细胞生物学试验讲义

1、细胞遗传学实验讲义细胞遗传学课程组编写山东理工大学生命科学学院2021. 9第一局部遗传学实验实验一果蝇的性别鉴定、性状观察及饲养方法 1实验二果蝇的双因子杂交实验7.实验三果蝇的伴性遗传8.实验四果蝇的三点测交1.0实验五果蝇唾腺染色体的制备和观察 12实验六植物有丝分裂过程中染色体行为的观察 1 5实验七植物减数分裂过程中染色体行为的观察 1 7实验八去壁低渗法制备植物染色体标本 20实验九植物染色体核型分析 22第二局部细胞生物学实验实验一特殊光学显微镜的原理和使用26实验二电子显微镜的原理和使用 31实验三Feulgen反响35实验四细胞融合37实验五细胞膜的通透性40实验六植物凝集素

2、对红细胞的凝集作用 40实验七叶绿体的别离和荧光观察 42实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察 45第一局部遗传学实验实验一果蝇的性别鉴定、性状观察及饲养方法实验目的1 掌握果蝇的根本特征及鉴别雌、雄果蝇的方法，熟悉常见突变型;2了解果蝇生活周期的特征及各阶段的形态变化；3. 掌握果蝇的饲养、麻醉等实验处理的方法和技术。实验原理果蝇属于昆虫纲、双翅目、果蝇科、果蝇属。成虫具有一对兴旺的膜质前翅，后翅特化为一对平衡棒。果蝇作为遗传学实验材料具有很多突出的优点：1 容易饲养，生活周期短在25°C下约910天就能完成一个世代；2繁殖 能力强，每只受精的雌虫约可产卵 400600粒，因此在短时

3、间内可获得较大的 子代群体，有利于遗传学分析；3突变类型多，研究得较清楚的突变已达400 多个，且多数是形态特征的变异，便于观察；4染色体数目少，2n = 8，唾腺 染色体较大。因此果蝇在遗传学研究中得到广泛应用。三实验材料、器具和试剂1. 实验材料野生型果蝇常见的突变型果蝇黑檀体、残翅、白眼及三隐性突变体：白眼小翅焦刚毛。2. 器具体视显微镜、毛笔、麻醉瓶、白纸板、尸体盛留器内装 70%的乙醇或自来 水。培养果蝇所需设备：生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅或温度可达160C左右的烘箱、培养瓶、天平。3. 药品或试剂乙醚装在滴瓶中配制果蝇培养基的药品：玉米粉、蔗糖食用白砂糖即可、酵母粉市售 酵母粉即可

4、、丙酸、琼脂、水蒸馏水或自来水均可。四实验步骤一生活周期的观察果蝇是完全变态昆虫，生活周期可分为 4个时期：卵、幼虫、蛹和成虫。果 蝇生活周期的长短与培养温度直接相关，最适培养温度为2025 C,温度越高，生长越快，但高于30C引起果蝇不育甚至死亡，低温那么使其生活周期延长。20E 时，果蝇卵到成虫约需15天，25E时，从卵到成虫约需10天，在25E时成虫 约活15天。图1果蝇的生活周期25r下，成蝇一般在交配一、两天后开始产卵。果蝇四个生长时期的特点如 下：卵：白色，椭圆形，长约0.5mm，前端反面有一对触丝能使卵附着在食物上。 受精卵在24小时内就可孵化成幼虫。幼虫：从卵孵化出来后，经过两

5、次蜕皮，发育成三龄幼虫。此时幼虫体长4-5m m,幼虫头尖尾钝，头上有一黑色钩状口器。幼虫活动力强而贪食，它们在 培养基上爬行时，留下很多条沟，沟多而且宽时，说明幼虫生长良好。幼虫生活 4天左右开始化蛹。蛹：化蛹前三龄幼虫停止摄食，爬到相对枯燥的外表上如培养瓶壁，逐 渐形成菱形的蛹，起初蛹壳颜色淡黄而柔软，以后逐渐硬化，变为深褐色，说明 即将羽化了。成虫：刚从蛹壳里羽化出来的果蝇虫体比拟长，翅膀尚未展开，体表尚未完 全几丁质化，故呈半透明的乳白色。透过腹部体壁，可以看到黑色的消化系统。不久，变为短粗圆形，双翅展开，体色加深。从蛹壳中羽化出来的果蝇 812 小时即可交配，交配后精子可在雌蝇的受精

6、囊中贮存一段时间， 然后逐渐释放到 输卵管中。未交配的雌果蝇称为处女蝇。果蝇杂交实验必须选用处女蝇，因此选择处女蝇的时间是在羽化后12小时以内为保证实验准确可靠，以选择羽化后 8小时以内的雌蝇为好。收集处女 蝇的方法是：选择一个果蝇生长良好、含有较多即将羽化的蛹的培养瓶，去除其 中所有成蝇。去除成蝇后的12小时8小时更为可靠内，从该瓶中收集到的 雌蝇即为处女蝇，反复收集直到数量足够应用为止。处女蝇单独存放在一个新的 培养瓶中，最好在距杂交实验前一星期左右开始收集处女蝇， 这样能将收集到的 处女蝇存放几天以检验 处女性如培养35天后瓶中出现幼虫那么说明收集失 败，得重新收集。不同时间收集的处女蝇

7、最好分开存放。二果蝇的形态特征和常见的突变类型1 雌雄果蝇的鉴别雌雄果蝇的主要区别见表1和图2,图3,图4。表1雌雄果蝇的主要区别$大小大小形态腹部末端稍尖腹部末端呈钝圆形颜色腹部末端色浅，腹部反面呈5条黑色 条纹腹部末端黑色，腹背3条条纹，最 后一条极宽，并延伸到腹面，呈一 明显黑斑性梳无第一对胸足的跗节基部有性梳腹部6个腹片4个腹片性梳：果蝇只有雄体在第一对胸足的跗节基部有一黑色鬃毛结构，形似一小梳， 称为性梳。而雌体没有性梳。性梳的有无是鉴别雌雄蝇的可靠标志之一， 需要在 显微镜下才易观察。图2雌雄果蝇反面观图3雄果蝇胸足上的性梳图4雌雄果蝇腹部结构左雌右雄，雄蝇外生殖器的构造比雌蝇复杂

