沙门菌属和志贺菌属检验

1、沙门菌属和志贺菌属检验目的要求1. 掌握沙门菌属和志贺菌属细菌的形态及染色特性、生化反应、培养方法及鉴定意义。2. 掌握沙门菌属和志贺菌属细菌的血清学鉴定方法。3. 掌握肥达试验的原理、操作方法及结果判断。器材和试剂1.菌种福氏、宋内志贺菌、伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌。2. 培养基SS平板、中国蓝、EMBMACKIA、MIU硝酸盐培养基。试剂氧化酶试剂或氧化酶纸片、3%过氧化氢溶液、柯氏试剂、甲基红试剂、400g/LKOH志贺菌诊断血清(包括志贺菌属四种多价血清及福氏、宋内志贺菌单价血清)、沙门菌AF菌体(O)多价和O及H因子血清；伤寒沙门菌aH诊断菌液、乙型副伤寒沙门菌H诊断菌液、伤寒或副

2、伤寒患者血清或模拟标本，免疫血清。3. 其他清洁载玻片、革兰染色液、生理盐水等、试管、40孔试管架、lml吸管、5ml吸管、无菌滴管、洗耳球、37C或45C水浴箱等。步骤和方法1. 形态观察(1) 革兰染色：沙门菌属细菌为革兰阴性细长杆菌。志贺菌属细菌为革兰阴性杆菌，散在分布。(2) 观察鞭毛染色标本片：镜下可见沙门菌属细菌具有周鞭毛。志贺菌属细菌无鞭毛。2. 菌落观察沙门菌属：将本菌接种在SSMAC板上经35C孵育1824h。由于本菌不分解乳糖并产碱，故在SS和MA砰板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产生H2S的菌落可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。(1) 志贺菌属：将本菌

3、接种在SS和MA砰板上经35C孵育1824h。由于志贺菌不分解乳糖，宋内志贺菌某些菌株可迟缓发酵乳糖，故其在SS平板和MAC板上形成无色透明的、中等大小的菌落。除宋内志贺菌菌落外均为光滑型菌落。生化反应氧化酶试验：方法同大肠埃希菌。沙门菌属和志贺菌属细菌氧化酶试验均为阴性。初步试验鉴定：挑取志贺菌和沙门菌的单个菌落分别接种在KIA、MIU和硝酸盐培养基上，经35C孵育1824h,同时做触酶试验其结果见表24。表2-4志贺菌属和沙门菌属的基本生化反应斜面KIA底产层气H2S、动'力MIU噪脉酶氧化酶触酶硝酸盐还原志贺菌KA-/+-+/-+伤寒沙门菌KA-+/-+-+乙型副伤寒菌KA+-+

4、最终鉴定：须做全面生化反应和血清学试验。4.血清学试验志贺菌属的分型鉴定：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。取1环志贺菌四种多价血清于载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。结果：对照呈均匀混浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用A、B、C、D群最常见的单价血清凝集定种。结果判断、解释和报告： 分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”c 经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离出XX志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告：“分离出xx志贺

5、菌x型”。沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。首先选用AF组多价“O”诊断血清做玻片凝集试验。在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在510min内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验。若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，加热100C、30min,再与AF组多价“O'诊断血清做凝集试验。若与AF组多价“O”血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检出率最高菌型的相应血清做玻片凝集反应。若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H

6、因子血清检查第I相抗原，然后检查第II相抗原，最后确定该菌种属于哪一型沙门菌。结果判断、解释和报告：可报告“未分离出沙门菌”c“分离到XX沙门菌”，或“X 分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌鉴定依据者, 生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性，可初步报告为：群沙门菌”。4. 肥达试验(1)原理：用已知的伤寒沙门菌OH抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的H抗原(PA、PB)与肠热症患者血清做定量试管凝集试验，以出现“2+”凝集的最高血清稀释度为效价，测定相应抗体含量，用以辅助诊断肠热症。7支并标记，另取中号试管4ml。然后取出2ml按每管2ml混匀，此种血清即为1支，加生理盐水0.5m1

7、分别放人各1:40稀释，吸取2支试管中。以此类推连续稀释到各排小试(2)试验方法：为单管稀释法。准备4排小试管，每排3.8ml及被检血清O.2ml,混匀，即为1:20稀释，总量为排小试管中的第1支试管中。再于上述中号试管内加生理盐水此稀释度血清2ml，按每管0.5m1分别加到各排小试管中的第管第6支试管为止，第7支小试管只加入0.5ml生理盐水做阴性对照。然后按表2-5操作表2-5血清学试验(肥达试验)方法试验管(每管0.5ml稀释血活)对照管1:201:401:801:1601:3201:640生理盐水。抗原0.50.50.50.50.50.50.5H抗原0.50.50.50.50.50.5

8、0.5PA抗原0.50.50.50.50.50.50.5PB抗原0.50.50.50.50.50.50.5血清最终稀释1:401:801:1601:3201:6401:1280-振荡片刻，置于45C水浴箱中2h或37C水浴箱4h,取出置室温或放冰箱中过夜，次日观察并记录结果。结果判断解释和报告：先观察对照管，正确结果应无凝集反应，再分别与对照管比较观察各试管凝集情况。根据液体透明度和凝集块多少，以4+、3+、2+、+、-符号记录。4+:上清液完全澄清，细菌凝集块全部沉于管底。3+:上清液澄清度达75%,大部分细菌凝集成块沉于管底。2+:上清液澄清度达50%,约50%细菌凝集成块沉于管底。+：上清液体混浊，管底仅有少部分细菌凝集成块，上清液澄清度仅有25%。-:液体均匀昆浊，无凝集块。以呈现2+凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。一般认为，伤寒沙门菌。抗体凝集价在1:80以上，H抗体在1:160以上，甲、乙、丙型副伤寒沙门菌凝集价在1:80以上才有诊断意义。注意事项1.加入诊断菌液时，由对照管开始往前，每管各加O.5ml。2. 结果观察时不要振荡试管，先观察，必要时再轻摇试管使凝块从