野外采样实验

1、野外取样实验方案2016041. 实验目的研究自然条件下东南景天不同生育期间，其内生菌多样性的动态变化。2. 实验设计选择在东南景天的苗期、开花期、成熟期，于浙江衢州铅锌矿山采集具有代表性5个样点的超累积生态型东南景天，混合为一个样品并将其连同根际土壤放入无菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持鲜活状态，带回实验室，然后进行后续处理。3. 实验内容（ 1） powersoil试剂盒提取根际土壤菌DNA（ 2） 可培养植物内生菌别离（ 3） CTAB法提取植物内生菌DNA（ 4） 植物重金属含量测定（ 5） 土壤理化性质测定实验一powersoil试剂盒提取根际土壤菌DNA1. 实验目的power

2、soil试剂盒提取根际土壤菌DNA,保存，待之后送检2. 实验步骤（ 1） 获取东南景天根际土壤小心把东南景天从土壤中取出，用镊子夹取粘附在根表的土壤。每个样点夹取约3g土壤，取1g立即提取DNA,余下装入封口袋，？-20C保存。取出的东南景天外表洗净，晾干。测量鲜重后，杀青，烘干。测量干重后，研磨，待测。植物重金属含量，3个重复，每个重复，共需要植物根茎叶鲜重各5g2选取MobioPowerSoilDNAIsolationKitMOBIOLaboratories,Inc,Carlsbad,CA试剂盒提取土壤样品DNA。具体操作步骤如下：1称取约0.25g土壤样品，放入研磨珠套管PowerBe

3、adTubeS,涡旋混匀。2套管中加入60屋C1容液裂解缓冲液，颠倒数次，涡旋5s混匀。3将套管放入水平涡旋振荡仪，在最大速度振荡10min。4取出套管，在室温下10000为离心30s。5把上清液约400500门转移到新的2mL离心管。6力口250屋C2容液抑制物去除液至离心管中，涡旋5s,4c下放置5min,在室温下10000为离心1min。7将上清液转移到另一新的2mL离心管，总体积不超过600gl同时防止吸出沉淀物。8加200屋C3§液抑制物去除液至离心管中，涡旋混匀，4c下放置5min,在室温下10000为离心1min。9将上清液转移到另一新的2mL离心管，总体积不超过750

4、gl同时防止吸出沉淀物。10加1.2mLC4溶液高盐溶液至离心管中，涡旋混匀，从离心管中抽取约650仙溶液至离心过滤管SpinFilter。11在室温下10000闻离心1min,取出管中过滤柱，弃去液体，过滤柱放回管中。12力口入第10步离心管中约650娼容液，重复第(11)步操作，力口入第10步离心管中剩余的溶液，重复第11步操作。13力口500屋C5§液乙醇淋洗缓冲液至离心过滤管中，在室温下10000沟离心30s,弃去管中液体。14在室温下10000为离心1min。15取出过滤柱小心放入新的2mL离心管中，防止任何C5溶液溅到过滤柱上。16加入60屋C6§液DNA洗脱液

5、或无菌超纯水至过滤柱白色薄膜中，在室温下10000/离心30s。17弃去离心柱，提取完成。分装-20保存，待下一步应用。实验二可培养内生细菌的别离纯化保存1. 实验目的1别离东南景天内生菌，记录菌落数，菌落种类数，菌落形态，优势菌菌落数。2菌落纯化，保存菌种。2. 仪器和试剂内生菌别离1需要干热灭菌的仪器培养皿150个其中在15个培养皿中放入滤纸150mL烧杯75个研砵15个（ 2） 需要高温湿热灭菌的仪器R2A培养基3000mL,分装至15个250mL三角瓶磷酸缓冲溶液150mL,至于200mL灭菌瓶试管+蒸馏水2*3*5=30支试管2000mL蒸馏水，装入1000mL三角瓶1mL枪头两盒其

6、中30个需要剪缺口锡箔纸50张（ 3） 其他试剂99%酒精、35%双氧水、3%次氯酸钠内生菌纯化保存（ 4） 要干热灭菌的仪器培养皿50个（ 5） 要高温湿热灭菌的仪器50%甘油150mL约150个菌种用量,倒入200mL灭菌瓶。150个冻存管，用保鲜袋包装。R2A固体培养基1000mL,分装至5个250mL三角瓶。R2A液体培养基1000mL,分装至50个50mL三角瓶。3.实验步骤3.1 植物样品外表消毒灭菌烧杯：15个植物样5=75个制作2000mL无菌水。分别取4g植物样在自来水下冲洗99%酒精1min35%双氧水+3%次氯酸钠30min无菌水冲洗三次。取g植物样用锡箔纸包装，做3个重