8、，颜色很深，雌蝇那么很浅，这是区分雌雄的一个特征。在果蝇的翅与第三对附肢之间有一对平衡棒，用于调整姿势保持平衡。2 常见突变性状的观察野生型果蝇为灰体、长翅翅的长度约为腹部长度的两倍、红眼、直刚毛头胸部以及复眼的周围具有平直，先端略弯的长型粗黑硬毛常见的突变体见表2三果蝇麻醉方法选择亲本果蝇进行杂交或观察果蝇性状时， 都先要将果蝇麻醉，使之处于不 活动状态。麻醉果蝇的操作步骤如下：1 准备好培养瓶、麻醉瓶及乙醚。轻拍瓶壁，让果蝇震落到培养基上。如瓶塞 上附着果蝇，那么稍稍晃动瓶塞，并将它们拍落在培养基上。表2果蝇常见的突变类型突变名称基因符号形状特征所在染色体白眼w复眼白色X黑檀体e体呈乌木色

9、，黑亮IIIR黑体b体呈深黑色IIL残翅vg翅退化，局部残留不能飞IIR小翅m翅较短，仅至腹端X焦刚毛sn3刚毛卷曲如烧焦状X2. 拔去麻醉瓶塞与培养瓶塞，迅速将培养瓶口倒扣在麻醉瓶口上。轻拍培养瓶 让果蝇落入麻醉瓶中(如果培养基已很稀松，那么切勿倒扣，应将两瓶口横着对接， 小心地将果蝇驱入麻醉瓶)。当麻醉瓶中的果蝇数量足够时， 将两瓶迅速分开各 自盖好。3. 把麻醉瓶中的果蝇拍落到瓶底，迅速拔出塞子，滴上几滴乙醚，重新塞上麻 醉瓶。麻醉一段时间后，果蝇不再活动，纷纷落入瓶底，麻醉完成。此时果蝇的翅膀是收紧的。长时间麻醉可使果蝇死亡，麻醉而死的果蝇翅膀外展，与身体成 45 °角。4.

10、 将麻醉的果蝇倾倒在一张干净的白纸板上，置于体视显微镜下用毛笔或解剖 针轻轻拨动观察。如在观察过程中果蝇苏醒过来，可用一培养皿罩住果蝇，再在 一滤纸条上滴一滴乙醚伸入培养皿中，形成一个临时麻醉小室再行麻醉。(四) 果蝇的培养1. 培养基的制备(1) 培养瓶的灭菌 果蝇的培养基要装在经过灭菌处理的培养瓶中。 灭菌可以防 止真菌污染，也可以杀死培养瓶中可能残留的幼虫或蛹，防止混杂。灭菌的方法 是：将带塞的培养瓶在160°C恒温箱中干热灭菌1小时，或在高压蒸汽灭菌锅中， 在1kg/cm2大气压、121C条件下灭菌1520mi n。(2) 培养基的配制 酵母菌是果蝇幼虫和成虫的主要食物， 但

11、凡能发酵的物质都可以成为它们的培养基。果蝇培养基的配制方法很多，表3列出其中一种。表3果蝇培养基成分配方水玉米粉蔗糖琼脂丙酸酵母粉1L105g75g7.5g6.25ml20g培养基配制过程如下：量取1L水，将大约一半倒入一干净的容器中，参加 琼脂加热溶解，水开后，参加蔗糖，搅拌均匀；将玉米粉参加另一半水中，搅拌 均匀，再沿着容器边慢慢倒入，边倒边搅拌这样玉米粉不易结块。继续煮 10多分钟，培养基成为一种糊状物时即可关火。参加丙酸用以防腐及酵母 粉，搅拌均匀即可分装。每瓶培养基厚约 2cm，室温下枯燥23天，待培养基 完全凝固，外表坚硬时再行接种，培养基太软会粘住果蝇致其死亡。2 果蝇培养温度对

12、果蝇的生长发育影响很大，25°C是最适生长温度；1020°C环境中生 活周期延长；低于10C那么可能影响生活力。因此可以利用此特征调节果蝇生长 的速度，控制其群体的大小。比方：原种培养旨在保种，可将培养瓶置于1819C下培养；杂交实验需要较大的群体，那么可将培养温度设为25C。培养时避免日光直射。五考前须知1. 麻醉果蝇时要掌握麻醉尺度，需要用活体时，注意不能麻醉过度使果蝇致死。2 把麻醉的果蝇移入一个新的培养瓶时，注意先将培养瓶横卧，用毛笔将果蝇 轻轻挑入，待果蝇苏醒后再将培养瓶直立起来，以防果蝇被新配制的略带粘稠的 培养基粘住导致死亡。3实验后不用的果蝇要倒入尸体盛留器

13、中，不可放飞。六思考题1 如何鉴别果蝇的雌雄？2. 什么是处女蝇，如何收集处女蝇？3记录实验中观察到的野生型果蝇及其常见突变体的性状。实验二 果蝇的双因子杂交实验实验目的1. 通过两对性状个体杂交，了解两对非等位基因间的自由组合现象、验证自 由组合规律。2. 掌握果蝇的杂交技术，学会记录交配结果和掌握统计处理方法。实验原理果蝇的灰体基因E与黑檀体基因e为一对相对性状，位于川R70.7位 置，而长翅Vg与残翅vg为另一对相对性状，位于U R67.0位置。这两对 基因是没有连锁关系的，位于不同染色体上的非等位基因。根据非等位基因别离的自由组合定律，在F1代产生配子时，非等位基因的别离是独立的，它们

