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1、分类号 密级 U D C 编号 硕士热疗对鼻咽癌肿瘤干细胞的影响及相关机制探讨The influenceof heat treatment for nasopharyngeal cancercells and the related mechanismstem杨洁肖东研究员导师肿瘤学专业名称学术型培养类型2015 年 03 月 08 日提交 日期南方医科大学 2012 级热疗对鼻咽癌肿瘤干细胞的影响及相关机制探讨The influence of heat treatment for nasopharyngealcancer stem cells and the related mechanis

2、m课题来源：学位申请人 杨洁肖东肿瘤学学术型导专培培所师业养养在名类层学称型次院基础医学院2015 年 03 月 08 日广州摘要热疗对鼻咽癌肿瘤干细胞的影响及相关机制探讨：杨洁生导师：肖东研究员摘 要肿瘤热疗的定义为：用各种方法提高全身和/或肿瘤组织(局部)的温度，利用热作用及其继发效应来治疗。基本原理是利用物理能量加热全身或局部，使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度，并维持一定时间，利用正常组织和肿瘤细胞对温度耐受能力的差异（肿瘤细胞与正常细胞相比有一个致命的弱点，即耐热性差，肿瘤细胞可以耐受的温度不超过42，而人的正常体细胞可以耐受高达47的高温），达到既能使肿瘤细胞凋亡、又不损伤正常组织的

3、治疗目的1。目前我国临床应用的热疗主要有微波热疗、超声聚焦热疗、射频热疗及内生场热疗1。现临应用热疗的方法有两种：1、单独热疗对于放疗、化疗或手术后复发、远处及全身转移的晚期肿瘤，又不宜继续上述治疗者可以单独热疗进行治疗；并可缓解晚期肿瘤顽固性疼痛，提高的生活质量。另外对某些表浅肿瘤如、皮肤癌等也可以直接热疗。2、热疗与化疗联用，即热化疗，可以提高肿瘤内的浓度，增强抗肿瘤效应2；同时可以降低化疗对未加热的正常组织的毒性作用；两者联用还有助于防止和推迟耐药性的产生3。另外，位于肿瘤中心部分的肿瘤细胞处于缺氧状态，对放射线不敏感，放疗后不能完全被杀灭，往往成为肿瘤复发的根源，而热疗对于这种分肿瘤细

4、胞作用却特别强；尤其对放疗抗拒的S期细胞特别容易被高热，因此，热疗可以弥补放疗的不足，联用可以提高疗效4。肿瘤热疗已成为继手I摘 要术、放疗、化疗和生物治疗之后的一种全新的治疗肿瘤“绿色疗法”5，因其无毒副作用，不损伤正常组织，不破坏自身免疫力等优点，备受肿瘤医生和患者的关注。热疗已有很长的历史。古希腊名医，西方现代医学之父希泼克拉底曾用加温方疗肿瘤。奥地利医生朱利叶斯(Julius Wagner Jauregg)利用高热治疗疾病,并因此而获得1927年生理学及医学奖。近年来国内外诸多学者在热疗对肿瘤细胞基础和临床方面做了大量研究，认为热疗可通过直接细胞作用6, 7、细胞凋亡效应8、增强放化疗

5、疗效9、激发免疫反应10等多方面的机制起肿瘤细胞的作用11。但是热疗作为一种新兴的肿瘤治疗方法还有待于进一步的深入研究，热疗和其它治疗肿瘤方法的协同作用机制以及如何准确把握热疗的各项参数最大限度的肿瘤细胞，如何避免正常组织的热损伤等问题还需要进一步探讨11。热疗对鼻咽癌肿瘤干细胞的影响及其机制更是少有研究。与EB相关的鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是高发于我国南方及东南亚地区的鼻咽部低分化鳞癌，发病大多为中年人，亦有青少年患病者。虽然鼻咽癌的研究有了极大的进展，其5年生存率仍徘徊于50-60，并未得到根本性的。导致鼻咽癌治疗失败的主要是远处转移和局部复发12

