苏拉明联合槲皮素抑制肺腺癌小鼠移植瘤的转移

1、苏拉明联合槲皮素抑制肺腺癌小鼠移植瘤的转移【摘要】目的研究苏拉明联合槲皮素对小鼠肺腺癌转移的抑制作用。方法将40只接种高转移性的LA795肺腺癌细胞T739小鼠随机分成5组：对照组、顺柏(DDP组、柳皮素组、苏拉明组、苏拉明+柳皮素组。实验3周后，处死全部小鼠，取出双肺和剥离皮下肿瘤，计算肺转移发生率，计数各组小鼠肺表面转移结节数及算出肺表面结节转移抑制率，测量各组小鼠肺湿重。免疫组化和图像分析系统检测皮下移植瘤中微血管密度(microvesseldensity,MVD,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF的表达并定量分析。结果苏拉明组、槲

2、皮素组与对照组相比肺表面转移结节数明显下降，同时苏拉明组中肺转移发生率、皮下月中瘤内MVD、VEGF勺表达与对照组相比也明显下降，相反顺柏组对此则无明显影响。联合用药组则显著抑制肺表面转移结节数且具有协同作用。结论苏拉明和柳皮素对LA795肺腺癌的肺结节转移具有协同抑制作用，苏拉明抑制LA795肺腺癌转移与其抑制其月中瘤内VEGFg达相关。【关键词】苏拉明；槲皮素；血管生成抑制剂；肺腺癌；转移基金项目：湖南省卫生厅科研基金资助项目(C2005033)InhibitoryEffectofSuraminCombinationwithQuercetinontheMetastasisofLungAde

3、nocarcinomainMiceKeywords：Suramin;Quercetin;Angiogenesis;Lung?adencarcinoma;Metastasis目前肺癌发病率和死亡率都有明显增高趋势，腺癌为其一主要组织学类型，癌瘤内血管丰富，局部侵润和血行转移发生较早。转移是恶性肿瘤的重要特征，也是主要死因。自Folkmam1首先提出实体瘤生长需要血管生成理论后，抗血管治疗肿瘤转移也成为了当前肿瘤生物治疗的研究热点之一。本实验利用LA795肺腺癌细胞形成高转移T739小鼠皮下月中瘤转移动物复制模型2,应用具有血管生成抑制作用的苏拉明及柳皮素，以顺柏为对照，观察单独及联合用药对LA7

4、95肺腺癌肺转移的抑制作用，并探讨其作用机制。1 材料和方法1.1 实验动物、细胞株、药品及试剂T739雄性小鼠40只，鼠龄45周，均重20g左右，LA795肺腺癌荷瘤鼠两只，均由中国医学科学院肿瘤医院动物室提供(合格证号SCXK1?00?0005),南华大学月中瘤研究所提供SPF级饲养环境。顺柏购于江苏豪森药业股份有限公司，苏拉明(Suramin)及槲皮素(Quercetin)购于美国Sigma公司，VEG咙抗鼠单抗购于美国SantaCruz生物科技公司，CD34免抗鼠一抗、广谱型SP试剂盒、DABS色剂均购自福州迈新生物工程公司。1.2 动物模型的建立处死两只荷瘤鼠，剥离瘤块，研磨成匀浆液

5、，过360目钢网，生成肿瘤细胞悬液，镜下调节细胞浓度为2X106个/ml,于每只小鼠右后腿根部外侧皮下注射0.2ml瘤液，形成小鼠高转移性动物肿瘤模型。1.3 分组及用药小鼠皮下移植处均成瘤，接种4d后随机分成5组，每组8只。(1)对照组:丙二醇0.2ml+生理盐水0.2ml/只腹腔注射(iq),每天一次；(2)顺柏组：顺铝2mg/(kg?d)溶于生理盐水0.2ml中iq,于接种后第4、11、18d各一次，并予内二醇0.2ml/只每天腹腔注射一次；(3)柳皮素组：榔皮素50mg/(kgd)溶于丙二醇0.2ml中iq，每天一次；(4)苏拉明组:苏拉明10mg/(kg?d)溶于生理盐水0.2ml中

6、iq，每天一次；(5)槲皮素+苏拉明组:槲皮素及苏拉明按3、4组用药。1.4 方法与观察指标141药物对肿瘤转移的影响肿瘤接种24d处死小鼠，剥离皮下肿瘤，剖胸观察双肺表面肿瘤转移情况，计数肺表面转移结节数，肺表面结节转移抑制率=(1?用药组平均转移结节数/对照组平均转移结节数)X100%称肺湿重。肺及皮下月中瘤置入4%勺中性甲醛固定，石蜡包埋，组织切片(4小n)彳THE染色及免疫组化染色。1. 4.2移植瘤内VEGFMVD勺表达采用免疫组化SP法检测，方法步骤严格按试剂盒说明书进行(皆1：100稀释为工作液)，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。VEGF勺判定标准，月中瘤细胞浆及胞膜呈棕黄色为