14、彼此自由组合，产生四种基因型的配子EVg，Evg，eVg，evg，且它们的比例相同。这四种配子自由结合，因此在 F2代会出现9种基因 型的后代，假设显性完全，就出现 4种表型，比例为9: 3: 3: 1。正交：灰体残翅早H黑檀体长翅厂 PEEvgvg eeVgVg灰体长翅F1EeVgvgJ自交F2三实验材料1 器具显微镜、体视显微镜、恒温培养箱、培养瓶、麻醉瓶、毛笔2药品乙醚、果蝇培 养基3材料灰体长翅果蝇 EEVgVg、黑檀体残翅果蝇 eevgvg四实验步骤1 选处女蝇：每组做正交1瓶，正交选灰体残翅为母本，黑檀体长翅为父本， 将母本旧瓶中的果蝇全部麻醉处死，在 8-12h内收集处女蝇5只，

15、将处女蝇和5 只黑檀体雄蝇转移到新的杂交瓶中，贴好标签，于 25 C培养；2. 7d后，释放杂交亲本；3. 再过4-5天，F1成蝇出现，在处死亲本7天后，集中观察记录F1表型；4 .选取5对F1代果蝇，转入一新培养瓶，于25 E培养，其余F1代果蝇处死；5. 7d后，处死F1亲本；6. 再过5d，F2成蝇出现，开始观察记录，连续统计 7d。五考前须知1. 保证杂交所用的亲本雌果蝇一定是处女蝇；2. 杂交后倒掉亲本时，一定要倒干净，以免造成回交产生实验误差。同样在F1自交后，倒掉F1时一定要倒干净，以免造成 F1和F2的混杂产生实验误差3. 所有培养瓶的标签都应注明杂交组合、时间及培养人组别、姓

16、名。六实验结果观察1 .设计实验记录表以随时记录实验结果。2. 将实验结果进行统计分析得出结论。3. 将实验结果记录表及统计分析过程均写入实验报告。实验三果蝇的伴性遗传实验目的1了解伴性遗传并认识果蝇伴性遗传的特点。2正确认识伴性遗传与非伴性遗传的区别以及伴性基因在正反交中的差异实验原理位于性染色体上的基因的遗传方式与位于常染色体上的基因有一定差异，它在亲代与子代之间的传递方式与雌雄性别有关，这种遗传方式称为伴性遗传。伴性基因主要位于X染色体上，Y染色体上没有相应的等位基因。决定红眼、白眼的基因位于X染色体上，是-对等位基因。正父：野生型早突变型含反交：突变型早野生型含红眼红眼红眼白眼雌：野生

17、型雌：1/2野生型，1/2突变型雄：1/2野生型，1/2突变型雄：1/2野生型，1/2突变型非伴性基因的F1代均表现显性性状，而伴性基因，在正交情况下，F1代和非伴性遗传相同，而在反交情况下，F1代会出现隐性性状。交叉遗传：X染色体的遗传过程中，子代雄性个体的X染色体均来自母本， 而父本的X染色体总传递给子代雌性个体。三实验材料1 器具显微镜、体视显微镜、恒温培养箱、培养瓶、麻醉瓶、毛笔2药品乙醚、果蝇培 养基3材料野生型果蝇红眼+、突变型果蝇白眼 ww四实验步骤1. 选处女蝇：每两组做正、反交各1瓶，正交选野生型红眼为母本，突变型白眼为父本，将母本旧瓶中的果蝇全部麻醉处死，在8-12h内收集

18、处女蝇5只，将处女蝇和5只雄蝇转移到新的杂交瓶中，贴好标签，于 25°C培养；2. 7d后，释放杂交亲本一定要干净；3. 再过4-5天，F1成蝇出现，在处死亲本7天后，集中观察记录F1表型；4. 选取5对F1代果蝇，转入一新培养瓶，于 25 C培养，其余F1代果蝇处死；5. 7d后，处死F1亲本；6. 再过5d，F2成蝇出现，开始观察记录，连续统计 7d。五考前须知1. F1杂交时不需要选择处女蝇2杂交时先将麻醉的果蝇放在培养瓶壁上并将培养瓶横放，果蝇苏醒后再把培 养瓶竖起，防止培养基粘住麻醉后的果蝇。六实验结果观察1 设计实验记录表以随时记录实验结果。2 将实验结果进行统计分析得出

19、结论。3 将实验结果记录表及统计分析过程均写入实验报告。实验四果蝇的三点测交实验目的1掌握三点测交的原理及方法；2. 学习三点测交的数据统计处理及分析方法;3了解绘制遗传学图的原理和方法。实验原理连锁交换定律：处在同一染色体上的两个或两个以上基因遗传时， 联合在一 起的频率大于重新组合的频率。重组类型的产生是由于配子形成过程中， 同源染 色体的非姊妹染色单体间发生了局部交换的结果。三点测交：三点测交就是通过一次杂交和一次测交，同时确定三对等位基因即三个基因位点的排列顺序和它们之间的遗传距离，是基因定位的常用方法。 主要过程是：用三杂合体和三隐性个体杂交，获得三因子杂种F1，再使F1与三隐性基因

20、纯合体测交，通过对测交后代表现型及其数目的分析， 分别计算三 个连锁基因之间的交换值，从而确定这三个基因在同一染色体上的顺序和距离。 通过一次三点测验可以同时确定三个连锁基因的位置， 即相当于进行三次两点测 验，而且能在试验中检测到所发生的双交换。如果两个基因间的单交换并不影响邻近两个基因的单交换，那么预期的双交换频率应当等于两个单交换频率的乘积，但实际上观察到的双颊还值往往低于预期值，因为每一次发生单交换，它邻近也发生一次交换的时机就减少，这叫干预般用并发率表示干预的大小 三实验材料1 器具显微镜、体视显微镜、恒温培养箱、培养瓶、麻醉瓶、毛笔2药品乙醚、果蝇培 养基3材料黑腹果蝇品系：野生型

