10bap31一种新的肿瘤睾丸抗原发现及功能研究

1、第四博士BAP31，一种新的肿瘤/抗原的发现及功能研究姓名：宋朝君申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：金伯泉20070501第四博士英 文 缩 写英文缩写英文全称中文全称BAPBcellreceptorassociatedB 细胞受体相关蛋白proteinBAP31BcellreceptorassociatedB 细胞受体相关蛋白 31protein 31B cell receptorBCRCaspaseB 细胞受体天冬氨酸特异性半胱氨Cysteinylproteaseaspartate-specific酸蛋白酶CD CRI CTA DDdsRNA ERHCDMcluster of dif

2、ferentiationCancer Research Institute分化群美国肿瘤cancer/antigen肿瘤/差异显示抗原different display double-stranded RNAendoplasmic reticulum双链 RNA内质网humancellmoleculedifferentiation人类细胞分化LCLDAliquid chromatography液相色谱leukocyteantigendifferentiation白细胞分化抗原LICRLudwig Institute for Researchmonoclonal antibodyCancer路德

3、维格mAb单克隆抗体博士：宋朝君导师：金伯泉教授1第四博士MMMPSSmultiple myeloma massivelyparallel sequencing messenger RNA Mass spectrum representational analysisRNA interference多发性骨髓瘤signature大规模平行信号mRNA MSRDA信使 RNA质谱分析difference代表性差异分析RNAiSADARNA细胞特异性 mAb 筛选 CTA 的方法spermatogeniccellsspecificmonoclonalcancer/antibody-definedS

4、AGEserialanalysisofgene表达连续性分析expressionserological analysis of expression libraries small interference RNA tumor associated antigen tumor specific antigenSEREXcDNAcDNA 表达文库的血清学筛选分析技术siRNA TAATSA小干扰 RNA肿瘤相关抗原肿瘤特异性抗原博士：宋朝君导师：金伯泉教授2第四博士BAP31，一种新的肿瘤/抗原的发现及功能研究博士宋朝君导师金伯泉教授第四免疫学教研室陕西西安710032二零零七年五月中要肿瘤抗原

5、是指细胞过程中出现的新抗原及过度表达的抗原物质的总称，不仅能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答，而且还可以应用于肿瘤的免疫学诊断和靶向性免疫治疗。肿瘤/CTA)属肿瘤抗原的一类，迄今为止已命名了 46 个抗原(cancer/antigen,共编码 91 个不同的转录子。在正常组织中仅限制性表达于，其他正常组织不表达，而在某些肿瘤组织中可有明显的表达，相当一部分 CTA 在肿瘤患者体内具有免疫原性，可诱导机体产生体液免疫和/或细胞免疫。正是由于这些特点，CTA 已成为肿瘤免疫治疗的重要候选，为制订肿瘤免疫新的策略提供了新的概念和思考。尽管目前已经有许多 CTA 被陆续鉴定出来，但可以应用于肿瘤

6、的博士：宋朝君导师：金伯泉教授3第四博士构建及靶向治疗的 CTA 还十分有限。在鉴定 CTA 的诸多方法中，无论是免疫学方法和还是表达分析法均有一定的局限性。因此，急需有更加有效的方法来筛选新的 CTA。基于 CTA 限制性表达于组织的特点，本文设计了一种新的筛选策略，命名为细胞特异性单抗筛选CTA 的方法(spermatogenic cells specificmonoclonal antibody-defined cancer/免疫小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术, SADA)，即以人细胞单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)，免疫组化法筛选出细胞特异性 mAb，在蛋白水

7、平上研究其在肿瘤组织和其他正常组织的表达分布规律，在此基础上，选择具有 CTA 表达规律的 mAb，通过质谱分析技术鉴定 mAb 识别的 CTA，为肿瘤计及肿瘤的靶向治疗提供新的策略。的设通过 SADA 方法，我们筛选出了 19 种候选，在组织中的染色结果不尽相同，其中 5 株 mAb 具有 CTA 样的表达分布规律。另外，我们还筛选到了一些特异表达于过程不同阶段的 mAb，如于过程的早期、中期或晚期，这些抗体所识别的可能在发生过程中发挥着重要功能，所以，这些抗体的获得也将为生殖科学的研究提供的工具。质谱技术是当前研究蛋白质的重要，以抗体进行免疫沉淀后再行质谱分析是分离和鉴定蛋白质最常用到的方

