病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)

1、欢迎共阅实践三病毒血凝和血凝抑制试验（以新城疫为例）实践目的：1 .掌握血凝（HAA和血凝抑制（HI）试验的原理2 .掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理： 某些病毒（如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等 ）能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞 凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。实践内容：1 .红细胞凝集试验（HA试验）主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数（抗原单位）。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。鸡新城疫病毒的 HA试验现采用微量法，在V形微量反应板上进行。-

2、I I " / ./ j f（1）首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴（25心l） o（2）用微量移液器取病毒抗原液25 a l加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25 al液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第 11孔，第11孔吸取25 al液体弃掉；病毒稀释倍数依为 1:2 1:2048 ,第12孔为红细胞对照（3）再以微量移液器每孔加1.0 %红细胞悬浮液 1滴（25 口）o,11, （4）在振荡器上振荡混匀约l2分钟，再置37 c作用15分钟后观察结果。（5）每次测定样品都应同时做红细胞对照表1鸡新城疫血凝效价（HA）的测定

3、术式（微量法）孔号12345678910 n 12弃去1%细 WW25V 25V 25 V25V 25V 25V 25V 25 V25V 25V 25V 25Vllllllllllll感作置振荡器上混匀12分钟，放37 c静置15分钟结果例示#+-#表示100%完全凝集+表示50%凝集-表示不凝集结果判定：将反应板倾斜成 45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明红细胞未被或不完全 被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使100%红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效

4、价为1:128 ,HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4 =32倍的稀释液2.红细胞凝集制试验(HI试验)有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25心1),从第1孔到第10孔。第11孔加稀释液2滴(50 1 1)(2)以微量移液器取被检血清 25心1 ,放入第1孔，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25 al液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第 10孔，最后第十孔吸取 25 al液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:21:1024 ,第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照(3

5、)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25心1)至第10孔，第11孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液(4)置振荡器上振荡12分钟后，放37 c静置20分钟(5)每孔再加入1.0 %红细胞悬浮液1滴(25心1)放振荡器上振荡12分钟混匀，置37 C, 15分钟后判定结果。表2鸡新城疫红细胞凝集抑制 (H1)试验(微量法)孔号123456789101112被检血清稀1:21:41:81:161:321:641:1211:251:511:10里脆抗原释倍数86224对口对照生理盐水25门25的25此25的25门25 口25 C25尸25此25旷V50 g 25V1被检血清25

6、 J125 11125 11125 11125 ii 125 g125 ii1 25 ii1、25 ii125 I1、125 ii111111111111弃掉4单位病毒液25 11125 g125 11125 g25 g25 g25 g 25 g 25 g 25 g 25 ii11振荡器上振荡112分钟11,放37 c作用1120分钟111111说田液 25 1125 V 25111g 25 g 2511g 25 g 2511g 25V 2511g 251g 251g 251g振荡器上振荡12分钟,放137 c作用15分钟结果例示-+#-#注：-表示不凝集、|+表示部分凝集、#表示完全凝集。表

7、明红细胞未被或不完结果判定：将反应板倾斜成 45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1:128或HI效价为7(10g2)结果分析：(1) 一般认为鸡的免疫临界水平为1:8(成年)或1:16(雏鸡)，随地区不同而稍有差异。(2)鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价

8、在1:16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。(3)鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价(log 2)的平均值表示的。如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价(log 2)为8的有3份样品，为7的有5份样品，为6的有2份样品，它们的平均值为：8X3+7X5+6X2/3+542=7.1平均水平在4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定 免疫与否。(4)大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于0.10.5 %，小

9、型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为2.0 %。(5)鸡群接种新城疫疫苗后，经23周测血清中的 HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若 HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。作业：1 .每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。! .12 .根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果3 .回答问题：(1)病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？'.J) II(2)病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？(3)病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什

10、么？实践三病毒血凝和血凝抑制试验- (以新城疫为例)(一)实践目的：1、掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理2、掌握鸡新城疫的试验室诊断技术。(二)实践内容与基本要求：实践原理：某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症等，有能凝集动物红细胞的特性，此即红细胞凝集现象。这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，发生红细胞凝集现象。可以利用这一特性判断被 检材料中有无病毒的存在，并可以测定病毒的效价。1、血凝试验：常多用感染鸡胚液进行，凝集价可达1:160-1:640 也可采用急性病例的组织浸出液，但凝集价较低。本病毒可凝集许多动物的红细胞，但凝集性能不够稳定，故通常作血凝试