21、果蝇红眼、长翅、直刚毛 +三隐性突变体果蝇白眼、小翅、焦刚毛 wms n四实验步骤1. 选处女蝇：每组做正，反交各1瓶，正交选野生型为母本，三隐性雄蝇为父 本。反交选三隐性雌蝇为母本，野生型为父本，将母本旧瓶中的果蝇全部麻醉处 死，在8-12h内收集处女蝇5只，将处女蝇和5只雄蝇转移到新的杂交瓶中，贴 好标签，于25C培养；2. 7d后，释放杂交亲本一定要干净；3. 再过4-5天，F1成蝇出现，在处死亲本7天后，集中观察记录F1表型及性 别。4. 选取5对F1代果蝇，转入一新培养瓶，于 25 E培养，其余F1代果蝇处死;5. 7d后，处死F1亲本；6. 再过5d，F2成蝇出现，开始观察记录，连

22、续统计 7d,观察眼色，翅形及刚毛形态。正交只需统计雄性个体。要求每组至少统计250只果蝇。五考前须知1. 长翅果蝇在成虫未发育完全时翅较小此时体色较浅，注意与小翅果蝇区 别。2. 观察刚毛可以在体视显微镜或显微镜的低倍镜下。六实验结果观察1. 设计实验记录表以随时记录实验结果2 将实验结果进行统计分析并绘出连锁图3 为什么正交只需统计雄性个体？实验五果蝇唾腺染色体的制备和观祭一实验目的1. 掌握果蝇三龄幼虫唾腺的别离技术，学习唾腺染色体的制片方法。2. 观察了解果蝇唾腺染色体的结构特点。二实验原理果蝇是双翅目昆虫，其唾腺细胞发育到一定阶段后停止在间期，但紧密配对的同源染色体，仍能不断复制，复

23、制后产生的子染色体彼此不分开。复制可达9次之多，因此一对染色体最终可产生 2&9= 1024条染色质丝。它们集结在一起 形成了一条多线染色体，宽度可达 5m，长度可达400m，约为普通中期染色 体的100150倍，因而又称为巨大染色体，在显微镜下清晰可见。唾腺染色体形成时，染色体的着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚在一起形成 一种结构，称为染色中心chromocente。黑腹果蝇D.melanogate唾腺染 色体组成为2n=8,其中1号染色体X染色体是端着丝粒染色体，着丝粒的 一端附在染色中心，另一端游离；2号和3号染色体是中部着丝粒染色体，每条 染色体呈“V字形向外伸展出两条臂，形成2

24、L、2R、3L、3R四条臂L代表left arm,左臂；R代表right arm，右臂。4号染色体短小，呈点状附在染色中心 边缘。所以在光学显微镜下可见巨大染色体从染色中心向四周放射状地伸出5长1短共6条臂图5。雌雄果蝇唾腺染色体的差异在于，雄果蝇的 Y染色体 几乎包含在染色中心里，因为是异染色质，染色较淡。雄果蝇的X染色体比雌果蝇的X染色体细一些，因为雄性只有一条 X染色体。由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于分裂间期， 每条染色质丝都处于伸展 状态，因而不同于有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。 这些染色质丝的不同部位 螺旋化程度不同，其中螺旋化程度较高的部位形成染色粒。 这些染色粒经由多线 染

25、色体的放大，形成染色较深的横纹band，而染色粒间螺旋化程度较低的部 分那么形成了染色较浅的间纹in terba nd。研究说明，对一种果蝇来说，带纹的 宽窄、数目、位置等是恒定的，标志着物种的特征。当染色体上有结构畸变，如缺失、重复、倒位、易位等，很容易在唾腺染色体上鉴别，使唾腺染色体成为研究染色体变异的独特材料X2L图5 D.melanogater的巨大唾腺染色体的形态以及各条臂末端的形态及横纹特征 图中的箭头指向X染色体上蓬突，这是 X染色体的特征性的结构，星号指该染色体上深染 的横纹，小圆圈代表没有或带纹不明显。这些特征是识别各条臂的主要参考依据。三实验材料、器具和试剂1 实验材料黑腹

26、果蝇三龄幼虫2器具显微镜、双筒体视显微镜、解剖针、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸等3 药品及试剂生理盐水0.7% NaCl溶液、卡宝品红染液、1mol/L HCl、蒸馏水四实验步骤1. 三龄幼虫的培养将35对果蝇放入加有酵母菌的培养瓶中进行幼虫培养，注意亲本不可投放 过多，以控制幼虫的密度。培养基可适当降低浓度，以利于幼虫活动取食。当培 养瓶中出现幼虫后可适当追加酵母液2%4%的酵母水溶液，每天滴加1 2滴，三龄幼虫期那么滴加10%的酵母液。同时，在1518C的低温条件下培养 以延长果蝇的生活史周期，使幼虫充分生长。实验时选用行动缓慢、肥大、爬在 瓶壁上即将化蛹的三龄幼虫。2 剥离唾腺：在一干净

27、的载玻片上滴一滴生理盐水，将果蝇三龄幼虫置于载玻 片上。每只手各持一个解剖针，在解剖镜下进行操作。果蝇的唾腺位于幼虫体前 约1/3处，找到具有口器的头部有一小黑点，一手用解剖针刺入或压住 头部，将虫固定，一手用解剖针刺入体前约 1/3处，适当用力向两端迅速拉开。 唾腺是一对透明的棒状腺体，外有白色的脂肪组织不透明。去除幼虫其它组 织局部，并把唾腺周围的白色脂肪剥离干净。图6果蝇唾腺的别离操作示意图3. 染色：用滤纸条吸去多余的生理盐水，在剥净的唾腺上滴一滴1mol/L HCI解 离2 -3分钟，使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体散开。解离完毕用滤纸条吸去盐酸，滴加1滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干，

