蛋白纯化和GST沉降技术

1、蛋白纯化和GST沉降技术【原理】细菌表达的谷胱甘肽s转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质一蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。【应用】1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用【方法】一、GST融合蛋白的纯化1、菌种的活化：按1%的量在螺旋管中活化所需菌种，一般50ul的冻存菌接入5ml的LB

2、中，37C220rpm培养2、活化的菌种转接1%接种于5mlLB中，37C220rpm培养至Ot>0.4-0.6之问，即到达对数生长时期（大约34小时）3、取1ml菌液测定Ogg,至O>0.40.6之间，则取诱导前1ml,其余的按1/1000加入诱导剂IPTG，低温小量诱导30C200rpm，诱导过夜（小于16hr）4、次日取诱导后1ml,诱导前和诱导后各1ml,12000rpm,离心2mins,弃上清，加适量的1*PBS,重悬菌液，再加1*loadingbuffer,混匀，沸水煮10mins,12000rpm,离心2mins,SDS-PAGE电泳考马氏亮兰染色5、如果考染结果显示

3、GST融合蛋白（GST-X）诱导出来，则做大量诱导6、菌种活化后按1%转接种于100mlLB中，30C200rpm扩大培养至OK0.40.6之间，即到达对数生长时期（大约3小时）7、取1ml菌液测定ODfi,至OK0.40.6之间，按1/10000加入诱导剂IPTG,低温诱导20C180rpm,制冷系数0.5,诱导过夜8、次日50ml离心管收菌，4c5000rpm5mins离心，每瓶100ml重复离心收于同一离心管中，大型离心机提前预冷9、每100ml菌液沉淀加入10mlA液重悬10、超声破碎。大探头，冰浴，频率5-10o超声23s停23s,1520次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止

4、11、超声后的细菌裂解液加入到50ml干净离心管中，4c11000rpm10mins离心12、平衡Agrose-beads.每个干净EP管中加50ulAgrose-beads。再加1mlA液，4c旋转23mins后4c3000rpm/600g5mins离心,吸弃上清，重复3次13、吸取菌液离心上清到50ml干净离心管，将平衡好的Agrose-beads力口入4c旋转4小时左右14、4C3000rpm/600g10mins离心。移液管吸弃上清，留有1ml左右时用移液器枪头混匀X-GST-beads,转移至1.5ml进口EP管中，用A液反复洗50ml离心管多次至将全部珠子转移至EP管中。3000r

5、pm/600g,5mins,离心，弃上清15、A液洗涤X-GST-beads,每次1m14c旋转10mins后4c3000rpm/600g,5mins,离心,吸弃上清，重复3次16、 最后向X-GST-bead中加入100ulA液，4c保存17、 考染定量：取2ulGST-beads加入10ul1*loadingbuffer混匀，沸水煮样10mins。12000rpm5mins离心后取上泊上样（SDS-PAG丘下胶后，考马氏亮兰染色（新考染液23mins,旧的考染液1030mins）,脱色2h左右二、GSTPulldown1、转染细胞24小时后，IPbuffer裂解，超声破碎。大探头，冰浴，频

6、率510。超声23s停23s,1520次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止，12000rpm,离心2mins,取上清作样品，取部分作Input,剩下的作GSTPulldown2、根据定量结果取X-GST-beads加入到IPbuffer平衡，4c旋转23mins后4c3000rpm/600g5mins离心，吸弃上清，重复3次。然后将平衡后的珠子于600ulcelllysis结合孵育4hS夜3、4C,3000rpm/600g,5mins离心后吸回裂解上清，IPbuffer洗珠子，4c旋转10mins后，4c3000rpm/600g5mins离心,23次。最后用微量上样器将全部IPbuff

7、er吸弃。4、向X-GST-beads其中力口入30ul1*loadingbuffer.细胞裂解液Input50ul中加入50ul2*loadingbuffer.沸水10mins。12000rpm5mins离心后取上清上样进行SDS-PAGE5、电泳后进行WesternBlot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白；也可以将胶考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白。【注意事项】1）该实验设立GST对照，反应均在4cC进行2）沸水煮样以前的离心速度不要超过3000rpm,否则可能将beads离碎了。3）在检测时如果发现GST对照组也有目的蛋白时，则表明有非特异的结合，这是我

8、们应当在GSTPulldown的第三步多洗几次。4）GST对照蛋白的量和实验组的蛋白的应该一样，最好是对照的量比实验组的多一点【举例】inputGSTy-gst+GSTpulldown验证两种已知蛋白质的相互作用inputGSTx-gstY-GFP+X-GFP*Y-GFPX-GFPAnti-GFPAnti-GFPIncubationwithCellLysateorProteinMixtureAntibodyCoupledResin.SpinandwashcT3EluteCoupledAntibody,AntigenJ；三二'二V5ProteinInteracting.withAntig

9、enAnalyze图2免疫共沉淀（co-IP）示意图（1）原理1）当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档（图2）02）缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相互作用（2）方法1）转染后24-48h可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4°C,取少量裂解液以备Westernblot分析做Input,剩余的裂解液以最大转

10、速离心10min后取上清，2）取10仙lproteinA琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液（一般1ML/管）平衡3次，每次3,000rpm离心5min,3）将预处理过的10仙lproteinA琼脂糖珠加入到细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育1h,进行预沉淀。4）3000rpm离心后收集上清，将沉淀弃去，上清备用，5）加1Ng相应的抗体加入到4）的上清液中，4°C缓慢摇晃孵育1h（也可过夜），6）取10仙lproteinA/G琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液（一般1ML/管）平衡3次，每次3,000rpm离心5min,7）将预处理过的10履proteinA/G琼脂糖珠加入到和抗体孵育过的细胞裂

11、解液中，4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与proteinA/G琼脂糖珠偶连，8）免疫沉淀反应后，在4°C以3,000rpm速度离心5min,将琼脂糖珠离心至管底。将上消小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次。最后加入15仙l-30膜的1XSDS上样缓冲液，沸水煮10分钟,9）SDS-PAGE,Westernblotting质谱仪分析。（3）注意的问题1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质一蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或ThtonX-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。一般如果相互作用很弱时可以考虑将盐浓度尽量降低，同时可以考虑加入钱链剂。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS）,细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktail。2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用，抗体的用量参考抗体使用说明书。3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