8、法。我们先期选择了 4 株 IgG1 亚类的抗 CTA 的 mAb 进行鉴定，既 FM-1、FM-5、FM-6 和 FM-18。免疫细胞化学结果显示，这 4 株 mAb 宫颈癌细胞系 Hela 细胞上均有表达，所以选择此细胞进行免疫沉淀。FM-1 和 FM-5 均能从细胞裂解液中纯化出目的条带，质谱分析结果显示，FM-1 识别的确定为 BAP31，而 FM-5尚未能测出结果，推测可能是样品绝对量不足或纯度不够，需进一步博士：宋朝君导师：金伯泉教授4第四博士优化实验条件后再度送检。BAP31最初由Kim等人于 1994 年鉴定，除去在BCR的活化过程中起作用外，BAP31 还可作为载体蛋白介导包

9、括MHC-在内的多种蛋白从内质网到高尔基体的转运。同时，BAP31 还是一种BCL-2/BCL-XL相关蛋白，可作为凋亡调节因子参与细胞凋亡过程的调节。应用免疫组织化学染色的方法，我们首次发现BAP31高表达于组织，阳性产物主要定位于细胞和初级细胞，说明该可能参与了发生过程。我们还选择了 8 种肿瘤组织(宫颈癌、癌、食道癌、肝癌、结肠癌、直肠癌和肺癌组织)研究该的表达规律，结果显示，在所研究的所有肿瘤组织类型中均见高水平表达，阳性率在 58.0%87.5%之间，阳性产物主要于胞浆。由于完整的BAP31可以和BCL-2/BCL-XL形成复合物，发挥抗细胞凋亡活性，所以，BAP31 的高表达可能会

10、使肿瘤细胞凋亡减少从而参与肿瘤的发生发展，这也需要进一步的实验证实。由于 BAP31 在除以外的正常组织中表达水平较低，而在组织和多种肿瘤组织中高表达，这一分布特点与 CTA 非常相似。其Xq28，与 MAGE-A、NY-ESO-1、LAGE-1、SAGE 等 CTA 编码于毗邻，因此，我们把 BAP31 定义为 CTA中的一个新成员。深入研究其功能可能会为肿瘤的免疫治疗或靶向治疗提供新的思路。以RNAi为工具，本文研究了拆除BAP31表达后对Hela细胞的增殖、细胞周期、体外侵袭能力及对化疗的耐药性的影响。结果显示，BAP31表达下调后细胞增殖速度减慢，细胞出现G1期阻滞且侵袭能力明显下降，

11、并且对化疗诱导的凋亡的敏感性增加。因BAP31 参与众多蛋白的转运过程，这中间可能包括一些与细胞增殖、细胞周期和侵袭相关的蛋白，可能导致功能蛋白在内质网的滞留从而影响细胞的生物学行为。此外，博士：宋朝君导师：金伯泉教授5第四博士BAP31 还可使PTPLB(protein tyrosine phosphatase-like B)免受降解，后者可作为一种磷酸化调节因子，调节细胞内重要蛋白的磷酸化水平，进而使细胞的生物学行为发生改变。CD在血细胞的分化、增殖、活化、迁移以及机体防御性免疫应答、炎症、细胞凋亡、自身免疫和发生等许多生理和病理过程中发挥重要的作用。随着人类功能组计划研究的深入以及免疫学

12、同其他学科的交叉，CD的概念逐渐被人类细胞分化(human cell differentiationmolecule, HCDM)所替代。由于发生的过程也是细胞、分化直至成过程，所以，某些 CD/HCDM也可能会参与的发生。研究 CD在组织中的表达分布情况有助于深入理解的发生机制，并有可能在已鉴定的 CD中发现新的 CTA 候选。应用免疫组织化学染色技术，本文研究了 29 个 CD在人组织中的表达分布规律，结果显示有 15 个在的关注。组织中有表达，其中 CD326 表达趋势引起了我们CD326 即上皮细胞黏附(Ep-CAM)，主要表达于上皮细胞表面，上皮细胞源性肿瘤细胞表达升高。CD326