28、滴加适量的卡宝品红染液，染 色 5 10min。4. 压片：将载玻片放在实验台上，盖上盖玻片，用火柴棍或铅笔的橡皮头螺旋 形由中间向四周，轻轻敲击盖玻片，使细胞分散，染色体平展；再用滤纸覆盖在 盖玻片上，用两个拇指垂直用力按压。5. 镜检：先在低倍镜下选择唾腺细胞多且染色体分散好的视野，再换用高倍镜 仔细观察唾腺染色体的染色中心、染色体臂、横纹、蓬突 puff 等结构。五考前须知1. 在载玻片上滴加的生理盐水不要过多，否那么幼虫会漂浮而且活泼。2. 剥离唾腺后用滤纸条吸去多余的生理盐水，吸水时动作要慢，防止连同唾腺 一起吸走。3. 染色时应保持腺体一直处于染液的浸泡中，以防腺体枯燥。4. 压片

29、时用力要均匀，注意不要使盖片滑动，否那么会造成染色体的扭曲断裂六实验结果观察1 绘出你所观察到的果蝇唾腺染色体，标明染色中心和6条臂2 果蝇唾腺染色体具有哪些特点？实验六 植物有丝分裂过程中染色体行为的观察一实验目的1. 学习根尖有丝分裂制片的技术。2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，识别有丝分裂的不同时期。二实验原理有丝分裂也叫体细胞分裂。高等生物个体的生长发育是通过细胞的有丝分裂 增殖而形成的。有丝分裂中，细胞质和细胞核都发生很大变化，但最明显的是核， 特别是核内的染色体。根据细胞核分裂变化的特征，有丝分裂过程可分为间期、 前期、中期、后期、末期五个时期。两次细胞分裂之间的时期称为间

30、期。有丝分 裂的结果是产生了两个相同的子细胞，每个子细胞精确地含有和亲代细胞一样数 目的染色体，从而使遗传物质在物种内及亲子代间保持稳定。用于有丝分裂制片的组织一般是处于活泼分裂状态的动植物组织，如动物的 红骨髓、外周血细胞，植物的根尖、茎尖以及通过组织培养得到的愈伤组织等。 制片方法多采用压片法，就是将经过处理的动植物材料放在载玻片与盖玻片之 间，施加一定的压力使材料分散开来。此方法大体包括取材、预处理、固定、解 离、染色和压片几个步骤。三实验材料1 材料大蒜根尖(染色体数2n=16)2 试剂0.05%秋水仙素或0.002mol/L 8-羟基喹啉、卡诺固定液、解离液(1mol/L HCI)、

31、 卡宝品红、95%酒精、70%酒精卡诺固定液的配制：3份无水酒精参加1份冰醋酸现用现配。卡宝品红即石碳酸品红，配制方法为：配方I 石碳酸品红Carbolfuchsin,先配母液 A和B。母液A :称取3克碱性品红，溶解于100毫升的70%酒精中此液可长期 保存。母液B:取母液A 10毫升，参加90毫升的5%石碳酸水溶液2周内使用。石碳酸品红染色液：取母液 B 45毫升，参加6毫升冰醋酸和6毫升37%的 甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比拟 适宜，后来在此根底上，加以改进的配方U,称改进石碳酸品红，可以普遍应用 于植物染色体的压片技术。配方U:改进石碳酸品红取配

32、方I石碳酸品红染色液 210毫升，参加9098毫升45%的醋酸和1.8 克山梨醇sorbitol。此染色液初配好时颜色较浅，放置两周后，染色能力显著 增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。3器具显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、烧杯、火柴棍四实验步骤1 取材：将大蒜瓣掰开，大头朝下置于白瓷盘中，加上少许水，34天后根长到1cm左右，将根剪下，用蒸馏水洗几次。2. 预处理：根尖用0.05%的秋水仙素溶液或0.002mol/L 8-羟基喹啉水溶液处理 4h左右。目的是抑制纺锤丝的形成，收集更多中期分裂相，同时使染色体缩短，在细胞质内更加分散。3. 固定：预处理过的根尖用蒸馏水洗几次，在卡诺固定液中

33、固定224h，之后 用95%酒精冲洗，再转入70%酒精中，可于4C冰箱保存。固定的目的是迅速 杀死活细胞，同时使染色体的蛋白变性，保持其固有的形态。4. 解离：固定后的根尖用蒸馏水冲洗，参加解离液1mol/L HCl 于60C解离 10分钟。之后用自来水换洗3次，每次5分钟，将解离液彻底洗净。解离的目 的是将细胞分散开来，使组织软化，易于压片。5. 染色和压片：取一解离好的根尖置于载玻片间，切去根冠，从分生组织酸解后根尖顶端一小段乳白色组织中切取尽可能薄的一片，加一滴卡宝品红染液， 染色510分钟，加上盖玻片，取吸水纸覆于盖玻片左侧，左手食指中指按在此 处，右手持一火柴棍对准根尖切片敲击， 再

34、用铅笔的橡皮头将材料均匀敲散。在盖片上覆两张滤纸，以两个拇指垂直按压制片。6镜检：用低倍镜找到分裂期细胞，再转用高倍镜仔细观察。五考前须知1. 切取分生组织时要使切片尽可能薄，不要将后面分生区的细胞一同切下来, 影响分裂相细胞的寻找。2 压片材料要少，防止细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地'3. 按压制片时注意不要移动盖片。六实验结果观察1. 要求找到有丝分裂的各个时期的典型图像。2. 绘制观察到的有丝分裂各个时期的 分裂相并描述其特征。实验七 植物减数分裂过程中染色体行为的观察实验目的1. 掌握制备植物细胞减数分裂玻片标本的技术和方法。2. 观察植物花粉形成中减数分裂各个

