA>t段；4具有容易操作的检测表型.质粒Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DN附子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中.质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录水平,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,弁表达所携带的遗传信息.质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞那么不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活.质粒的存在使宿主具有一些额外的

4、特性,如对抗生素的抗性等.F质粒又称F因子或性质粒、R质粒抗药性因子和Gol质粒产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒.质粒载体是在天然质粒的根底上为适应实验室操作而进行人工构建的.与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因如抗生素抗性基因和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作.大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA体外转录外源DNA列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等.常用的质粒载体大小一般在1kb至10k

5、b之间,如PBR322PUC系歹hPGE陈列和pBluescript简称pBSS等.质粒具有稳定可靠和操作简便的优点.如果要克隆较小的DNA片段V10kb且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好.本实验中应用T载体转化受体菌E.coliDH5a的菌株.由于T载体上带有Ampr和lacZ基因,故重组子的筛选采用Am而性筛选与a-互补现象筛选相结合的方法.因T载体带有Ampr氨芾青霉素耐受基因,故转化受体菌后只有带有T载体DNA的转化子才能在含有Amp氨芾青霉素的LB平板上存活下来；而未获得转化的空细菌那么不能存活.此为初步的抗性筛选.T载体上带有B-半乳糖甘酶基因lacZ的调控序列和B-半乳糖音酶

6、N端146个氨基酸的编码序列.这个编码区中插入了一个多克隆位点,但弁没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能.E.coliDH5a菌株带有B-半乳糖甘酶C端局部序列的编码信息.在各自独立的情况下,T载体和DH5a编码的B-半乳糖甘酶的片段都没有酶活性.但在T载体和DH5a融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质.这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的S-半乳糖甘酸阴性突变体之间实现互补的现象叫a-互补.由a-互补产生的Lac+细菌较易识别,它在生色底物X-gal(5-澳-4氯-3-呷噪-B-D-半乳糖昔)的存在下被IPTG(异丙基硫代-B-D-半乳糖甘)诱导形成

7、蓝色菌落.当外源片段插入到T载体质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去a-互补水平,因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落.在LB培养基上,a-互补产生的Lac+细菌由于含B-半乳糖甘酶,能分解LB培养基中的X-gal,产生蓝色菌落,而当外源片段插入后,失去厂互补水平,因而不产生B-半乳糖甘酶,无法分解培养基中的X-gal,菌落呈白色.由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开.此为a-互补现象筛选.注：X-gal是5-澳-4-氯-3-回噪-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galac

8、toside)以半孚L糖昔酶(b-galactosidase)水解后生成的阻噪衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代半乳糖昔(Isopropylthiogalactoside),为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表达.连接策略外源DNA>t段和质粒载体的连接反响策略有以下几种：(1)带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理质粒和外源片段,即可得到这样的末端.但是在连接反响中值得注意的是,由于质粒和外源片段本身可能含有两个相同粘性末端,因此均可能发生质粒的自身环化或外源片段形成的寡聚物,而且正反两种连接方向都可能有.所以,必须在实验方案中尽可能保证正确连接产物的数量到达最高,同时需进行后

9、续阳性克隆的筛选.带有非互补粘性末端用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DN四段,一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点,因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体,从而将外源片段定向地克隆到载体上.也可在PCRT增时,在DNAt段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连.(3)带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生,或由DNA聚合酶补平所致.由于在连接反响中,平端的连接效率比粘性末端要低得多,故使用T4DNA1接酶的浓度和外源DNAR载体DNA浓度均要高得多.通常还需参加低浓度的聚乙二醇

10、(PEG8000)以促进DN份子凝聚成聚集体的物质以提升转化效率.特殊情况下,外源DN附子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,那么可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配,也可以有限制的使用E.coliDN课合酶I的klenow大片段局部填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接.转化转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的根本实验技术.转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,

11、即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M-),它可以容忍外源DN心子进入体内并稳定地遗传给后代.受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells).进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状.将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA子的受体细胞).目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高

12、,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可参加占总体积15%的无菌甘油于-70C保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛.为了提升转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：(1)细胞生长状态和密度：不要用经过屡次转接或储于4c的培养菌,最好从-70C或-20C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,密度过高或缺乏均会影响转化效率.(2)质粒的质量和浓度：转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大时,转化效率就会降低.一般情况下,1ng的DNA即可使50

13、"的感受态细胞到达饱和,同时DNA容液的体积不应超过感受态细胞体积的5%.(3)试剂的质量：所用的试剂,如CaCb等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于枯燥的冷暗处.(4)预防杂菌和杂DNA勺污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿、离心管等需经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌或过滤除菌,且注意防止被其它试剂、DNAS或杂DNA)f污染.本实验方案本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCb处理,使其处于感受态(本实验购置了商品化的感受态),然后与pBS质粒共彳温,实现转化.由于pBS质粒带有氨芾青霉素抗性基因(Ampr),可通过Am