6、。肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)是肿瘤发生的根源，是肿瘤增殖、复发、转移与耐治疗的根本。因此，为获得理想抗癌疗效，有效清除CSCs是十分关键的。年浙江肿瘤医院的一篇关于热疗与鼻咽癌患者的期临床实验研究中指出，热疗应用于鼻咽癌患者，可提高NPC患者生存率，但是受热不均匀、癌细胞转移后如何处理及对NPC干细胞影响均不清楚13。基于热疗对鼻咽癌肿瘤干细胞的研究现状，本课题的研究目的为：、探讨热疗对NPC CSCs的影响及相关机制（近期研究目标）。、如何进一步提高热疗对NPC CSCs的效果（近期研究目标）。、如何在内实现热疗靶向NPC CSCs的治疗（远期研究目标）。我

7、们通过单独的热处理来探讨热疗对NPCCSCs的影响及相关机制 ，然后利用热疗与来提高热疗对NPC CSCs的效果，最后对实现热疗靶向NPC CSCs的治疗做一个初步的展望。这将为深II摘要入理解鼻咽癌发病的机制和进一步促进热疗在鼻咽癌上的临床应用奠定理论基础，为此本课题进行了如下研究：方法：1 体外、体内验证热疗对NPC CSCs的影响采用平板克隆和生长曲线（CCK8 法）分别检测体外热疗后 CNE2 和 SUNE1细胞增殖能力改变，干性检测、SP 细胞含量测定和肿瘤球形成实验分别检测体外热疗后 CNE2 和 SUNE1 细胞肿瘤干细胞含量改变， 鼠皮下成瘤实验检测体外 CNE2 细胞热疗后

8、鼠体内增殖能力改变。（所有实验均以相应的未做热疗处理的 NPC 细胞作对照）。2 体外验证热疗对 HCC CSCs 的影响采用平板克隆和生长曲线（CCK8 法）分别检测体外热疗后 7721 和 Huh7细胞增殖能力改变，干性检测、CD133 细胞含量测定和肿瘤球形成实验分别检测体外热疗后 7721 和 Huh7 细胞肿瘤干细胞含量改变。（所有实验均以相应的未做热疗处理的 HCC 细胞作对照）。3 探讨热疗利用慢CSCs 机制表达载体 pLV-Cirbp 生产携带 Cirbp 的慢，收集上清分NPC 细胞株 CNE2 和 SUNE1，48-72h 后于倒置荧光显微镜下检测 EGFP别表达以观察情

9、况，若效率低于 90%，应用嘌呤霉素杀死 EGFP-Puro（）细胞，获得稳定过表达 Cirbp 的 EGFP-Puro（）细胞，大量扩增细胞并保种；提取 RNA，应用 qRT-PCR 检测携带有 Cirbp 转达水平。的 NPC 细胞株中 Cirbp 的表四个 shRNA-Cirbp 的慢从山东维真技术载体，利用脂质体介导瞬时转染技术分别将四个 shRNA-Cirbp 的慢转染至 CNE2 和 SUNE1中，48h 收集细胞并提取 RNA，qRT-PCR 检测 Cirbp 表达以评价抑制效果，选择干扰效果最佳的 shRNA-Cirbp4 生产携带有 shCirbp 的慢，收集上清分别NPC

10、细胞株CNE2 和SUNE1，48-72h 后于倒置荧光显微镜下检测EGFPIII摘 要情况，若效率低于 90%，应用嘌呤霉素杀死 EGFO（）细表达以观察胞，获得稳定干扰 Cirbp 表达的 EGFP（）细胞，大量扩增细胞并保种。利用过表达 Cirbp 或 shCirbp 的 NPC 细胞株,体外采用细胞增殖 (平板克隆)和细胞干性研究 (干性检测、SP 细胞含量和肿瘤球等)实验，体内采用鼠皮下成瘤实验来明确 Cirbp 对热疗的影响。4 探讨热疗与冬凌草甲素（Oridonin）对NPC CSCs的效果采用生长曲线（CCK8 法）检测 Oridonin 不同浓度对细胞增殖能力的影响，干性检测