13、在组织中表达于细胞和少数初级细胞，于细胞膜，可能在细胞间的黏附中起作用。CD326 表达趋势类似于广泛表达的 CT，如 IL13Ra/CT19、TSP50/CT20、SPA-17/CT22、OY-TES-1/CT23 和 PLU-1/CT31 等，在大多数非生殖组织中可见表达，组织和肿瘤组织中高表达，因此，CD326 可能成为 CTA 家族的一个新成员。：细胞；肿瘤；CTA；mAb；质谱分析；BAP31；RNA；CD博士：宋朝君导师：金伯泉教授6第四博士The Discovery And Function Study of BAP31,A Newly Defined Cancer/Antige

14、nPostgraduateChaojun SongSupervisorProf. Boquan JinDepartment of Immunology, Fourth Military Medical University, Xian, Shaanxi 710032May 2007AbstractsTumorrefer to the neoand/or the over-expressedinduce specific humoral and/or cellularduring the tumorigenesis, which canimmune response in human. More

15、over, thesecan be used as eithermarkers of tumor or targets for immunotherapy. Cancer/(CTA)consist a subpopulation of tumor. Up to now 46 gene families with total91 members ofrestricted tohave been found. In general, the expression ofisin normal tissue, while the expression ofis significantlyup-regu

16、lated in various cancer tissues. Someand/or cellular immune responses in human. Thus,can induce specific humoralhave been thought aspotential targets for the immunotherapy of cancer patients.博士：宋朝君导师：金伯泉教授7第四博士Although more and morehave been discovered, few of them can be usedas ideal targets for ca

17、ncer immunotherapy. There are limits in the methodsestablished for identifying new technology for discovering unknownConsidering the unique expressing. So, its necessary for searching new.pattern of, that is, restricted tospermatogenic cells of human, we developed a new method to discoveringunknown,

18、namedasspermatogeniccellsspecificmonoclonalantibody-defined cancer/(SADA). Firstly, we immunize BALA/cmice using human spermatogenic cells, then raise mAbs against spermatogeniccells using hybridomics. The expressing patterns of positive inandnegative in other tissues were identified by newly develo

19、ped mAbs and immunohistochemical staining. The mAbs which have CTA-like expressingpatterns were selected and used for immunoprecipitation of the correspondingmolecules. Finally, new candidates for newwere determined based on theresults from liquid chromatography-Mass spectrum/Mass spectrum (LC-MS/MS

20、) assay.In our experiment, 19 candidates were discovered using the newly establishedSADA method and 5 of them had expression patterns similar with that of.In addition, we raised some mAbs that recognize cells in different stages of spermatogenesis. The molecules recognized by these mAbs may play imp

21、ortant roles in spermatogenesis and these mAbs may be useful in the research on spermatogenesis.LC-MS/MS analysis is an important tool for identifying proteins. We choose 4CTA-like mAbs, FM-1、FM-5、FM-6 and FM-18 for further identification. The博士：宋朝君导师：金伯泉教授8第四博士results from immunocytochemistry stain

22、ing showed that Hela cells expressed allthemoleculesrecognizedbythesemAbs.Soweperformedimmunoprecipitation using FM-1, FM-5, FM-6 or FM-18 and Hela cells lysate and purifacation of the corresponding molecules recognized by these mAbs. FM-1 and FM-5 could be used in immunoprecipitation and LC-MS/MS a

23、ssay showed that the molecule recognized by FM-1 is BAP31.BAP31, an evolutionarily conserved and ubiquitously expressed 28-kDa polytopic integral protein, was originally described as contributing to B-cell receptor activation. Its location in the ER, however, argued that its contribution to this act

24、ivation might arise indirectly through an involvement in the egress of membrane-integrated protein complexes from this organelle. Consistent with this, BAP31 has been implicated in export of major histocompatibility complex class(MHC-) molecules from the ER and in the control of maturation ortraffic

25、king of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. In additionto its predicted role in regulating egress of membrane complexes from the ER, BAP31 is a BCL-2/BCL-XL-associated protein and plays an important role in apoptosis, both as a regulator of procaspase-8L processing and as a cleavage

26、 target of caspase-8. Using immunohistochemical staining, we found high-levelexpression of BAP31 in human, mainly localized in spermatogonia andprimary spermatocyte, indicating that BAP31 may play a role in spermatogenesis. Moreover, expression of BAP31 is dramatically up-regulated in various carcin

27、omas, including carcinomas of esophagus, colon, rectum, lung,breast, cervix, ovary and liver.The expression pattern of BAP31 is similar to that of, that is, the博士：宋朝君导师：金伯泉教授9第四博士expression level of BAP31 is much lower in normal tissues than that inand tumor tissues. Considering that the chromosomal

