03细胞凝集反应及血细胞形态观察

1、<1901山东大学实验报告2018年3月26日姓名：丁志康系年级：2016级 组别：1-1科 目：细胞生物学实验题 目：细胞凝集反应及血细胞形态观察学 号：201600140055一、目的要求1、 细胞凝集反应了解细胞膜的表面结构。 掌握凝集素促使细胞凝集的原理。 学习研究细胞凝集反应的方法。2、 血细胞形态观察掌握血涂片的制备方法。 认识红细胞及各种白细胞的典型形态。 掌握人体血型（ABOffl）的检验原理与检验方法，同时了解自己的血型二、实验原理1 、 凝集反应：细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团。细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构， 脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表

2、面的分枝状糖外被。目前认为，细胞间的联系、细胞的生 长和分化、免疫反应和月中瘤发生，都和细胞表面的分枝状糖分子有关。直接凝集反应：直接凝集反应指颗粒性抗原（细菌、螺旋体和红细胞等）在适当电解质参与下 可直接与相应抗体结合出现的凝集现象。常用的凝集方法有玻片法和试管法两种。间接凝集反应：间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联在与免疫无关的、大小 合适的颗粒状载体表面，使之形成致敏颗粒，然后与相应抗体（或抗原）反应，在适宜的电解 质存在条件下，出现特异性的凝集现象，称为间接凝集反应。常用的载体颗粒有人O型红细胞、 绵羊红细胞、乳胶颗粒等。如载体颗粒是红细胞，称间接血凝试验；若为乳胶颗粒，

3、则称为乳 胶凝集试验。2 、 凝集素：凝集素是一类含糖（少数例外）并能与糖转移结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的 作用。目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种 组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。 常用的为植物凝集素，通常一起被提取的植物命名， 如伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是他们的总称。在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被（又称为糖萼）。凝集素能与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞凝集。凝集素引起的血细胞凝集， 其细胞膜结构没有发生变化，与血液凝固中发生的复杂生

4、物化学过程完全不同；另外，凝集素能 与不同的糖蛋白特异结合，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集，但是凝集素不是来源或 参与免疫反应的产物。人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征， 以及进行血型鉴定。另外，凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面展示 出了十分广阔的应用前景。而凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出 癌症相关的糖链标志物。3 土豆块茎凝集素：土豆块茎凝集素是一种能结合几丁质的富含羟脯氨酸的糖蛋白，单体分子量约50,000，包含至少三个不同的结构域，其中富含胱氨酸的区域与麦胚凝集素等几丁质结合蛋白具

5、有同源性。土豆凝集素含有50%（质量分数）的糖组分，其中90%是阿拉伯糖，另有少量半乳糖；最丰富的氨基酸是羟脯氨酸，其次是半胱氨酸。土豆凝集素在水中主要以单体形式存在，能于细胞膜寡糖链上的N-乙酰葡萄糖胺特异性结合，这是其具有凝集活性的主要原因。4 凝血因子：凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且堵塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。整个凝血过程大致上可分为两个阶段，凝血酶原的激活及凝胶状纤维蛋白的形成。凝血因子一部分由肝生成。可以为香豆素所抑制。为统一命名，世界卫生组织按其被发现的先后次序用罗马数字编号，有凝血因子I, n, m

6、, iv, v, vu, vm, ix, x, xi, xn,刈 i等。5 、 ABOa 型：ABOto型是根据红细胞膜上是否存在抗原 A与抗原B而将血液分成4种血型。红细胞上仅有抗原A 为A型，只有抗原B为B型，若同时存在A和B抗原则为AB型，这两种抗原俱无的为 。型。不同 血型的人血清中含有不同的抗体，但不含有对抗自身红细胞抗原的抗体。ABO&型鉴定主要用于临床输血，在皮肤、肾等器官移植的时候选择ABOfc型相符的供体；不孕症和新生儿溶血症病因的分析及亲子鉴定等。我国各族人民中A型、B型及。型血各占约30% AB型仅占10流右。6 血细胞：血细胞是存在于血液中的细胞，能随血液的流动

7、遍及全身。以哺乳动物来说，血球细胞主要含下列三个种类：红细胞： 红细胞也称红血球，是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介。哺乳动物成熟的红细胞是无核的，也没有线粒体，它们通过分解葡萄糖释放能量。在机体中主要起运输氧气和二氧化碳的作用。白细胞： 白细胞是一类无色球形有核的血细胞。白细胞不是一个均一的细胞群，根据其形态功能和来源部位可以分为三大类：粒细胞单核细胞和淋巴细胞，其中粒细胞又可根据胞质中颗粒的染色性质不同，分为中性粒细胞嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞三种。白细胞的主要功能是防卫作用。不同种类的白细胞以不同的方式参与机体的防御反应。血小板： 从骨髓成熟的巨