11、、SP 细胞含量、肿瘤球形成检测 Oridonin 不同浓度对细胞肿瘤干细胞含量的影响，获得最佳 Oridonin 浓度（20M）用于后续实验。CCK8 和平板克隆实验检测热疗Oridonin 后对 NPC 细胞增殖能力的影响，肿瘤球形成实验检测热疗Oridonin 后对 NPC CSCs 的影响。5 探讨热疗能否增加 NPC CSCs 对放疗的敏感性将 CNE2 细胞连续低剂量（8 Gy）照射 8 次获得耐放疗细胞株 CNE2-8G,观察 CNE2 细胞形态改变及 EMT 相关表达变化，并通过干性及肿瘤球形成实验明确 CNE2-8G 细胞肿瘤干性样细胞含量的改变。把 CNE2 和 CNE2-

12、8G 同时梯度剂量照射，以 0Gy 作为对照组，4Gy 和 8Gy 作为实验组，采用 CCK8、平板克隆实验检测 CNE2-8G 细胞增殖能力的改变， 肿瘤球形成实验检测 CNE2-8G 细胞肿瘤干细胞含量改变，明确 CNE2-8G 耐放疗的特性，并将 4 Gy 确定为后续热疗与放疗实验照射剂量。应用热疗与放疗，采用 CCK8、平板克隆实验检测 CNE2-8G 细胞增殖能力改变，干性检测及肿瘤球形成实验检测 CNE2-8G 细胞肿瘤干细胞含量改变，明确热疗是否增加 NPC CSCs 对放疗的敏感性。结果：1. 体外、体内验证热疗对 NPC CSCs 的影响1.1 体外实验证实热疗可抑制 NPC

13、 细胞增殖能力及下调 NPC CSCs 的含量1.1.1 热疗可抑制 NPC 细胞增殖能力IV摘要采用平板克隆和生长曲线（CCK8 法）分别检测体外热疗后 CNE2 和 SUNE1 细胞增殖能力改变。结果显示热处理后（42 30min）抑制 NPC 细胞增殖能力， 平板克隆数目明显减少，生长速率下降（图 1-A、B）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。（所有实验均以相应的未做热疗处理的 NPC 细胞作对照）。1.1.2 热疗可下调 NPC CSCs 的含量干性检测、SP 细胞含量测定和肿瘤球形成实验分别检测体外热疗后CNE2 和 SUNE1 细胞肿瘤干细胞含量改变。结果显示热处理后

14、NPC 细胞无论是RNA 水平还是蛋白表达水平干性表达均降低，SP 细胞比例明显下降，肿瘤球形成能力也显著下调（图 1-C、D、E、F）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。（所有实验均以相应的未做热疗处理的 NPC 细胞作对照）。1.2 体内实验证实热疗可影响 NPC 细胞鼠皮下成廇能力鼠皮下成瘤实验检测体外 CNE2 细胞热疗后 鼠体内增殖能力改变。结果显示热处理后的 NPC 细胞 鼠皮下成廇能力极度减弱，不仅瘤重变轻，而且体积减小（图 2）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。（所有实验均以相应的未做热疗处理的 NPC 细胞作对照）。2. 体外验证热疗对 HCC CSCs