28、 localization of BAP31 is Xq28, adjacent to various CTA genes including MAGE-A, NY-ESO-1, LAGE-1and SAGE, we designate BAP31 as a new member of.Furthermore, we investigated the influence of BAP31 on cell cycle and biological functions in Hela cells. Flow cytometry analysis detected a constant increa

29、se in G1 DNA content in comparison with the control group. The percentage of cell DNA in replication phase S and division phase G2 are also decreased significantly. These data suggest that depletion of BAP31 could lead to an arrest of cells in G1 phase, a delayed transition into S phase, and eventua

30、lly restrained proliferation of cells. Also, BAP31 depletion caused a significant decrease in the number of migrating cells relative to control transfected cells, indicating that BAP31 is essential for typical tumorigenic properties of cancerous cells. Moreover, down-regulation of BAP31 sensitizes c

31、ells to chemotherapeutic drugs-induced apoptosis. Acting as molecular chaperone, loss of BAP31 may cause retention of important proteins in the ER and in turn, cause changes in cell proliferation, cell cycle, etc. It has been known that BAP31 could interact with protein tyrosine phosphatase-like B (

32、PTPLB), a novel member of the PTPL family, which may have a regulatory function in the aspects of coordinating ER dynamics and ER transitions during the cell cycle.CD molecules play central biological roles in hematopoietic cell differentiation,proliferation, activation and migration as well as host

33、 defense, inflammation,apoptosis, autoimmuand organogenesis. With rapid development of genomeproject, the concept of CD is replaced by human cell differentiation molecule博士：宋朝君导师：金伯泉教授10第四博士(HCDM).Becausespermatogenesisisthedifferentiationprogressofspermatogonia, some CD/HCDM may participate in the

34、spermatogenesis.Studying the expression patterns of CD molecules in humanmay furtherour understanding of the mechanism of spermatogenesis, and even more, wemay find new CTA candidates in CD molecules. We investigate the expressionpatterns of 29 CD molecules in humanand found that 15 of them areposit

35、ive in. Among them the expression pattern of CD326 is quite unique.CD326 is epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM), mainly expressed onepithelial cells and its expression is highly up-regulated in epithelial cell derivedcarcinomas. In human, CD326 mainly localized on the membrane ofspermatogonia

36、 and some primary spermatocytes, indicating that it may play a role in spermatogenesis. The expression pattern of CD326 is much like the ubiquitously expressed CT molecules such as IL13Ra/CT19, TSP50/CT20,SPA-17/CT22, OY-TES-1/CT23 and PLU-1/CT31. It is resonable that CD326may be a candidate for.Key

37、words: spermatogenic cells; tumor; CTA; mAb; mass spectrum; BAP31; RNAinterference; CD molecules博士：宋朝君导师：金伯泉教授11第四博士前言肿瘤抗原是指细胞过程中出现的新抗原及过度表达的抗原物质的总称，不仅能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答，而且还可以应用于肿瘤的免疫学诊断和靶向性免疫治疗。CTA 属肿瘤抗原的一类，迄今为止已命名了 46 个共编码 91 个不同的转录子。相当一部分 CTA 在肿瘤患者体内具有免疫原性，可诱导机体产生体液免疫和/或细胞免疫。正是由于这些特点，CTA 已成为肿瘤免疫

38、治疗的重要候选免疫新的策略提供了新的概念和思考。，为制订肿瘤基于 CTA 限制性表达于组织的特点，本文设计了一种新的筛选策略，命名为细胞特异性 mAb 筛选 CTA 的方法(SADA)，并通过 SADA方法，我们筛选出了 19 种候选，其中 5 株 mAb 具有 CTA 样的表达分布规律。我们先期选择了4 株IgG1 亚类的抗CTA 的mAb 进行鉴定，即FM-1、FM-5、FM-6 和 FM-18，用 Hela 细胞裂解物进行免疫沉淀，结果显示，FM-1和 FM-5 均能从细胞裂解液中纯化出目的条带，质谱分析结果显示，FM-1 识别的确定为 BAP31，而 FM-5 尚未能测出结果，需进一步

