食品和水样中的细菌总数及大肠菌群的检测

1、食品和水样中的细菌总数及大肠菌群的检测(一)实验目的(1) 了解和学习食品和水样中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。(2) 学习和掌握食品中菌落总数检测方法和用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。(3) 学习和掌握食品和水样中大肠菌群的检测方法。(二)实验原理食品的微生物学指标主要包括菌落总数、大肠菌群和致病菌等三个项目。其中菌落总数和大肠菌群是最重要、最常检的检验项目。检测食品中的菌落总数，可以了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况.从而反映食品的卫生质量。一般来说、菌落总数越多，说明食品的卫生质量越差，遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落总数仅少量存在时，病原菌污染的

2、可能性就会降低或者几乎不存在。但上述规则也有例外，有些食品成品的菌落总数并不高，但由于已有细菌繁殖并已产生了毒素，且毒素性状稳定，仍存留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸乳等，本身就是通过微生物的作用而制成的，且是活菌制品。因此，菌落总数的测定对评价食品的新鲜度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用，但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生质量，还必须配合大肠菌群和致病菌等检验，才能作出比较全面、准确的评价。大肠菌群是水源污染的指示菌，当饮用水中检查出大肠菌群时，即证实水已被粪便污染，对人是有害的，是不卫生的。同样，食品中若有大肠菌群存在，也会影响人的健康。水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常

3、含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL超过100个。所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit,cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样

4、中活菌的数量。所谓大肠菌群，是指在37c24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。水中大肠菌群的

5、检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。（三）实验器材（1）菌落总数的测定：1）培养基:牛肉膏蛋白陈琼脂培养基，无菌生理盐水，75驻醇。2）器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管，直径为9cm的平皿，18mmx200mm试管，1mL和10mL吸管，500mL三角瓶，500mL广口瓶，均质器或乳钵，培养箱、恒温水浴锅等。（2）大肠菌群的测定；1）培养基：乳糖胆盐蛋白月东培养基，乳糖发酵管，伊红美蓝琼脂培养基（EMB）:蛋白月东20g,

6、猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g，乳糖10g,0.04%澳甲酚紫水溶液25mL水1000mLpH7.4。制法：将蛋白月东、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH,加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL,并倒置放入一个杜氏小管，115c灭菌15min。双倍或三倍乳糖胆盐蛋白月东培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。伊红美蓝琼脂培养基：蛋白月东10g,乳糖10g,K2HPC42g,2%伊红水溶液20M1,0.65%美蓝水溶液10mL,琼月旨17g,水1000mLpH7.1。制法：将蛋白月东、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装.121c灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55C,加入

7、伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。乳糖发酵管：除不加胆盐外.其余同乳糖胆盐蛋白月东培养基。2）器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管，灭菌发酵管，灭菌广口瓶，均质器或乳钵，培养箱，恒温水浴锅等。3）试剂：革兰氏染色液等。（四）实验方法食品中：（1）菌落总数的检测1）检样稀释及培养：以无菌操作法，将检样25g（或25mL）剪碎以后，放于装有225mL无菌水的三角版（瓶内预先放适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成l:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌容器中以8000-10000r/min的速度离心1min,做成1:10的均匀稀释液。将上述样

8、品进行10倍系列稀释，稀释度视食品性质和污染状况而定。根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。迅速将熔化后保温在45c的牛肉膏蛋白月东琼脂培养基1520mL注入平皿，并转动平皿使混合均匀，同时将培养基倾入加有1mL空白稀释剂（即不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，倒置平板，于36±1C恒温箱内培养48±2h取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得lg（1mL）样品所含菌落总数。2）菌落计算方法和报告：同实验一0七水中菌落总数测定方法中的菌落计数报告方式。（2）大肠菌群的检测：1

9、）检验程序：食品中大肠菌群检测程序见图1081所示。2）操作步骤：采样及稀释：a.按无菌操作法将检样25g（或25mL）放于含有225mL无菌水的三角瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000-10000r/min的速度离心1min,做成1：10的稀释液。b.用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1M1,注入含有9mL无菌水的试管内，振摇混匀，做成1:100的稀释液，换用1支1mL灭菌吸管，按上述操作依次作10倍系列稀释液。图1食品中大肠菌群的检测程序每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。乳糖初发酵试验：即通常所说