15、 的影响2.1 热疗可抑制 HCC 细胞增殖能力采用平板克隆和生长曲线（CCK8 法）分别检测体外热疗后 7721 和 Huh7 细胞增殖能力改变。结果显示热处理后（42 30min）抑制 HCC 细胞增殖能力， 平板克隆数目明显减少，生长速率下降（图 3-A、B）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。（所有实验均以相应的未做热疗处理的 HCC 细胞作对照）。2.2 热疗可下调 HCC CSCs 的含量干性检测、CD133 细胞含量测定和肿瘤球形成实验分别检测体外热疗后 7721 和 Huh7 细胞肿瘤干细胞含量改变。结果显示热处理后 HCC 细胞无论是RNA 水平还是蛋白表达水平干性

16、表达均降低，CD133 细胞比例明显下降，肿瘤球形成能力也显著下调（图 3-C、D、E、F）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。（所有实验均以相应的未做热疗处理的 HCC 细胞作对照）。V摘 要3 热疗CSCs 机制探讨3.1 构建稳定过表达Cirbp 的NPC 细胞株CNE2-LV-Cirbp 和SUNE1-LV-Cirbp慢载体 pLV-Cirbp 经鉴定，片段序列与原始序列一致，明确序列正确（结果未提供）；pLV-Cirbp 使用 Xho I、Spe I 分别进行单酶切检测，使用 Cla I/BamH I 进行双酶切检测，进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，其条带大小与理论 推 测 值

17、 基 本 相 符 ： pCDH-Cirbp-GFP-Puro XhoI(9070bp) ，pCDH-Cirbp-GFP-Puro Spe I (1566bp,7504bp)，pCDH-Cirbp-GFP-Puro ClaI/BamH I (1166bp,7904bp)（附图 3-1-A）；和酶切鉴定结果表明，pLV-Cirbp构建。接着携带 Cirbp 和 EGFP的慢，pLV-Cirbp 与包装质粒共转染 293FT 细胞，48h 后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，证明转染成功（附图 3-1-B）。接着利用携带 Cirbp 的慢倒置荧光显微镜下通过检测 EGFP 表达确认NPC 细胞株，48-

18、72h 后于（附图 3-1-C），若效率低于 90%，应用嘌呤霉素杀死 EGFP-Puro（）细胞，获得稳定过表达 Cirbp的 EGFP-Puro（）细胞，大量扩增细胞并保种，随后提取 RNA，qRT-PCR 检测证实携带有 Cirbp 转的 NPC 细胞株中 Cirbp 表达正常，且比未携带Cirbp 的慢的 NPC 细胞株表达要高(附图 3-1-D），差异均具有统计学意义（P<0.05），预示构建稳定过表达 Cirbp 的 NPC 细胞株 CNE2-LVCirbp 和SUNE1-LVCirbp。3.2 构建稳定干扰 Cirbp SUNE1-LV-shCirbp从山东维真技术表达的

19、NPC 细胞株 CNE2-LV-shCirbp 和四个 shRNA-Cirbp 的慢载体（附图3-2-A），利用脂介导瞬时转染技术分别将四个 shRNA-Cirbp 的慢转染至 CNE2 和 SUNE1 中，48h 收集细胞并提取 RNA，qRT-PCR 检测 Cirbp 表达结果显示 shRNA-Cirbp4 抑制效果最佳为 50（附图 3-2-B）。接着选择干扰效果最佳的shRNA-Cirbp4 生产携带有shCirbp 的慢，收集上清分别NPC细胞株 CNE2 和 SUNE1，48-72h 后于倒置荧光显微镜下检测 EGFP-Puro 表达以观察情况（附图 3-2-C），若效率低于 90

20、%，应用嘌呤霉素杀死 EGFOVI摘要（）细胞，获得稳定干扰 Cirbp 表达的 EGFP（）细胞，大量扩增细胞并保种, 随后提取 RNA，WB 检测证实携带有 shCirbp 转的 NPC 细胞株中 Cirbp表达下调（附图 3-2-D），差异均具有统计学意义（P<0.05），预示定干扰 Cirbp 表达的 NPC 细胞株 CNE2-shCirbp 和 SUNE1-shCirbp。构建稳3.3 热疗可通过下调 Cirbp的表达抑制 NPC 细胞增殖能力，过表达 Cirbp后细胞增殖能力又回升，展示出耐热疗特性利用过表达 Cirbp 或 shCirbp 的 NPC 细胞株,以热疗前（37