35、时期的特征及染色体变化 二实验原理减数分裂是进行有性生殖的动植物性母细胞成熟、形成配子过程中的一种特 殊的细胞分裂方式。在减数分裂过程中，染色体复制一次，细胞连续分裂两次， 第一次分裂后染色体数目减半，第二次分裂过程中每条染色体的两条染色单体分 开，最终形成的配子中染色体数目仅为性母细胞的一半。受精时雌雄配子结合， 恢复亲代染色体数目，从而保持物种染色体数目的恒定。植物形成配子时，由花药或胚珠中的某些细胞分化为二倍性的小抱子母细胞 或大抱子母细胞，这些细胞连续进行两次细胞分裂即减数第一分裂和减数第二分 裂，结果一个小抱子母细胞形成 4个小抱子，一个大抱子母细胞形成一个大抱子， 它们都只具有单倍

36、的染色体。植物材料的减数分裂制片通常采用涂片法，制片过 程包括：取材、固定、染色及压片几个步骤。为更好地识别减数分裂的各个时期，现把减数分裂各时期的主要特点表达如 下:1间期：细胞染色质松散，核内染色较为均匀。2减数第一次分裂1前期I:持续时间较长，染色体变化较为复杂，可分为 5个时期。 细线期：染色体呈现细丝状，绕成一团，核仁明显。偶线期：同源染色体开始联会配对。粗线期：染色体逐渐缩短变粗。每条染色体已经复制，着丝粒未分开，称为 二价体。双线期：染色体更为缩短。配对的同源染色体开始互相排斥而分开， 此时可 以看到染色体的交叉现象。浓缩期终变期：染色体更为粗短，呈 V，0, 8和X形状，均匀分

37、散， 利于计数。2中期I :核膜、核仁消失，纺锤体形成，染色体排列在赤道板上，每对染色体 的着丝粒分别处在赤道板的两侧。3后期I:同源染色体分开，移向两极。由于着丝粒未分开，细胞两极的染色体 数是性母细胞的一半，每条染色体中依然含有两条染色单体。4末期I :移动到两极的染色体解旋恢复到染色质状态。核膜、核仁重新出现，细胞板形成，1个性母细胞分裂为2个子细胞。每个子细胞中含有单倍的染色体。3减数第二次分裂1前期II:与有丝分裂前期一样，每条染色体都具有两条染色单体。不同的是， 前期II的细胞仅有半数的染色体n，而有丝分裂前期，染色体数为2n。2中期II :染色体浓缩变短，着丝粒排列在赤道板上，纺

38、锤体出现。3后期II :姐妹染色体别离并移向两极。4末期II :移动到两极的染色体解旋恢复到染色质状态，核膜、核仁出现。细 胞板形成，每个细胞分为2个子细胞。经过这样的减数分裂，一个性母细胞分裂形成4个子细胞，即四分抱子，四 分抱子在花粉囊中进一步发育成为花粉粒。图7提供了玉米花粉母细胞减数分裂的过程，供大家参考。三实验材料1 .材料：大葱花蕾染色体数 2n=162器材和仪器：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、滤纸3. 试剂：卡诺氏固定液、70%酒精、卡宝品红染色液(tto Anaphusy II(m Tslophaso Hio) Thio tetrad屮)Young pcN&n grai

39、ns图7玉米花粉母细胞减数分裂过程四实验步骤1. 取材固定：选取处于减数分裂期的大葱花蕾，通常于上午 79时摘取大葱花 蕾茎顶幼小花序，放入内装有卡诺氏固定液的广口瓶中， 固定324小时，转入 70%酒精中置4C冰箱内保存。2 制片：用镊子小心拨开花药壁，挤出花粉粒，涂于载玻片上，用镊子轻轻捣 碎，用卡宝品红染色35分钟，盖上盖玻片。再把片子放在滤纸下，用拇指适 力压下，使材料分开，并把周围的染色液吸干。3镜检：先在低倍镜下找到分裂相细胞，再转用高倍镜仔细观察。五考前须知1 取材的时间及材料大小必须十分恰当，才能获得更多的花粉母细胞分裂相以 供观察。2. 不同部位花粉粒的成熟程度不同，取材时可

40、以选择不同部位的材料，以便观 察到更多的分裂相。六实验结果观察 观察减数分裂各时期染色体的特点并画图表示。实验八去壁低渗法制备植物染色体标本一实验目的1. 了解植物细胞周期中染色体的周期变化。2. 学习去壁低渗火焰枯燥法进行植物染色体制片的根本原理和方法。二实验原理植物染色体的常规压片技术在植物细胞遗传学研究中发挥了重要作用，特别是许多植物的染色体计数和组型分析都是用这种方法完成，但这种方法也存在一 定缺陷，如染色体很难完全散开，容易产生重叠、变形、断裂，影响显带结果等， 给核型分析增加了不少困难。另外，在当前植物染色体Giemsa分带研究中，出于压片法很难完全除掉细胞质及细胞壁对染色体的覆盖

41、，因而常常造成Giemsa带可重复性较低，使植物染色体 Giemsa分带研究受到一定的影响。其次，由于 植物染色体处理方法尚不理想，影响到亚显微结构的研究。因此改革植物染色体 压片法是促进植物染色体的研究，特别是植物染色体Giemsa分带和亚显微结构研究的关键。20世纪70年代以来一些从事植物染色体研究的学者，参照动物 及人类染色体标本制备技术，开展了对植物细胞去壁、低渗、火焰枯燥方法的研 究，取得了很好的结果。目前这种方法已广泛用于染色体计数、 组型分析、显带、 显微操作、原位杂交等分子细胞遗传学研究领域。三实验材料1 器具恒温培养箱、显微镜、载玻片、酒精灯。2药品对二氯苯饱和溶液、甲醇、冰