7、阳性细胞，Luzex?F图像分析系统测定肿瘤组织中VEGF平均灰度值(其灰度值越低，则VEG欣达水平越高，反之亦然)，将每张切片在40倍镜下随机测10个视野，用平均灰度值评价染色强度。MV"U断标准参考Weidner等3方法。结果以±s表示。15统计处理根据数据类型分别使用组问t检验，x2检验和相关分析，用SPSS10.0软件进行统计学处理。2结果2.1移植瘤的肺转移情况各组小鼠移植瘤的肺转移发生率、肺转移结节数、肺湿重等情况，见表1。表1各组小鼠移植瘤的肺转移情况3讨论已发生转移的中、晚期肺癌疗效差。肿瘤侵袭和转移是肿瘤治疗的一大难题。本文用有血管抑制作用的苏拉明联合槲皮

8、素对肺腺癌的转移进行研究。结果显示，联合组肺表面转移结节数比其他组明显减少，有差异显著性(P<0.05),说明苏拉明和柳皮素联合应用有协同抑制转移作用。榔皮素组、DDPfi及对照组小鼠均发生肺转移，差异无显著性(P>0.05);苏拉明组6/8小鼠发生肺转移，低于对照组，而联合组5/8小鼠发生肺转移与对照组比差异有显著性(P<0.05)，进一步显示联合用药协同作用。本实验苏拉明组及槲皮素组与对照组转移率相比无显著性差异，可能是本研究样本偏少，扩大样本可能会得出阳性结果，5组肺湿重无差异显著性，可能与肺表面转移结节局部未明显生长有关，延长喂养时间，随着转移灶局部生长估计会导致各组

9、肺湿重的差异性。亦可能系转移瘤所占肺比重较小，如测转移瘤重，亦可能出现差异性，但本研究中肺脏体积小，癌结节难以剥离。体外实验证明，缺乏血管生成，月中瘤只能长到12mm3不发生转移，血管形成是肿瘤生长、侵袭、转移的基础，新生血管提供肿瘤生长所需营养，排泄代谢产物，促进血管渗漏，大量癌细胞进入血液循环，是癌细胞播散的途径。肿瘤生长和转移需要新血管持续生长4。血管形成过程的核心是血管内皮细胞增殖，VEGF®最重要的血管生长因子，是血管内皮细胞的特异性致裂原，能选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种络氨酸激酶受体，促进内皮细胞分裂，增殖和血管构建，诱导微血管生成，增加血管通透性，它还能降解血管

10、内皮细胞基质，削弱血管的屏障作用，使新生血管基底膜缺损加重，促进肿瘤的侵袭及转移5，6。本实验证实苏拉明组、柳皮素组和联合组中VEGF勺表达较又1照组及DDFffi低，有显著性差异(P<0.01),VEGF勺表达在月中瘤侵润的边缘尤为增强，且和月中瘤内MVDT一致性，说明苏拉明和槲皮素可抑制肿瘤内血管生成，切断肿瘤营养供应和肿瘤转移通道，抑制肿瘤的转移。我们同时观察到苏拉明与槲皮素联合能增强血管抑制作用，可能与槲皮素亦有抑制血管增殖的活性有关7，两者具有协同作用。结合VEGFg达灰度值和肺表面转移结节数呈负相关(r=-0.88,P<0.01),提示VEGF监测肿瘤转移的较好指标。苏

11、拉明和槲皮素可通过下调这些蛋白质表达而抑制肿瘤转移，说明抑制血管生成为苏拉明和槲皮素抑制肿瘤转移的机制之一。综上所述，苏拉明和柳皮素对LA795肺腺癌的肺转移有抑制作用，联合应用有协同作用；它们抑制LA795肺腺癌转移与其抑制月中瘤内VEGFg达相关，其具体相关机制尚需进一步探讨。参考文献1FolkmanJ.Tumorangiogenesis:therapeaticimplicationJ.NEngJMed，1971，285(20):1182?1186.2张兆伟，张金芝，孙文义，等.小鼠肺腺癌LA795细胞株的建立及一些生物学特性的研究J.中华肿瘤杂志，1985，7(2)：83?85.3Wei

12、dnerN.Tumorangiogenesis:ReviewofcurrentapplicationintumorprognosisJ.SeminDiagnPathol，1993，10(4):302?313.4KerbelRS.Tumorangiogenesis:past，presentandthenearfutureJ.Carcinogenesis，2000，21(3):505?515.5KwakBK，ShimHJ，ParkES，etal.Hepatocellularcarcinoma:correlationbetweenvascularendothelialgrowthfactorlevelanddegreeofenhancementbymultiphasecontrast?enhancedcomputedtomographyJ.InvestRadiol，2001，36(8):487?492.6YoshijiH，KuriyamaS，HicklinDJ，etal.thevascularendothelialgrowthfactorrece