21、 30min） CNE2-LV-con 和 SUNE1-LV-Cirbp 为对照组， 目的组为 LV-con+ 热疗组、LV-shCirbp 组、 LV-Cirbp 组、 LV-Cirbp+热疗组，体外细胞增殖 (平板克隆、CCK8)实验结果表明 LV-con+热疗组和 LV-shCirbp 组细胞数目下降，LV-Cirbp 组和 LV-Cirbp+热疗组细胞数目与对照组几乎没差别（图 3-A、B）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.4 热疗可通过下调 Cirbp的表达减少 NPC CSCs 细胞比例，过表达 Cirbp后 NPC CSCs 细胞比例又回升,展示出耐热疗特性利用过

22、表达 Cirbp 或 shCirbp 的 NPC 细胞株,以热疗前（37 30min） CNE2-LV-con 和 SUNE1-LV-con 为对照组， 目的组为 LV-con+ 热疗组、LV-shCirbp 组、 LV-Cirbp 组、LV-Cirbp+热疗组。肿瘤球形成结果表明 LV-con+热疗组和 LV-shCirbp 组细胞肿瘤球形成个数下降，而 LV-Cirbp 组和 LV-Cirbp+热疗组 SP 细胞肿瘤球形成个数与对照组几乎没差别（图 3-C）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。4 探讨热疗与冬凌草甲素（Oridonin）对 NPC CSCs 的效果4.1 单独 O

23、ridonin 对 NPC CSCs 的效果4.1.1 单独 Oridonin 抑制 NPC 细胞增殖能力采用生长曲线（CCK8 法）检测 Oridonin 不同浓度对细胞增殖能力的影响。结果显示随着 Oridonin 作用于 NPC 细胞浓度增加，细胞增殖能力逐渐下降，当浓度增加至 80M（此时细胞抑制率未及 50）时随着浓度再增加，对细胞增殖能力影响不再增加，因此得出结论 Oridonin 单独对 NPC 细胞杀VII摘 要伤效果不是特别显著，且不能得出 Ic 50 值，但具有一定的抑制 NPC 细胞增殖能力（图 4-A）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。4.1.2 单独 Or

24、idonin 对 NPC CSCs 有一定的效果检测、肿瘤球形成检测 Oridonin 不同浓度对细胞肿瘤干细胞含量干性的影响，结果表明在 Oridonin 浓度（20M）时干性表达则表现出降低、SP 细胞含量也下降及肿瘤球形成能力都下降,展示出了Oridonin 对NPC CSCs 一定的效果（图 4-B、C）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。4.2 热疗与冬凌草甲素（Oridonin）4.2.1 热疗与冬凌草甲素（Oridonin）CCK8 和平板克隆实验检测热疗响，以 CNE2 和 SUNE1 热疗前（37显著增加了 NPC CSCs 的效果显著抑制 NPC 细胞增殖能力Or

25、idonin 后对 NPC 细胞增殖能力的影30min）为对照组，目的组为 42 30min组、单独 Oridonin 组和 42 30min+Oridonin 组，结果表明热疗与冬凌草甲素（Oridonin）组显著 NPC 细胞生长能力明显下降，平板克隆个数显著减少（图 4-D、E）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。4.2.2 热疗与冬凌草甲素（Oridonin）显著增加了 NPC CSCs 的效果Oridonin 后对 NPC CSCs 的影响。以 CNE2肿瘤球形成实验检测热疗和SUNE1 热疗前（37 30min）为对照组，目的组为42 30min 组、单独Oridonin