10、的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。.将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管；lmL及1mL以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管。每一个稀释度接种3管，置36±1C温箱内，培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。分离培养：将产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板，置36±1C温箱内培养18-24h,然后观察菌落形态并作革兰氏染色、镜检并作复发酵试验。乳糖复发酵试验：即通常所说的证实试验，其目的在于证明经乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏

11、阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。在上述选择性EM盼养基上，挑取可疑的大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±lC温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳搪发酵管产气，革兰氏染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠菌群阴性。水样中：(1)水样的采集：1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min,以灭菌三角瓶接取水样以备分析。2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来

12、，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。（2）细菌总数的测定:1）水样稀释及培养：按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度（饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水一被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度）,吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。将熔化后保温度45c的牛肉膏蛋白月东琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL并趁热转动平皿混合均匀。待琼脂凝固后，将平皿

13、倒置于37c培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。2）计算方法：作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。3）计数的报告：平板菌落数的选择：选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。稀释度的选择：

14、a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之（表1例1）。b.若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2,应报告其平均数；若比值大于2,则报告其中较小的数字（1例2、例3）。c.若所有稀释度的平均菌落均大于300,则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（1例4）。d.若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（1例5）。e.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6）。f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平

15、均菌落数乘以该稀释彳§数报告之（表1例7）。细菌总数的报告：细菌的菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。（3）大肠菌群的测定（多管发酵法）：表1稀释度的选择及细菌数报告方式稀释度及菌落数两稀释度之比菌落息数/(cfu/g或cfu/mL)报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或cfu/g）-110-210-3101多不口计16420-16400416000或1.6X102多不口计295461.637750438000或3.8X103多不

16、口计271602.22710027000或2.7X1044多不口计多不可计313-3130005310000或3.1X105627115-270270或000-V10V107多不PJ计30512-30500431000或3.1X101）生活饮用水或食品生产用水的检验:初步发酵试验：在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白月东培养液（可称为三倍乳糖胆盐）的三角瓶中（内有倒置杜氏小管），以无菌操作各加水样100mL在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中（内有倒置小管），以无菌操作各加入水样10mL如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。摇匀后，37c培养24h。平板分

17、离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMB培养基）上，37c培养18-24ho大肠菌群在EM抨板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。复发酵试验：将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落13个，37c培养24h,如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表107-2（或表107-3）,报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）。2）水源

18、水的检验：用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。严重污染水：1,0.1,0.01.0.00lmL各1份。中度污染水：10.1,0.1,0.01mL各1份。轻度污染水：100,10,1,0.1mL各l份。大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份。表2大肠菌群检索表（饮用水）012备注每升水样中大肠菌群数0<3411接种水样总量300mL（100mL2份,10mL10份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230表3大肠菌群数变异不大的饮用水阳性管数0123接种水

19、样总量300mL(3份100mL)每升水样中大肠菌群数<3411>18表4大肠菌群检索表(严重污染水)接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注10.10.010.001-<900接种水样总量-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900-+-2200+-2300为1.111（1,0.1,0.01,0.001mL各一份）-+2800+-+9200+-+-9400+-+18000+-23000+-+96000+-238000+>238000表5大肠菌群检索表（中度污染水）接种水样量/mL每升水样中备注大肠菌群数1010.10.01-v90-+90-+-90-

20、+-95-+180-+-+190-+-220接种水样总量+-230为11.11(10,-+2801,0.1,0.01mL+-+920各一份）+-+-940+-+1800+-2300+-+9600+-23800+>23800表6大肠菌群检索表（轻度污染水）接种水样量/mL每升水样中备注大肠菌群数1001010.1-<9接种水样总量为111.1（100,10,1,0.1mL各一份）-+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19-+-22+-23-+28+-+92+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+>2380表7大肠菌群变异不大的水源水阳性管数012345678910每升水样中大肠菌群数V10112236516992120160230>230备注接种水样总量100mL（10mL10份）操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管（瓶）中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查表107-4、表107-5、表107-6或表107-7,报告每升水样中的大肠菌群数（MPN