42、醋酸、70%乙醇、纤维素酶、果胶酶、Giemsa 原液、1/15mol/L 磷酸缓冲液pH 值 6.8 7.2、0.075mol/L KCI.3材料水稻Oryza sativa、玉米Zea mayS、蚕豆Vicia faba、豌豆Pisum sativum 种子或洋葱Allium cepa鳞茎。四实验步骤1. 取材：先将种子浸泡假设干小时，然后转入一垫有湿润滤纸的培养皿中，放在25C恒温培养箱中萌发，待根长至12cm取材；或鳞茎置于盛水的烧杯中，放 在25C恒温培养箱中萌发，待根尖长至 2cm左右取根尖顶端0.51cm。2. 预处理：将取下的根尖置于盛有在有 0.001%0.02%秋水仙碱或0

43、.002mol/L 8- 羟基喹啉或对二氯苯饱和水溶液的青霉素小瓶中浸泡处理。3. 前低渗：将根尖放在 0.075mol/L KCI溶液中处理30 min。4. 酶解去壁：倒去KCl溶液，用蒸馏水充分洗净。参加混合酶液纤维素酶与果 胶酶各占2.5%，25E30C下酶解23h 或37C水浴酶解45min。在酶解 过程中最好轻轻摇动瓶子，促使酶解反响更加充分。5. 后低渗：倒去酶液，用蒸馏水慢慢冲洗23次，然后在蒸馏水中停留1040min进行后低渗处理。使细胞充分膨胀，细胞内的染色体充分分散开，对以后 的染色体观察有利。6. 制备细胞悬液：低渗完毕，用滴管将水抽干净，只剩下材料，此时的根尖非常柔软

44、易散，用镊子充分捣碎材料，加上新配制的固定液，固定液的多少以使分 散的细胞充别离开材料悬在固定液中为准，用镊子搅拌，静止片刻，使大块组织沉淀，然后取上层细胞悬浮液，将上层细胞悬浮液静止2030min,已见细胞沉淀， 用吸管吸取上层清液，留约1mL细胞悬浮液制备标本。7. 标本制备：取l张预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片， 用滴管滴12滴细胞悬 浮液放于其上，立即将载玻片一端抬起，并轻轻吹气，使细胞迅速分散。然后在酒精灯火焰上微微加热烤干。8染色：Giemsa染液与1/15 mo1/L磷酸缓冲溶液pH值7.2。以20： 1混合， 分装入染色缸中，将枯燥的制片置于染液中，染色 30 min左右，自来

45、水冲洗，空 气枯燥后即可镜检。五考前须知1.在切取根尖时可将根冠一并切除，只留分生区，首先将根端部的外包皮用纱 布擦掉，可以看到泛白的根冠约 0.5mm和微泛黄的分生区5mm以内，用 刀片切下先放到培养皿中的蒸馏水中，以防止在空气中枯燥。2假设想保存根尖，在固定完毕用蒸馏水冲洗干净固定液，参加75%乙醇于4C冰箱中保存备用，用时继续下面的步骤。3 进行酶解时，酶液一定要没过材料。六实验结果观察先在低倍镜下进行观察，找到较好的中期分裂相后，直接加显微镜油并转换 为油镜头进行观察。选取分散良好、显示清晰的染色体组核型，进行拍照，用于 下一步的核型分析。七思考题绘出所观察的植物细胞中期染色体。实验九

46、植物染色体核型分析一实验目的1 了解染色体核型分析的原理及各项参数意义。2. 学习染色体核型分析的方法。二实验原理各种动植物的细胞中都有一定数目的染色体。染色体核型分析又称组型分 析，就是分析细胞中染色体的数目和形态结构特点， 并用表格、图示将这些特点 展示出来。染色体的形态以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析该时期染色体。染 色体的特征包括染色体数目、大小、着丝粒位置、副缢痕次缢痕的有无及位 置、随体的有无及形态和大小、B染色体有无及数目等。If ft. Aluff4栽"图8染色体的形态结构染色体核型反映了物种染色体水平的整体特征，研究和比拟物种的染色体核 型可以确定物种本身的遗

47、传学特征，有助于对物种的亲缘关系进行判断和分析， 揭示遗传进化的过程和机制。核型分析也是分析生物染色体数目和结构变异的基 本手段，在染色体识别与鉴定中也起着重要作用，植物细胞分类学、细胞地理学 研究也是以核型分析为根底。三实验材料1 器具：毫米尺，镊子，剪刀，计算器2 材料：黑麦、大麦、洋葱等分散良好的中期细胞显微照片四实验步骤1 测量：将洗印好的显微摄影照片上的每条染色体进行随机编号。测量每一条 染色体的总长度及长臂长度、短臂长度 单位：mm，自行制表。随体长度不计 入染色体长度，但需标注带随体染色体的编号。每条染色体的着丝粒应平分为二， 计入两臂长度之内。如果染色体弯曲不能用直尺测量时，

48、可以先用细线量取与染 色体等长的长度，再用尺子量出线的相应长度。2 计算：根据测量结果，计算出每条染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数。相对长度=每条染色体长度/总染色体长度X100 精确到0.01绝对长度值仅在某些情况下有价值，因为在染色体制片中，预处理时间、染色体浓缩程度、制片操作等都会影响绝对长度，所以，绝对长度值往往不稳定，而相对长度那么是稳定的可比拟数值。在组型研究中往往只采用相对长度。臂比值二长臂长度/短臂长度精确到0.01着丝粒指数=短臂长度/该染色体的长度X100%3. 配对：根据测量数据，比拟染色体的形状、大小、相对长度、臂比、着丝粒 指数、副缢痕的有无及位置、随体的有无等特征