26、组和 42 30min+Oridonin 组，结果表明热疗与冬凌草甲素（Oridonin）组后对 NPC CSCs 良好的肿瘤球形成能力显著降低，展示了热疗与效果（图 4-F）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。5. 探讨热疗能否增加耐放疗细胞株对放疗的敏感性5.1 获得 CNE2-8G将 CNE2 细胞连续低剂量（8 Gy）照射 8 次，获得耐放疗细胞株 CNE2-8G,观察 CNE2 细胞形态改变及 EMT 相关表达变化。比较 CNE2 和 CNE2-8G细胞形态发现，CNE2-8G 相比较 CNE2 细胞，CNE2 细胞多角形转变为梭形（图5-1-A）。检测 EMT 相关，发现

27、上皮样细胞表达降低，间充质样细胞表达升高（图 5-1-B）。再通过肿瘤干性表达检测和肿瘤球形成，明确VIII摘要CNE2-8G 细胞肿瘤干性样细胞含量的改变。结果表明 CNE2-8G 细胞肿瘤干性基因表达升高，肿瘤球形成能力增加（图 5-1-B、C）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。预示我们获得耐放疗细胞株 CNE2-8G。5.2 验证 CNE2-8G 细胞耐放疗特性5.2.1 CNE2-8G 细胞照射后增殖能力比 CNE2 强把 CNE2 和 CNE2-8G 同时梯度剂量照射，以 0Gy 作为对照组，4Gy 和 8Gy 作为实验组，采用 CCK8、平板克隆实验检测 CNE2-8G

28、 细胞增殖能力的改变， 结果表明在 4Gy 照射剂量条件下，CNE2 细胞生长能力比对照组明显下调，而CNE2-8G 细胞生长能力与对照组基本无差别，CNE2 细胞平板克隆个数明显比对照组少，而 CNE2-8G 细胞平板克隆个数与对照组基本无差别（图 5-1-D、E）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。预示我们所获得的 CNE2-8G 细胞具有一定的耐放疗特性。5.2.2CNE2-8G 细胞照射后肿瘤球形成能力比 CNE2 强肿瘤球形成实验检测 CNE2-8G 细胞肿瘤干细胞样细胞含量改变，结果表明4Gy 照射剂量条件下， CNE2 细胞肿瘤球形成个数比对照组明显下调，而CNE2-8

29、G 细胞肿瘤球形成个数与对照组基本无差别（图 5-1-F），差异均具有统计学意义（P<0.05）。更进一步明确了 CNE2-8G 耐放疗的特性。5.3 热疗增加 NPC CSCs 对放疗的敏感性5.3.1 热疗增加耐放疗细胞株 CNE2-8G 对放疗的敏感性选择细胞 CNE2-8G，分未做任何处理的对照组和目的组单纯放疗组（4Gy）、单纯热疗组（42 30min）、放疗热疗组（照射后 30 min 内加热 42 30min），采用 CCK8、平板克隆实验检测 CNE2-8G 细胞增殖能力改变，结果表明与对照组相比热疗与放疗组生长能力显著下调，平板克隆数目显著下降（图 5-2-A、B）。差

30、异均具有统计学意义（P<0.05）。预示热疗在一定程度上增加了耐放疗细胞株 CNE2-8G 对放疗的敏感性。5.3.2 热疗增加 CNE2-8G CSCs 对放疗的敏感性选择细胞 CNE2-8a，分未做任何处理的对照组和目的组单纯放疗组（4Gy）、IX摘 要单纯热疗组（42 30min）、放疗热疗组（照射后 30 min 内加热 42 30min），干性检测及肿瘤球形成实验检测 CNE2-8G 细胞肿瘤干细胞含量改变，结果表明与对照组相比热疗与放疗组干性RNA 水平表达降低，肿瘤球形成个数显著减少（图 5-2-C、D）。差异均具有统计学意义（P<0.05）。明确了热疗可以增加耐放疗