14、p抗性来筛选转化子.如受体细胞没有转入pBS,那么在含Amp的培养基上不能生长.能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pB4带有插入片段的转化子由于破坏了半乳糖甘酶基因,呈白色；不带外源片段的转化子可以分解X-gal,呈兰色.将白色转化子挑出后扩大培养,PCR鉴定后进一步酶切鉴定.一、试剂材料及设备试齐ij:X-gal储液(20mg/ml),IPTG储液(200mg/ml),LB液体培养基,0.1mol/L的CaCl2溶液,Am滑液,含Amp的LB固体培养基,含X-gal和IPTG的筛选培养基,pMD18-Tvector;注：具体配方见实验六后附录材料：外源DNAt段：一一PC

15、R屯化回收产物,载体DNA-pBS质粒(Ampr,lacZ),E.coliDH5a一株R-,M",Amp)"设备：恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温培养箱,电泳仪,无菌工作台,微量移液枪,eppendorf管,低温冰箱,制冰机,分光光度计二、实验步骤及考前须知(一)连接反响1、样品混匀冰上溶解solutionI、vector及重组DNAt段等,涡旋混匀并短暂离心.2、配制连接体系按以下顺序在参加各种成分,建立连接反响.成分体积vector0.5l纯化产物4.5lTotal5itl注：纯化产物白使用量0.1pmol-0.3pmol;3、参加So

16、lutionISolutionI的体积为5l,轻轻吹吸混匀.4、连接反响16C连接30min水浴或PC做进行.二感受态细胞的制备CaCl2法1、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5a单菌落,接种于5mlLB液体培养基中,37C下振荡培养12小时左右过夜,直至对数生长后期；将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于50mlLB液体培养基中,37C300转振荡培养3小时至OD600=0.5左右O2、收集菌体将5ml培养液转入预冷的离心管中,冰上放置10分钟,然后于4c下4000转离心10分钟.3、CaCl2悬浮细胞,制备感受态弃上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1m

17、l轻轻悬浮细胞,4c下4000r/min离心10分钟.弃去上清,倒出培养液,将管倒置几秒钟以使最后残留的痕量培养液流尽.参加0.2ml预冷0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,转入1.5ml离心管,冰上放置20分钟,即成感受态细胞悬液.4、感受态细胞冻存3中用含15%t油的0.1mol/L的CaCl2溶液代替普通预冷CaCl2溶液,重悬细胞,即可贮存于-70C可保存半年.使用时从-70C冰箱中取出感受态细胞悬液,室温下使其解冻解冻后立即置冰上.三转化1、 混合冰上迅速解冻感受态细胞,取50以l+重组DNA5以J用手指轻弹混匀；置于冰上,静置30min,使二者充分结合；注：1解冻感受态

18、细胞,动作要快；以免影响细胞转化效率；2重组DNA质粒解冻后,混匀,瞬间离心再取；3质粒含量不宜过多,一般不超过50ng,体积不超过10词4感受态细胞和DNA混匀时不要用枪吹打,以免影响细胞转化效率；2、 热击42c水浴,热击45秒,后迅速置于冰上冷却2-3分钟,过程中不要摇动离心管.注：1热击操作使DNA4入感受态细胞；2不同感受态细胞,热击时间亦有所不同；3冰上迅速冷却,使得DN3感受态中稳定；3、 菌的增殖参加不含抗生素Amp的LB液体培养基500浮混匀,37C振荡1小时转速为200转/分.注：此步骤主要是为了使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因.4、 铺板取100皿的

19、菌液加到含Amp及IPTG4ul/X-gal40ul的筛选平板上,用涂布棒小心涂布均匀；室温正置1小时左右,使菌液完全被培养基吸收；注：1含Amp及IPTG/X-gal的筛选平板需要事从冰箱中取出,倒置,使之恢复室温；2涂布的菌液量要适当,以免形成的菌落密度过密或过稀,不利于后续挑菌.5、 过夜培养倒置培养皿,37C培养箱中静置培养过夜.注：1倒置培养是预防冷凝水浸润到培养基中；2静置培养时间不宜过长,时间过久会出现“卫星菌落附录：试剂配方1、X-gal储液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以预防受光照被破坏,储存于-20C.2、IPTG

20、储液(200mg/ml):在800"蒸储水中溶解200mgIPTG后,用蒸储水定容至1ml,用0.22以m滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20C.3、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50以g/mlAmp的LB平板外表加40以lX-gal储液和4以lIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,备用.4、Am滑液：配成50mg/ml水溶液,-20C保存备用.5、含Amp的LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉,高压灭菌.冷却至60c左右,参加Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板.6、0.1mol/L的CaCl2溶液：溶于重蒸水中,定容后过

21、滤灭菌.7、LB液体培养基(20g/L):LB固体粉末20g,参加1L自来水,溶解后高压灭菌.8、质粒重组试剂盒：pMD18-Tvector(TaKaRa实验七重组克隆的蓝白斑筛选一、材料与试剂试剂：含重组DN明段的E.coliDH5a菌株,Am阴液50mg/ml水溶液,LB液体培养基,PCR式剂J盒仪器：牙签、恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温培养箱,电泳仪,无菌工作台,微量移液枪,eppendorf管,低温冰箱二、实验步骤与考前须知1、阳性克隆筛选取过夜倒置培养的平板,观察平板：是否出现明显而又未相互重叠的单菌落注：1如果未出现菌落或菌落较小,可以延长培养时