8、核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质，对机体的止血功能极为重要。血细胞约占血液容积的45%，包括红细胞白细胞和血小板。在正常生理情况下，血细胞和血小板有一定的形态结构，并有相对稳定的数量。7 各血细胞的形态： 红细胞：呈双凹圆盘状，中央较薄周缘较厚，无核或细胞器，胞质内充满血红蛋白。 血小板：血小板有质膜，没有细胞核，一般呈圆形，体积小于红细胞和白细胞，个体大小差异很大，但不是本次试验中的观察对象。 中性粒细胞：占白细胞总数的50%-70%，细胞呈球形，核的形态多样，有杆状核有分叶核，一般为2-5 叶。 噬酸性粒细胞：占白细胞总数的0.5%-3%，细胞呈球形，核常为两叶，细胞内充满粗大均匀略带折光性

9、的噬酸性颗粒，染成橘红色。 噬碱性粒细胞：占白细胞总数的0-1.5%, 细胞呈球形，核分叶或成S 形或不规则形，着色较浅；胞质内含有嗜碱性颗粒，大小不等，分布不均，染成蓝紫色，可覆盖在核上。 单核细胞：占白细胞总数的3%-8%，它是白细胞中体积最大的细胞，呈圆形或椭圆形。胞核形态多样，呈卵圆形、肾形、马蹄形或不规则性等；核常偏位，染色质着色较浅；胞质较多，呈弱嗜碱性，含有许多细小的嗜天青颗粒，使胞质染成深浅不匀的灰蓝色。 淋巴细胞：占白细胞总数的20%-30%，圆形或椭圆形，大小不等，细胞核圆形，一侧常有小凹陷，染色质致密成块状，着色深，核占细胞的大部，胞质很少，在核周成一窄缘，嗜碱性，染成蔚

10、蓝色，含少量嗜天青颗粒。三、 实验用品1、实验材料：土豆块茎、家兔。2、实验器具：酒精棉球、双凹片、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、托盘天平、滴管、离心管、离心机、注射器、取血针。3、实验试剂：抗凝血剂（枸檬酸钠盐）、PBS试剂、生理盐水、ABO血型检测试剂。实验步骤1 、 细胞凝集反应 取土豆去皮块茎2克，切碎并加10ml PBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素。 用针管抽取一定体积的抗凝剂，并使抗凝剂充分浸润针管各部以及针头。然后从兔子耳根处或心脏抽取兔子静脉血1ml,加生理盐水3ml,在1000r/min条件下，离心5分钟。重复三次离心，最后按沉淀的红细胞体积用

11、生理盐水配成1%的红细胞悬液。 在双凹片的左孔（左右可以通过贴便签来分别）滴加一滴PBSg冲液，同时在双凹片的右孔处滴加一滴土豆凝集素。 在双凹片的左右孔同时滴加一滴1%的红细胞悬液，然后使左右孔内的液体都充分混匀。左手捏住双凹片的一端，右手轻轻摇晃双凹片，使凹槽内的液体充分的混合，如此摇晃510分 钟，观察结果，并在初始时间、5min、10min时分别拍一张照片作为记录。 在观察到细胞凝集后用滴管吸取少许细胞悬液，滴在载玻片上，可根据悬液浓度用生理盐水进行一定程度的稀释，之后在显微镜下观察并拍照。2 、 血涂片的制作和观察 用取血针在兔耳耳根静脉处轻扎一小孔，右手持一载玻片蘸取少许小孔处流出

12、的兔血。 左手持另一洁净载玻片（虎口张开，用拇指和食指中指掐住载玻片两头），右手持蘸有兔血的载玻片呈大约30°锐角在左手所持载玻片的表面上涂出一道血膜，静置干燥。 涂片干燥完成后置于染色架上，滴加瑞氏染液，用染液将血膜表面覆盖，染色一分钟后，再加等量的缓冲液与染色液上，浸染58min， 此时涂片表面呈现一层古铜色。用蒸馏水迅速冲洗，见涂片呈粉红色后自然晾干，即完成血涂片染色。 在显微镜下观察血涂片，找到血液中几种较为典型的血细胞，拍照记录。3、ABO&型的检测 取一块洁净载玻片，在载玻片左右两边分别第一滴抗A 凝集素试剂和抗B 凝集素试剂。 用取血针在中指扎一小孔，用两支洁净

13、的各吸取少量血液，加入载玻片上的两滴试剂中。 用手不断摇晃载玻片，大约10min 后通过观察两滴试剂中血液的状态判断血液来源者的血型。五、 实验结果1、 细胞凝集反应兔红细胞在加有土豆块茎凝集素的凹槽中发生凝集，在白色纸张背景下，约7 min 时可清晰看到液滴中出现红色沙状细胞凝集颗粒，以下附上实验开始时、开始5min、 10min、 16min 后的试验照片，以及试验开始时及结束时（16min）的左右对比图：图1初始时兔红细胞悬液图2反应5 min后兔红细胞悬液图3反应10 min后兔红细胞悬液图4反应16 min后兔红细胞悬液图5反应初始时刻兔红细胞悬液对比图（左加缓冲液，右加土豆块茎凝集