31、的 NPC CSCs 对放疗的敏感性。结论：热疗通过 Cirbp 抑制 NPC CSCs 细胞增殖，热疗与 Oridonin制效果，并能增加耐放疗细胞 CNE2-8G 对放疗的敏感性。，可加强抑：NPC Cirbp细胞增殖Oridonin放疗敏感性XABSTRACTThe influence of heat treatment for nasopharyngeal cancer stem cells and the related mechanismName: Jie YangSupervisor: Prof. Dong XiaoABSTRACTBackground：Hyperthermia

32、is defined as: a variety of ways to improve the body and / or tumor tissue (partial) temperature, using thermal effect and its secondary effect to treat malignant tumor. The basic principle is to use physical energy heating the human body or local, the tumor tissue temperature rises to effective tre

33、atment temperature, and maintain a certain time, and the difference ability of tolerance of temperaturewith tumor cells to normal tissue (tumor cells compared to normal cells have aweakness, namely poor heat, tumor cells can withstand the temperaturedoes not exceed 42 , and normal human somatic cell

34、s can withstand temperatures of up to 47 ), and reach the therapeutic purposes that both the tumor cell apoptosis and without damage to normal tissue1.At present, China's main clinical application of hyperthermia microwave hyperthermia, focused ultrasound hyperthermia, hyperthermia and hyperther

35、mia endogenous field1.Methods based on current clinical hyperthermia in two ways: 1,hyperthermia alone, for radiotherapy, patients with advanced cancer chemotherapy or surgery recurrence, distant and body metastasis, and can not continue the above treatment; advanced tumors and relieve intractable p

36、ain, improve quality of life of patients. In addition to some superficial tumors, such as breast cancer, skin cancer can also be directly hyperthermia.2,hyperthermia in combination with chemotherapy,namely hot chemotherapy, can increase the concentration of the drug within theiABSTRACTtumor, enhance

37、 the anti-tumor effect2; while reducing the toxic effects ofchemotherapy on normal tissues unheated; and hyperthermia in combination withchemotherapy also helps prevent and postpone the development of3.Inaddition, the tumor is located in the central part of the tumor cells in a hypoxic state, not se

38、nsitive to radiation, can not completely be killed after radiotherapy, often a source of tumor recurrence, and hyperthermia for this division was particularly strong role in tumor cells; especially S-phase cells resist radiotherapy are particularly vulnerable to heat killing, therefore, hyperthermia

39、 can make up for lack of radiotherapy, combined with can improve the outcome4. Hyperthermia has become after surgery, radiotherapy, chemotherapy and biological therapy of a new treatment of cancer "green therapy"5, because of its toxic side effects, does not damage the body's normal ti

40、ssue, without destroying their immune system, etc., much of the tumor doctors and patients concerned.Hyperthermia has a long history. Greek physician, the Hippocrates of Cos is the father of modern Western medicine，treatment of cancer with heating methods. He also has a saying: "drugs can not c

41、ure with surgery, surgery can not cure available hyperthermia, hyperthermia can not rule it really can not heal." Austrian physician Julius (Julius Wagner Jauregg) the use of hyperthermia treatment of disease, and thus obtain a 1927 Nobel Prize in Physiology and Medicine.In recent years, many d

42、omestic and foreign scholars in basic and clinical aspects of hyperthermia on tumor cells a lot of research that directly kill cells by hyperthermia effect6, 7, apoptotic effects8, to enhance the efficacy of radiotherapy and chemotherapy9, various mechanisms to stimulate an immune response10 and oth

43、er acts of killing tumor cells. But as a new tumor hyperthermia treatment method has yet to be synergisticmechanism of further research, hyperthermia and other methods of cancer treatmentand how to accurately grasp the parameters of hyperthermiaum kill tumorcells, how to avoid the normal heat damage

44、 and other problems still need to further explore the organization11. Hyperthermia on nasopharyngeal cancer stem cells andits mechanism is poorly researched.EBinfection associated with nasopharyngeal carcinoma (nasopharyngealiiABSTRACTcarcinoma, NPC) is a high incidence in the nasopharynx in souther