49、进行同源染色体配对。 注意随体 是细胞中的某对同源染色体要么都带随体， 要么都不带随体。带随体的染色体用 SAT或星号“ *标记。4排列：将配对的染色体按由大到小的顺序进行排列并编号。对于等长的染色 体，以短臂长的在前；有特殊标记(如随体)的染色体及性染色体排在后面。排 列时，把各对染色体的着丝粒排在一条直线上。短臂在上，长臂在下。5 分类：臂比值实际上反映的是着丝粒的位置，这个位置在一条染色体中是相 对固定的，因而是描述染色体特征的最有用的指标。 现在最常用的着丝粒命名法 是Levan等(1964)提出的两点四区系统，其规定见表 4。表4臂比值与着丝粒位置的关系臂比值着丝点位置1.00正中着

50、丝粒(median point)M1.01 1.70中部着丝粒区(median region)m1.7 0 3.00近中部着丝粒区(submedian regior)sm3.01 7.00近端部着丝粒区(subterminal region)st7.00以上端部着丝粒区(terminal region)tOO端部着丝粒区(terminal point)T6剪贴：将已经粗剪过的每条染色体进行细剪，使染色体周围所留相纸相等， 假设染色体图像清晰可以不留余边，然后按排列顺序整齐地粘在白纸上。一般是白 纸上方贴一张未剪的完整照片，中间贴上已剪出且按顺序配对排列的染色体，见 表5。表5核型分析表序号相对

51、长度长臂长度短臂长度臂比值着丝粒类型1234五考前须知1 手工进行分析时注意测量前应进行染色体编号，以免造成混乱。2 实验室提供的显微照片应选用染色体数目较少，染色体较大，分散情况较好 的制片。3 进行核型分析时不要面向剪下的染色体大声说话，以免染色体被吹跑丧失。4 剪贴时，一对染色体要排列紧密，不要有间隔，而每对之间要有间隔，着丝 粒都要排列在横线上，并且排列整齐。六思考题1. 什么是核型？怎样进行核型分析？2 核型分析时，为何通常计算染色体相对长度而不是绝对长度?第二局部细胞生物学实验实验一特殊光学显微镜的原理和使用一实验目的掌握四种比拟常用的特殊光学显微镜：荧光显微镜、暗视场显微镜、倒置

52、显 微镜和相差显微镜的原理、构造和使用方法。二实验原理光学显微镜的分辨率通常为0.2卩m,这主要是由可见光的波长来决定的。 根据显微镜分辨率r 的公式：r=0.61 入 /nsin a兀照明光源的波长；n：聚光镜和物镜之间介质的折射率；a样品对物镜孔径角的半角入的最小值为400nm 紫色可见光，sin 的最大值为1,如果用空气作为聚 光镜和物镜之间的介质折射率为1,其分辨率大约为0.3 um如果用油镜作为 介质折射率为1.5,其分辨率大约为0.2 ym。所以参考人眼0.2mm的分辨率, 光学显微镜的最大放大倍数为1000倍，油镜的主要作用是提高分辨率。因此， 目前市面上所有显微镜的最大放大倍数

53、都是1000倍油镜100倍，目镜10倍。细胞生物学中常用的光学显微镜有：普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显 微镜、暗视场显微镜、倒置显微镜、激光共焦点扫描显微镜。普通光学显微镜就是我们日常实验所用的显微镜，又称为正置明视场显微 镜。“正置指的是照明系统在样本下面而成像系统在样本上面，与倒置显微镜 相区别。“明视场指的是成像时背景明亮，与暗视场显微镜相区别。下面介绍 一下几种特殊的光学显微镜。1 荧光显微镜荧光显微镜是能够观察生物样品中荧光现象的一种特殊显微镜。局部细胞 中的某些化合物，如叶绿素等，可以发出荧光，称为自发荧光。细胞中的大局部物质或结构不能发生荧光，需要用荧光染料染色后才能发出荧光

54、，称为诱发荧光， 诱发荧光是利用荧光观察细胞结构的主要方式。常用的荧光染料有吖啶橙AO,溴化乙啶EB，异硫氰基荧光素FITC, DAPI等。利用荧光现象可以观察尺度 低于普通光学显微镜分辨率的生物结构或分子组分，其原理类似于黑夜可以在飞 机上观察到发光的手电筒。例如将细胞中的某一种蛋白质蛋白质的直径为5nm左右，远远低于光学显微镜的分辨率0.2卩m进行荧光染料染色后便可以观察蛋白质在细胞中的位置。荧光显微镜的原理见图9。照明光线LIGHT SOURCE首先通过滤光片1成 为单色光激发光，经双色镜2反射到物镜objective lens 聚焦到样品object 。双色镜是一种特殊的镜片，对激发光

55、不通透但可以通透样品发出的 荧光。物镜在荧光显微镜中同时起到聚光镜将激发光聚焦的作用。样品产生 的荧光通过双色镜和目镜3成像进入人眼。因此，通过荧光显微镜观察到的图像 背景为黑色，只有发生荧光的结构才有相应的图像。LIGHTsouflce图9荧光显微镜的 原理图中显示用蓝光 作 为激发光产生绿 色 荧光，双色镜可以通 透绿光但不能通 透 蓝光荧光显微镜的特点相对于普通光学显微镜来说，荧光显微镜添加的结构主要有激 发光产生装置和双色镜。2. 暗视场显微镜暗视场显微镜的主要用途是观察颗粒性质的样品，如细菌颗粒。在普通显 微镜即明视场显微镜下观察细菌颗粒时，由于没有明显的反差而不容易看清楚。通过暗视场显微镜观察到的图像为黑暗背景，样品颗粒呈现出亮点，因此反差较 大，适于观察。暗视场显微镜的主要原理是在聚光镜(Condenser)前面加上一个圆形挡光 板(D