用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量

1、用考马斯亮蓝 G250 法测定蛋白质含虽呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)?考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝3250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beerslaw)。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm通过测定595nmM光吸收的增加量可知与其结

2、合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h,之后， 蛋白质一染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质一染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5L/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100蛋白质，微量测定法测定范围是1,10蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法十扰物少，研究表明：NaCl,

3、KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4无十扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色十扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2一筑基乙阳蔗糖，甘油，EDT版微量的去污剂如Triton6X100,SDS玻璃去污剂有少量颜色十扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝3250100mg溶于50ml95忍醇中，加入100ml85%|酸，用蒸僻水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝3250,4.7%(W/V)乙醇。二、标准和待测蛋白质溶液1(标准蛋白质溶液结晶牛血活蛋白

4、，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml,0.1mg/ml蛋白溶液。2(未知蛋白质溶液。三、器材试管及试管架，移液管(0.1ml及5ml),UV,2000型分光光度计。操作方法一、标准法制定标准曲线取14支试管，分两组按下表a平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表a试管编号01234571mg/ml标准蛋白溶液/ml00.01810.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl/ml0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀

5、，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm二、微量法制定标准曲线取12支试管，分两组按下表b平行操作。绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。表b试管编号23451mg/ml标准蛋白溶液/ml00.010.020.030.040.050.15mol/LNaCl/ml0.10.090.080.070.060.05考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm2三、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查

6、出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。注意事项（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5,20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。（2）测定中，蛋白，染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗十净。思考题：根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：（1）样品不易溶解，但要求结果较准确。（2）要求在半天内测定60个样品。（3）要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。不要用比色杯，用量大，重复性差。可以这样在96孔板里面做（可以做复

7、孔）:每孔200微升Bradford试剂，加5微升蛋白溶液，用枪混匀或着在微量振荡器上面振匀。5分钟后在酶标仪上测定OD495然后在Excel里面直接做均值，画标准曲线，。已参考:Pierce公司的相关试剂盒。考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。 这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax）,由465nm变为595nm溶

8、液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质，染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜

9、色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。(3)十扰物质少。如十扰Lowry法的K+、Na*Mg2-W子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、筑基乙醇、EDT酣均不十扰此测定法。此法的缺点是：(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用g一球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。(2)仍有一些物质十扰此法的测定，主要的十扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH(如同0.1N的酸十扰Lowary法一样)。(3)标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。这是操作流程1.完全溶解蛋白标准品，取10ml稀释至100ml，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBSffi释标准品2.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升分别加