45、n China and Southeast Asia poorly differentiated squamous cell carcinoma, age of onset, mostly middle-aged, some young people who are ill. Although research has been a great progress in nasopharyngeal carcinoma, the 5-year survival rate is still hovering at50-60%, not improved radically. The main ca

46、use of treatment failure nasopharyngealdistantCSCs)metastasis and local recurrence12. Cancer stem cells (Cancer stem cells, is the root of tumorigenesis, tumor growth, recurrence, metastasis and to treatment at all. Therefore, in order to obtain the desired anti-cancereffectively remove CSCs is cruc

47、ial. Zhejiang Cancer Hospital in 2011effect,published an article on the experimental study clinical hyperthermia in patients with nasopharyngeal carcinoma noted hyperthermia applied in patients with nasopharyngeal carcinoma, can improve survival in patients with NPC, but uneven heating, how to handl

48、ing after cancer metastasis and the impact on the NPC stem cells are not clear13.Based on the current situation of hyperthermia nasopharyngeal cancer stem cells, the research goal of this paper are: 1, to explore the impact of hyperthermia NPC CSCs and related mechanisms (recent research objectives)

49、. 2, how to further improve hyperthermia NPC CSCs killing effect (recent research objectives). 3, how to achieve the targeted NPC CSCs hyperthermia treatment in the human body (long-term research goal). Let's explore the impact of hyperthermia NPC CSCs and related mechanisms through a separate h

50、eat treatment, and then use the drugs in combination with hyperthermia NPC CSCs to increase the lethal effect, finally achieving the targeted NPC CSCs hyperthermia treatments to make a preliminary outlook.This will in-depth understanding of the molecular mechanisms of the pathogenesis of NPC, tofurt

51、her promote the clinical application of hyperthermia on the theoretical basis ofNPC, has been carrying out research of this subjefollows:Methods：1. In vitro, in vivo validation of the impact of hyperthermia on the NPC CSCsCloning and the use of flat growth curve (CCK8 method) were used to detectiiiA

52、BSTRACTcell proliferation in vitro hyperthermia CNE2 and SUNE1 ability to change, CSC genetic testing, SP cell determination, tumor sphere formation assay in vitro were detected hyperthermia CNE2 and SUNE1 cell tumor stem cell content changes, Subcutaneous tumor formation in nude mice experiments to

53、 detect changes in CNE2 cell proliferation in vitro hyperthermia.（NPC cells in all experiments are appropriate without making hyperthermia treatment as controls）2. Impact of hyperthermia in vitro validation of HCC CSCsCloning and the use of flat growth curve (CCK8 method) were detected in vitro cell

54、 proliferation change hyperthermia 7721 and Huh7, CSC genetic testing, CD133 cell determination, tumor sphere formation assay in vitro were detected hyperthermia 7721 and Huh7 cell tumor stem cell content changes.（HCC cells in all experiments are appropriate without making hyperthermia treatment as

55、controls）3. To investigate the mechanism of hyperthermia killing CSCsThe use of lentiviral vector pLV-Cirbp carrying Cirbp lentiproduction,Viral supernatants were collected were infected NPC cell line CNE2 and SUNE1, 48-72h after the inverted fluorescence microscope to detect EGFP expression was obs

56、erved infection, If the infection efficiency of less than 90%, Application of puromycin to kill EGFP-Puro (-) cells, Stable overexpression Cirbp of EGFP-Puro (+) cells, A large number of expanded cells and conservation；Extraction of RNA, Application of qRT-PCR detection of transgene carrying Cirbp NPC cell lines Cirbp expression levels.Buy four shRNA-Cirbp lentiviral vector from Shandong Victoria really Technology Co., Liposome-mediated transient transfection techniques were four lentiviral shRNA-Cirbp transfected