14、素）图6反应16min时兔红细胞悬液对比图（左加缓冲液，右加土豆块茎凝集素）图7显微镜下兔红细胞凝集颗粒照片（4X 10）图8显微镜下兔红细胞凝集颗粒照片（4X40）结果叙述：兔红细胞悬液在加入土豆块茎凝集素并不断摇晃后逐渐凝集，血浆透明度逐渐升高，悬液中红色 逐渐由氤氤雾状变为细沙粒状，7min时在白色纸张背景下可以看到细小红色颗粒随摇晃动作而晃 动，之后颗粒感逐渐增强，至16min可清晰看到细小粉粒状红细胞凝集粒（如图 4,6）。显微镜下既可以看到零散的红细胞，又可以看到更多的以类似于叶绿体类囊体状态堆叠起来的红 细胞凝集颗粒（如图7,8）,凝集程度不等，2到数十枚红细胞凝集，图中状态为稀

15、释五倍后的结 果，且避开了中央红细胞团粒堆积位置。2、 血涂片的制作和观察显微镜下可以看到棕色微紫的红细胞，紫色与红细胞大小相近的淋巴细胞，以及紫色比红细胞更大的 粒细胞和单核细胞，以下为显微摄影照片：图9红细胞（4X40）图10单核细胞（4X40）图11淋巴细胞（4X40）图12中性粒细胞（4X40）图13噬酸性粒细胞（4X40,图片来源于娄皓宁）图14噬碱性粒细胞（4X40,图片来源于娄皓宁）结果叙述： 红细胞在显微镜下呈棕带紫色，周缘色深而中央色浅，整体呈圆饼状。 单核细胞圆形，比红细胞大，核圆形或椭圆形或肾形或不规则性，胞质较多且色浅，几乎透明， 核紫色，偏位。 淋巴细胞与红细胞大小相

16、近或略大于红细胞，核占细胞比重大，呈紫色，染色较为均匀，观察有 致密感，胞质极少，显微镜下只能观察到一透明窄带环绕在紫色细胞核周围。中性粒细胞比红细胞大，基本与单核细胞大小相似，棕紫色或紫色，染色通常不均匀，紫色有深 有浅，形成斑纹状，且细胞周缘通常无明显透明带，可通过此点与单核细胞相区分。 嗜酸性粒细胞大小与中性粒细胞相似，细胞内通常有许多十分明显的橘色或紫红色颗粒，通常比 嗜天青颗粒大，有一定的折光性。 嗜碱性粒细胞大小也与中性粒细胞相似，细胞内分布有大小不等、被染成棕紫色或蓝紫色的嗜碱 性颗粒，细胞整体观察颜色不均匀。3、 ABO1J1型的检测载玻片的左侧滴有含抗 A凝集素的试剂，右侧滴

17、有含抗 B凝集素的试剂，观察到左侧出现细胞凝集反 应，右侧没有发生，则血液红细胞膜上含有 A抗原而无B抗原，进而推理出血样来源者是 A型血。图15血性检测试验结果（A型，血样来源于他人）K、注意事项1、取兔血之前应用注射器提前吸取一定量的抗凝血剂，并在抽血前用抗凝血剂充分湿润针头，以防 吸取的兔血凝结，导致针头堵塞。2、抽血前应将针头旋转至斜面与刻度同向，抽血时斜口朝上，呈约30。锐角刺入血管，刺入时应用食指扶住针头，缓慢但稳定的刺入，不能突然猛地插入，以防刺穿静脉。3、制作血涂片时不要蘸取太多兔血，涂片时也不宜角度太高，以防涂片太厚，妨碍到之后显微镜下 的观察。4、染色时要注意时间，防止染色

18、时间过长过短影响实验结果，且染色前应等至涂片干燥后再进行。5、在进行兔红细胞凝集反应时摇晃过程中一定不能让两滴液体接触，否则会导致实验结果不明显， 或者与实验预期结果不同。6、在观察细胞凝集反应的实验结果时最好在白色纸张背景下观察，以提高观察灵敏度。7、在显微镜下观察红细胞凝集颗粒时一来要注意稀释倍数，防止视野内血球数目过密影响观察，二 来要注意液滴厚度，如果液滴太厚应用滴管移除部分，防止液滴过厚显微镜下观察时沾染在镜头 上污染镜头。七、思考与讨论1、 在制作血涂片时如果用力太轻会导致涂片过厚，但如果用力太重则容易导致细胞破裂，使观察 结果一片模糊。且制作血涂片时蘸取的血细胞是十分足够的，没有必要蘸太多兔血，这样反而容 易导致涂片过厚。以少许兔血涂出渐渐变薄的舌形血膜为最佳。2、 在进行细胞凝集反应的摇晃步骤时，如果先前滴加的溶液太多可以在摇晃前或中