39、优化实验条件后再度送检。应用免疫组织化学染色的方法，我们首次发现 BAP31高表达于睾丸组织，阳性产物主要于细胞和初级细胞，说明该可能参与了发生过程。我们还选择了多种肿瘤组织，研究该的表达规律，结果显示，在所研究的所有肿瘤组织类型中均见高水平表达，阳性率在 58.0%87.5%之间，阳性产物主要外的正常组织中表达水平较低，而在于胞浆。由于 BAP31 在除以组织和多种肿瘤组织中高表达，博士：宋朝君导师：金伯泉教授12第四博士这一分布特点与 CTA 非常相似。其NY-ESO-1、LAGE-1、SAGE 等 CTA 编码于 Xq28，与 MAGE-A、毗邻。有鉴于此，我们把 BAP31定义为 CT

40、A中的一个新成员。深入研究其功能可能会为肿瘤的免疫治疗或靶向治疗提供新的思路。以RNAi为工具，本文研究了拆除BAP31表达后对Hela细胞的增殖、细胞周期、体外侵袭能力及对化疗的耐药性的影响。结果显示，BAP31表达下调后细胞增殖速度减慢，细胞出现G1期阻滞且侵袭能力明显下降，并且对化疗诱导的凋亡的敏感性增加。CD在血细胞的分化、增殖、活化、迁移以及机体防御性免疫应答、炎症、细胞凋亡、自身免疫和发生等许多生理和病理过程中发挥重要的作用。某些 CD/HCDM也可能会参与的发生。研究 CD在组织中的表达分布情况有助于深入理解的发生机制，并有可能在已鉴定的 CD中发现新的 CTA 候选。本文研究了

41、 29 个 CD在人组织中的表达分布规律，结果显示有 15 个在组织中有表达，9个 CD可能参与发育过程，1 个可能成为 CTA 候选(CD326)。CD326即上皮细胞黏附(Ep-CAM)，主要表达于上皮细胞表面，上皮细胞源性肿瘤细胞表达升高。CD326表达趋势类似于广泛表达的CT，如IL13Ra/CT19、TSP50/CT20、SPA-17/CT22、OY-TES-1/CT23和PLU-1/CT31等，在大多数非生殖组织中可见表达，组织和肿瘤组织中高表达，因此，CD326可能成为CTA的一个新成员。博士：宋朝君导师：金伯泉教授13第四博士文献 回 顾第一部分肿瘤抗原研究进展早在两个世纪以前

42、，有人就提出了用肿瘤来治疗人类肿瘤的想法。但因长期以来一直无法在肿瘤细胞上找到肿瘤特异性的抗而进展缓慢。从 20 世纪 80 年始，各种不同的肿瘤抗原鉴定方法相继得以建立。一系列肿瘤抗原的发现和鉴定为肿瘤主动免疫治疗和靶向治疗的发展奠定了基础。肿瘤抗原是指细胞过程中出现的新抗原及过度表达的抗原物质的总称，不仅能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答，而且还可以应用于肿瘤的免疫学诊断和靶向性免疫治疗。目前认为肿瘤抗原产生的机制主要有六个方面：细胞过程中了新的蛋白质；由于突变或重排等使正常蛋白质的结构发生改变；由于糖基化等导致异常的细胞的特殊降解产物；正常情况下处于隐蔽状态下的抗原表位的；多种膜蛋白

43、的异常以及胚胎抗原或分化抗原的异常表达。根据肿瘤抗原的特异性可分为肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen, TSA)和肿瘤相关抗原(tumor associated antigen, TAA)，前者是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原，后者是指肿瘤细胞和正常细胞均可表达的抗原，只是其含量在细胞时明显增高。随着一系列鉴定新的 TSA 和 TAA 方法的建立，越来越多的肿瘤被鉴定出来，为肿瘤的免疫治疗和靶向治疗创造了有利条件。1 肿瘤抗原的鉴定方法1.1 T 细胞表位克隆技术(T cell epitope cloning)博士：宋朝君导师：金伯泉教

44、授14第四博士1991 年Boon小组创立了利用体外特异性CTL克隆筛选人类肿瘤抗原的方法，在此基础上发现了MAGE-1、酪氨酸酶等肿瘤抗原1。利用此方法， 一系列的肿瘤抗原如MAGE、BAGE、CAGE、RAGE、LAGE、DAM、MART-1、CDK-4、酪氨酸酶、-链素等相继被发现并得到确认。因为利用现有技术获得特异性CD8+ T细胞和建立黑色素瘤细胞株相对容易，目前利用此方法鉴定的肿瘤抗原主要为黑色素瘤抗原。利用该法只鉴定出为数不多的非黑色素瘤肿瘤抗原如肾细胞癌肿瘤抗原、肺癌肿瘤抗原2,3 。CTL筛选法有许多不足4：(1)不能用于鉴定常见的上皮性肿瘤如和结肠癌的肿瘤抗原；(2)需要建