7、复，液氮速冻，-80C保存。3.2 可培养细菌的培养及纯化保存1细菌的培养基配方R2A培养基1000ml蒸储水，酵母粉、胰蛋白陈、酪蛋白氨基酸、葡萄糖、可溶性淀粉、KH2P04、MgS047H2。：、丙酮酸钠，配制R2A培养基3000mL,分装至15个250mL三角瓶，高温湿热灭菌121c,20min。2磷酸缓冲溶液灭菌处理磷酸缓冲溶液：氯化钠；2P。4；2HPO4;100ml蒸储水；PH值。配制磷酸缓冲溶液150mL，至于200mL灭菌瓶，高温湿热灭菌121c,20min。3研磨把消毒后的叶、茎和根，分别放在灭菌的研钵中，研磨成汁，加入3ml的磷酸缓冲溶液，搅拌均匀，静置10分钟，再搅拌。4

8、稀释2*3*5=30支试管从研钵中取1ml的溶液分别稀释10倍、100倍5涂布分别从原液、10倍、100倍的溶液中取200微升到细菌的培养基上培养，每个梯度做3个平行。用酒精浸泡，烧的时间长一些，叶、茎，考虑用不同的三角刮刀15个植物样*3个浓度*3个重复=135个平板6平板培养一星期后，计数，并记录其菌落形态。同时，根据菌落特征。7菌种纯化保存约50个菌种用量配制50%甘油150mL约150个菌种用量，倒入200mL灭菌瓶。准备150个冻存管，用保鲜袋包装。配制R2A固体培养基1000mL,分装至5个250mL三角瓶，配制R2A液体培养基1000mL,分装至50个50mL三角瓶。以上仪器试剂

9、使用高温湿热灭菌121c,20min。挑选不同的菌落到新的培养基，纯化1次。挑单个菌落到R2A液体培养基中，30C、160r/min,摇床12-16小时，摇到对数期或对数末期，测0D值，取700uL菌液并加300uL50%甘油于甘油管中,保存，每个菌保存3个甘油管。实验三CTAB法提取植物内生菌DNA1. 实验目的利用CTAB法提取植物内生菌DNA,保存待测。2. 实验原理十六烷基三甲基澳化钱(hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl

10、)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸别离出来。3. 实验材料实验分3批完成1液氮；2研钵6个，干热灭菌；3CTABDNA提取液：a. 100mMTris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；b. 20mMEDTA(pH8.0)螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；c. 1.4MNaCl提供一个高盐环境，使DNA蛋白复合物DNP充分溶解；d. 2%(w/v)CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于别离；e. 1%PV

11、P40,000(polyvinylpyrrolidone)(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。将上述试剂混合后，灭菌20分钟，常温保存；4酚氯仿异戊醇按照酚:氯仿:异戊醇=48:48:4的比例配置蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子外表又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RN

12、A。2.不能完全抑制RNase的活性；5) 氯仿异戊醇按照氯仿:异戊醇=96:4的比例配置。能克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚酚易溶于氯仿中；6) 异丙醇沉淀DNA；7) 70%的酒精清洗DNA；8) 2mL与1.5mL的离心管各18个，高温湿热灭菌。4. 实验步骤1收集大约100mg的植物样品，在使用前保存于-80。2将样品放于研钵中，配合液氮，快速将样品磨成粉末状，将粉末尽量收集于一个2mL的离心管中。3将步骤2中的离心管中加入0.9mLCTAB，漩涡震荡均匀，于65中水浴20-30分钟。4水浴后，加入0.9mL氯仿异戊醇，上下翻转均匀，12000

13、rpm离心8分钟。5将离心后上清液510小口转至另一干净的1.5mL离心管中，加入340L上清液体积的2/3异丙醇，上下翻转均匀至有沉淀产生，12000rpm离心8分钟。6离心后弃掉液体，用0.7mL70%的酒精清洗，12000rpm离心2分钟，小心地弃掉废液，防止将DNA倒出。7重复步骤6。8于通风橱中将酒精晾干，至透明状即可。9加入50小灰菌水或TE水pH8.0TE可延长DNA保存时间,将DNA于-20、-80长期保存。5. 注意事项：1)实验前应先预热水浴锅。3. 2)在对DNA质量要求不是特别高的情况下，用氯仿异戊醇即可，不用酚氯仿异戊醇。实验四植物重金属含量及土壤理化性质测定1. 实验目的回校后保存植物样及土壤，待后续检测。2. 实验步骤在获取根际土壤后，将取出的东南景天外表洗净，晾干。测量鲜重后，杀青，烘干。测量干重后，研磨，待测。植物重金属含量，3个重复，每个重复，共需要植物根茎叶鲜重各5g。内生菌别离试验后，取出土壤约100g,风干，研磨，过20目筛，保存待测