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文档简介

1、原核蛋白（包涵体）表达案例原核蛋白（包涵体）表达案例1. 实验目的以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过原核蛋白表达体系获得目的蛋白A。2. 实验设计（ 1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；（ 2）选择钟鼎特色载体 pCzn1，构建表达质粒 pCzn1-A；（ 3） IPTG 诱导进行目的蛋白表达，并且优化表达条件，将诱导条件调整至 37，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式，通过Western Blot 检测蛋白 A 是否表达；（ 4）通过 Ni 柱纯化获得目的蛋白 A ，SDS-PAGE 检测纯化蛋白纯度， BSA 方法测定蛋白浓度。3. 蛋白分析（ 1）经 EditSeq 翻

2、译目的蛋白 A 序列： m.w.=23.25kd，pI=5.22（ 2）经 UniProt 匹配，蛋白 A 物种来源：人类（ 3）蛋白性质分析蛋白亲疏水分析蛋白跨膜结构域分析蛋白信号肽预测分析结果：目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列，可尝试全长表达。结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体 pCzn1 上，利用载体自带信号肽分泌表达。4. 表达载体构建4.1pCzn1-A 质粒酶切验证：酶切鉴定钟鼎特色载体 pCzn1Marker: 200,500,800,1200,2000,3000,4500Line1: 酶切前质粒Line2: 酶切后质粒基因名称： A（OD260/OD280:1.82）酶切位点： NdeI /XhoI4.2 pCzn1-A 质粒测序验证：部分序列比对结果图5. 蛋白表达及纯化蛋白表达鉴定SDS-PAGE 分析蛋白纯化 SDS-PAGE 分析M: 蛋白质分子质量标准M: 蛋白质分子质量标准1: 未诱导1: 破碎后处理样品2: 诱导后2: 流出3: 诱导破碎后上清3: 洗脱4: 诱导破碎后沉淀蛋白 Western Blot 鉴定分析M: 蛋白质分子质量标准1: 纯化后样

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