45、立自体靶细胞株和分离肿瘤特异性CTL；(3)与建立稳定的黑色素瘤株率可达 30相比，在许多肿瘤类型(如；(4)在体外，某些类型肿瘤对CTL不敏感。)中建立肿瘤细胞株非常1.2 多肽洗脱法多肽洗脱法(peptide elute methods)是用生物化学的洗脱肿瘤细胞表面或 MHC上结合的、可以引起肿瘤特异性 T 细胞应答的肿瘤抗原肽，洗脱得到的微量抗原肽用质谱分析技术确定其氨基酸组成，通过检索数据库可鉴定出相应的肿瘤抗原。利用该法已筛选出许多肿瘤抗原， 如gp100、MART-1、酪氨酸酶、人肺肉瘤突变延长因子 2、小鼠结肠癌细胞株CT26 内源性 MULV 、gp70、突变 RNA 螺旋酶

46、、UV 诱导逆转物 gp10 等5。多肽洗脱法虽可获得肿瘤抗原的天然多肽，但其对仪器水平要求高，技术难度大，故应用范围相对较小。随着高灵敏度质谱议的问世和逐渐普及，此项技术还有相当的发展空间。1.3 表位表位法法(epitope prediction methods)，通常又称为“逆向免疫学” 方法，用于鉴定肿瘤细胞内呈特异性过度表达的某蛋白质是否为肿瘤抗原原博士：宋朝君导师：金伯泉教授15第四博士理是根据相应蛋白质来源的多肽和 MHC 结合力来筛选特定 T 细胞的候选多肽表位，并且利用多肽特异性 T 细胞来确定其免疫原性。大多数情况下，选择 MHC-类限制性候选表位在体外诱导产生特异性 CT

47、L，然后评价该 CTL 对表达相应 MHC 等位方法的优点是利用正常人而不是肿瘤的抗原阳性肿瘤细胞的作用。该的 T 细胞作为筛选工具，所以可能发现新的 CTL 表位。随着肿瘤组学研究的日益深人，表位法在筛选肿瘤抗原中用途越来越广。其基本流程是：(1)利用肿瘤细胞和正常细胞的表达图谱不同，筛选出肿瘤过度表达；(2)利用检索数据库或实验的方法确定候选在肿瘤发生中的作用；(3)利用 Internet 上多肽和 MHC I 类结合力的数据库(如 SYFPEITHI、SEREX 数据库)在候选基因表达的蛋白质中和 MHC- 类抗原在蛋白酶体中的结合的免疫表位； (4) 在过程；(5)验证抗原SYFPEI

48、THI 数据库中过程， 但目前对验证抗原关键步骤尚缺乏金标准；(6)验证候选多肽和MHC-类MHC-类形成的复合物的稳定性；(7)确定候选多肽抗原递呈过程中的约束性；(8)观察该候选表位能否诱导出特异性 CTL。通过表位法已经鉴定出许多 T 细胞表位，如蛋白酶 3、p53、BCR-ABL 融合蛋白、WilmS 瘤抗原、CEA、PSA、HER2/neu、粘蛋白 1、叶酸结合蛋白、Survivin、Ig 独特型和端粒酶催化亚基6。在有些情况下， 由于突变、蛋白融合或重组，推测出的抗原表位具有肿瘤特异性。1.4 cDNA 表达文库的血清学筛选分析技术(SEREX)：SEREX(serological

49、 analysis of cDNA expression libraries)是一种将血清学分析和重组技术有机结合以筛选肿瘤抗原的技术。该方法利用 cDNA重组文库检测可在肿瘤患者体内产生高滴度抗体的肿瘤抗原，为临床肿瘤标志物的筛选、鉴定及肿瘤的发展和应用提供了重要的技术平台。人 B博士：宋朝君导师：金伯泉教授16第四博士细胞可以识别自身肿瘤抗原，且部分可以诱导产生高滴度抗体，而 cDNA文库的建立，使抗原的浓度大大增加，解决了以往肿瘤抗原抗体反应中的关键问题，SEREX 技术正是建立在这一理论基础上。SEREX 技术是一种快速、简便、直接的肿瘤抗原鉴定方法，已经证明采用 SEREX 技术筛选