11、验时都采用鸡的红细胞采血部位为心脏或翅静脉，取血后加抗凝剂或脱纤维，置于离心机中摇转加生理盐水洗涤三次后，将浓缩的红细胞配成1%生理盐水悬液，即可应用。操作方法见实习指导。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，称为该病毒的血凝滴度。2、血凝抑制试验：单纯地使用血凝试验还不能作出明确的诊断，因为还有其它病原也能引起红细胞凝集，如引起慢性呼吸道病的禽败血支原体。所以需用已知的抗血清作血凝抑制试验，以鉴别病毒。也可用已知病毒来测定病鸡血清中的抗体，而得明确的诊断。但不适于急性病例，通常要在感染后的5-10天，或出现呼吸症状后的 2天，血清中的抗体到一定水平，就可用试管法。(三)主要器材与药品器材

12、：离心机、试管架、试管、注射器、针头 5-5.5号、感染鸡胚，微量移液器1套，V型、96孔板，滴头，微量振荡器，塑料采血管，药品：病毒：鸡新城疫弱毒疫苗；0.85%生理盐水、1%红细胞浑悬液、血清、 4单位病毒。标准阳性血清；浓缩抗原；0.5%红细胞浑悬液；被检血清； pH7.07.2磷酸缓冲盐稀释液；pH7.07.2磷酸缓冲盐稀释液：氯化钠（GB1266- 77） 170g;磷酸二氢钾（GB1274 77） 13.6g ;氢氧化钠（GB629- 77）3.0g ;蒸播水1000ml;高压灭菌，4保存，使用是作 20倍稀释。鸡1%红细胞悬浮液：由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速置于装有抗凝血剂（3

13、%宁檬酸钠溶液）的离心管中，用生理盐水洗涤3次，每次以3000r/min离心10分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，根据沉淀的红细胞压积，用PH=7的生理盐水稀释成1%悬浮液。被检血清：每群鸡随机采20 30份血样，分离血清。采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至68cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端 剪去，滴融化石蜡封口，于0oC保存。（四）实践方法操作方法4.1 微量血凝试验4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液50ul ,共滴四排。.4.1.2

14、 吸取1:5稀释抗原 滴加于第一列孔，每孔 50ul ,然后由左至右顺序倍比稀释至第11歹U孔，再从第11孔各吸取50ul弃之。最后一列不加抗原作对照。I I *”, / , /4.1.3 于每孔加入 0.5%红细胞悬液 50ul。4.1.4 置微型振荡器上振荡 1分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。4.1.5 放室温下（1820oC） 3040分钟，根据血凝图象判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复，以几何平均值表示结果。4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。抗原应稀释倍数二血凝7前度/4 .（B1）上述材料全部按顺序加完后，振荡96孔

15、板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于20-22 C室温中静置，自第 15分钟开始观察结果，每 5分钟检查一次，至 60分钟结束，观察结果时注意不要摇震96孔板。如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反应者，凝集成片或碎片，呈伞状铺于管底，不凝集的红细胞沉积于管底，呈一小圆点，将板倾斜，可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动（五）结果观察：1 .首先观察对照孔，红细胞应无凝集。 I2 .观察实验孔+全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐，无红细胞沉积。+大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。+约有半数红细胞

16、凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。+只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆盘周围。-不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆盘，边缘整齐。病毒血凝呈现的不同程度凝集强度凝集效价：能使红细胞呈 +凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。 如上述第7孔为+,则该病毒悬液效价为 1: 128,即病毒稀释到1: 128时，每50 r l中含一个血凝单位的病毒 。凝集孔数越高，病毒凝集效 价越高.4单位病毒：血凝试验（HA）测出病毒的 HA价，配制成4单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻备用。病毒的血凝实验（HA）结果分析（五）

17、鸡新城疫微量血凝抑制试验5.2.1 先取稀释液50ul ,加入微量血凝板的第一孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入312孔，每孔50ul ,第二孔加浓度为 8个血凝单位的抗原 50ul。5.2.2 吸被检血清50ul于第1孔(血清对照)中，挤压混匀后吸50ul于第2孔，依次倍比稀释 至12孔，最后弃去50ul.5.2.3 置室温(18 20C)下作用20分钟.5.2.4 滴加50U10.5%红细胞悬液于各孔中，振荡混合后，室温下静置30 40分钟，判定结果5.2.5 每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照结果判定1在对照出现正确2果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度2若有10%以上的鸡出现11(log 2)以上的高血凝抑制滴度，说明鸡群已受新城疫强毒感染.3若监测鸡群的免疫水平 ，则血凝抑制滴度在4(log 2)的鸡群保护率为 50%右；在4(log 2)以下的保护率达 90%-100%;在4(log 2)以下的非免疫鸡群保护率约为9%,免疫过的鸡群约为43%.鸡群的血凝抑