22、间.2在含X-gal和ITPG的LB培养基上,带有插入片段的重组质粒转化子,应呈现白色菌落,由于插入片段破坏了原载体中B-半乳糖甘酶活性；带有空载体的转化子,由于具有B-半乳糖甘酶活性,为蓝色菌落；不带有质粒载体DNA勺细胞,由于无Am诋,性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活.2、挑阳性菌用牙签随机挑取白色重组菌,沾至含有Am航生素1ml液体LB培养基中,37度培养过夜转速200转/分.3、菌落PCR5分钟1菌液模板的获取取0.2ml过夜培养的菌液于1.5ml离心管中,沸水浴12000rpm,离心3分钟.2配制PCR体系253模板：取2山清作为模板；引物：pGE-TVector多克隆位点两侧

23、的序列；或从基因组中扩增出片段时所用的引物.反响体系：组分工作浓度体积终浓度10XBuffer2.51XdNTP(10mM)0.53200HM引物(上下游2口0.2四2.59菌液2口100ngTaq(5U/")0.25111.25U灭菌ddH2O补齐3)PCR反响条件94C预变性2分钟94C久生30秒57C退表30秒28cycles72C延伸30秒72C延伸5分钟4)电泳取10HlPCFJTW,参加上样缓冲液,1.5%琼脂糖电泳检测插入片段的大小是否与目的基因一致.实验八质粒DNA勺提取、酶切及电泳检测质粒DNA勺提取与电泳根本步骤培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；别离和纯化质粒D

24、NA实验原理采用十二烷基磺酸钠(SDS)或TritonX-100可使细胞膜裂解.经SDS或TritonX-100处理后,细菌染色体DNA缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段.当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中.电泳检测在细

25、菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在.在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA,简称ocDNA);如果质粒DNA勺两条链在同一处断裂,那么形成线状DNA(LinearDNA).当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA具超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快.酶切鉴定能特异地结合限制性酶识别的DN峙列之内或其附近的特异位点上,弁切割双链DNA如EcoRI切割识别序列后产生两个互补的粘性末端.5-GJAATTC3&#

26、39;5'GAATTC3'3-CTTA4G5-3'CTTAAG-5'酶切反响影响因素DNA屯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响酶切反响的效率.DNA大局部限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响.当他量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头.缓冲液：如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度.假设两者可用同一缓冲液,那么可同时水解.假设需要不同的盐浓度,那么低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解.也可在第一个酶切反响完成后,用

27、等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70C低温冰箱30分钟,离心、干燥弁重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反响.酶切图谱DNA艮制性内切酶酶切图谱又称DNA勺物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示.在DNA歹U分析、基因组的功能图谱绘制、DNA勺无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来开展起来的RFLP版制性片段长度多态性)技术更是建立在它的根底上.在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清楚的电泳图谱,一般DN丽量名勺为0.5-1以g.限制性内切酶的酶解反响最适条件各不相同

28、,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反响温度(大多数为37C)O对质粒DNA酶切反响而言,限制性内切酶用量可按标准体系1以gDN劭口1单位酶,消化1-2小时.但要完全酶解那么必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反响时间也要适当延长.一、试剂1、溶液I：50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris.Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0).溶液I可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌(6.895*104Pa)15分钟,储存于4c冰箱.2、溶液II:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释),1%SDS.3、溶液田：5mol/LKAc60ml,冰

29、醋酸11.5ml,H2O28.5ml,定容至100ml,并高压灭菌.溶液终浓度为:K+3mol/L,Ac-5mol/L.4、RNase酶10mg/ml5、STE0.1mol/LNaCl,10mmol/LTrisCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0).二、实验步骤与考前须知1、接菌用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基含50以g/mlAmp中,37C振荡培养约12小时至对数生长后期.后续步骤2-4为质粒DNA量快速提取碱法该方法对于从大量转化子中制备少量局部纯化的质粒DNA十分有用.这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNAt一定纯度,可满足限制酶切割

30、、电泳分析的需要.注：提取过程保持低温稍好.2、菌体的收集取5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中屡次离心在同一管中进行,将沉淀一并收集,12000g离心30秒.弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽.注：菌液量要适当,太少可能无法保证后续实验要求,太多会使裂解提取步骤不够充分.3、菌体裂解1洗涤菌体用1mlSTE重悬洗涤菌体,离心,12000g离心30秒,收集菌体.重复用STE漂洗菌体.注：洗涤的目的在于除去培养基中菌株细胞壁成分,以免其抑(2)参加溶液I使菌体充分裂解菌体沉淀重悬浮于200溶液I中,剧烈振荡,使菌体充分裂解.(3)参加溶液n变性DNA参加新配制的溶液n300以l,盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管6-8次,此时溶液变澄清