50、出的肿瘤抗原(如 MAGE)既能诱导细胞免疫，又能刺激机体产生抗体。SEREX 技术于 1995 年由 Pfreundschuh 首次介绍，用以鉴定能够刺激机体产生体液免疫应答的肿瘤抗原7。目前已鉴定出一系列涉及肿瘤的细胞病因学、诊断和治疗的抗原。应用 SEREX 方法发现的抗原类型有以下几种：(1)肿瘤细胞中过度表达的正常结构蛋白，它们没有严格的肿瘤特异性，如 Hodgkin 病中发现的 galectin、肺鳞状细胞癌中的翻译起始因子 elF、神经母细胞瘤中发现的 TOP2A 和中发现的 HER-2/neu 等均为此类；(2)分化抗原，典型代表是酪氨酸酶，此外还有 Pmel17/gpl00

51、以及小细胞肺癌来源的 SOX group B 和来源的 NY-BR-1 等；(3)突变抗原，这组抗原来源于细胞结构的突变产物，如大肠癌组织中的尾型同源盒转录因子-2(CDX2)、突变的抑癌p53 等；(4)肿瘤和正常组织表达的抗原 CTA，如从食管癌中克隆的肿瘤抗原原，在肿瘤中异常表达的内源性逆转录NY-ESO-1；(5)逆转录抗产物具有一定的免疫原性，如人类内源性逆转录壳蛋白(HERV-K10)可能是一种肿瘤抑制蛋白；(6)剪接变异体抗原，如结肠癌中发现的 NY-CO-37/38；(7)易位产生的融合产物，典型代表是在胃癌组织中发现的 E-Cad/geneY 融合体。在经 SEREX 方法发

52、现的众多类型的抗原中，CTA 是最普遍的一种抗原，目前，已发现 46 个 CTA，约 91 个 CTA 转录本被鉴定，其中经 SEREX 方法鉴定的 CTA 主要有：SSX2/CT5.2、NY-ESO-1/CT6 和SYCP-1/CT8 等8,9。由于这类抗原呈高度的组织限制性表达、在肿瘤患者博士：宋朝君导师：金伯泉教授17第四博士体内具有免疫原性、可以诱导体液免疫与细胞免疫等特性，为肿瘤的免疫治疗和发展抗原特异性肿瘤提供了新的机遇。随着对筛选肿瘤抗原需求的不断增长，SEREX 方法的局限性也逐渐显现出来。比如， 它所鉴定出的大量抗原中有许多抗原和肿瘤细胞的免疫应答无关10，或者所鉴定出来的大

53、量抗原为患者特异性而非肿瘤特异性，对于临床诊断无普遍意义等等11。为了筛选得到对于基础和临床研究更为有效的肿瘤抗原，近年来，科学家们在原始 SEREX 方法的基础上进行了一系列改进。SEREX 方法的改进包括以下几个方面：(1)改用同种异体的组织 cDNA 文库与肿瘤患者血清反应，发展了鉴定限制性表达于和肿瘤组织中的 CTA 的新方法12。利用cDNA 表达文库而非肿瘤表达文库作为抗原来源，拓展了已定义抗原的范畴，特别是具有 CTA 特征的抗原。应用该方法发现了几个 CTA，包括 SSX，SCP-1，CAGE-1 等；(2)建立肿瘤细胞系而非新鲜肿瘤组织作为 cDNA 文库来源进行 SEREX

54、 分析。肿瘤细胞系对于临床难以得到的肿瘤标本(如小细胞性肺癌)有独特优势。应用肿瘤血清从黑色素瘤细胞系 SK-MEL-37 的表达文库中检测到两个CTA，即 NY-ESO-1 和 MAGE-4，并发现了一个新的 CT成员，MAGEC1/CT713。(3)将RDA(representational difference analysis)与SEREX技术结合，即利用血清学方法鉴定经 RDA 方法克隆的产物的血清反应性，应用该方法鉴定了 MAGE的一个新成员MAGEE1/CT10；经过改良的SEREX方法已经广泛运用于筛选大量不同的肿瘤组织，包括：黑色素瘤、食道癌、结肠癌、胃癌、胰、肝癌、肺癌、肾癌、乳、癌、癌、癌、肉瘤、脑膜瘤、恶性间皮瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤及其他实体瘤。从这些不同的肿瘤组织中已