Lipofectamine2000细胞转染实验步骤注意事项

1、Invitrogen 阳离子转染试剂Lipofectamine 2000 细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen 的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000 是最为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。特点 两个关键性特点使得Lipofectamine 2000 试剂的转染步骤快速简便：（1） DNA阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也 不怕（ 2）转染后不需要除去Lipofecta

2、mine 2000 试剂，无需换培养基操作流程事实上 Lipofectamine 系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及 Lipofectamine 2000，混合2 种稀释液保温20 分钟，加入培养细胞中孵育24 96 小时检测结果。下面是Invitrogen 提供的详细流程和注意事项。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞，使用50膜无血清培养基（如OPTI-MEM培养基）稀释0.8 仙 g-1.0 / DNA 对于每孔细胞，使用 50履OPTI- MEM培养基稀释1-3川LI

3、POFECTAMINE2000试剂。 Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。）注意：即使Lipofectamine 2000 使用OPTI-MEM稀释，细胞也可以使用 D-MEM9养。如果 D-MEMK为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA昆合。混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000 （第3步）。在室温保 温 20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无

4、血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。在37C , 5%的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。在细胞中加入复合物24-72 小时后， 分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备 复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了， 这样进

5、一步减少了转染时间。 这种改进步骤已经过293-H, 293-F, COS-7L和CHOffl胞的试验，同传统方法相 比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine 2000非常适用于96孔板的高通量转染，比如cDNAt库的筛选和蛋白瞬时表达。适用细胞株范围 不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常 常会用到不止一种细胞株，甚至是比较特殊的细胞株。一个转染试剂所适用的细 胞株越多，当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen网站的资料，Lipofectamine 2000已经证实可用于高达517种细胞株，覆盖了相当广的范围。要看看 Lipofect

6、amine 2000是否适用于你现有的细胞株，可以访问以下Invitrogen 网( nes.dsp searchRange)适用的核酸类型和DN秋小 有的转染试剂是为siRNA转染而设计的，有的则是 为DNA专染设计。Lipofectamine 2000可以适用于包括 DNA siRNA, dsRNA,荧 光标记的Oligo, RNA在内的核酸车专染,这使得 Lipofectamine 2000适用范围 非常广泛，无论是基因表达分析的DNA专染，或者是RNAi, Lipofectamine 2000 都能胜任，这样你就不需要为不同目的购买不同试剂了。值得注意的是，最常用的DNA专染中有一个D

7、N砍小的问题，太大的质粒不那么好转。我们暂时还没有 找至U Lipofectamine 2000 相应的资料。用量和价格 好东西往往不便宜。可是在实验室中，价格往往是最具有杀伤力的。 Lipofectamine 2000 用的剂量大吗？价格如何？根据说明书，24孔板转染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000 大约可做750次24孔板转染，或者大 约150次6孔板转染，而1.5ml Lipofectamine 2000当前市场价格4667元，0.75ml 价格是2798元(可以磨到多少折扣就要看你的侃价功力了)。平均下来，再算 上折扣，Lipofectamine 20

8、00 性价比还是挺高的。注意事项Lipofectamine 2000 要求细胞铺板密度较高，以 90%-95%&佳，这有 助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。Lipofectamine 2000 可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基，使得操作方便了许多，但是要 注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNAffi转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无 血清培养基是否能和 Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293,SFMII, VP-SFM 就不行。此外还应该留意，如果你研究的基因要求比较长的

9、表达时间，比如细胞周期相关基因，或者时细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密较低的转染试剂，不适合用 Lipofectamine 2000 。对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化DN砥度和阳离子脂质体试剂量以得到最 大的转染效率。DNAF口转染试剂的比伤通常推荐是1:2或者1:3,优化可以从 0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只 要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA1就可以了。还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素， 比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了

10、细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样， 在转染前就不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN4择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保 证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。阳离子脂质体应该在4 度保存， 要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。当然还有要注意质粒的质量，质粒的内毒素是转染的大敌，Invitrogen 自然是大力推荐自家的质粒纯化产品啦，这个嘛，看看生物通前面的质粒纯化专题有特别介绍

11、就好啦。Lipofectamine 2000 CD 和 Optifect作为一个新产品，Lipofectamine 2000 CD 当然应该有区别于原来的Lipofectamine 2000 。这个 1ml 就要卖到5000多块的新产品好在哪里？主要是由于不采用动物来源的材料，可以满足某些特殊要求，比如要求不含动物来源材料等。 其他优缺点和Lipofectamine 2000 差不多。 以 24孔板计算，一次 2ul,1ml足够 500 次转染，但价格不便宜，要5000 多元。Optifect 主要是为在较低铺板密度条件下转染而设计的，比如细胞增埴相关基因和细胞周期相关基因的表达和研究往往要求

12、较长的表达周期，细胞表面蛋白的表达和研究、还有部分高通量筛选等等也要求在较低铺板密度条件下转染，由于Lipofectamine 2000 要求转染时90 95汇片而不太适合，Optifect 就是一个选择。 Optifect 最佳的铺板密度是30 -70%，其他的操作和注意事项也和Lipofectamine 2000 相近。同样可以直接加入细胞培养物中，转染前后都不需要更换血清，同样不要加抗生素，等等。1ml 价格是3616，用量相对高一些，24孔板一次需要3 4ul ， 6 孔板就要用到15 24ul/ 次，每次算下来就比前面的贵了。三、闻道有先后，术业有专攻，Invitrogen 的其他几

13、个当家花旦LIPOFECTAMINE PLU舆老版LIPOFECTAMIN的改良版。力口入 PLUSM齐后会导致在广泛条件下的高活性，不需要进行细节优化就可以进行高活性转染了。实验步骤同样很简单，细胞铺板密度以转染当天汇合度至70%到 90%为宜。DMRIE-C转染悬浮细胞效率最高，如Jurkat细胞以及其他淋巴细胞来源的细胞 系。也可以用来转染摇瓶中使用 CDCHOW养基培养的悬浮CHOffl胞，易于放大。 另外建议用DMRIE-C RNA专染入贴壁细月fi0它比使用 LIPOFECTIN转染RNA1 BHK-21细胞的表达水平高。CELLFECTIN转染昆虫细胞的首选，特别是于昆虫基因表达

14、中生产杆状病毒的Sf9 和 Sf21 细胞以及果蝇细胞。LIPOFECTIN已经成功用于人类和非人类内皮细胞的瞬时转染。除了质粒DNA专染外，使用LIPOFECTIN&可以将RNA寡聚核甘酸，酵母人工染色体和蛋白转 入多种细胞系。四、 阳离子转染试剂的一些注意事项（Invitrogen 提供）有血清时的转染：血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。阳离子脂质体和DNA勺最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比

15、较敏感的细胞，可以使用 OPTI-MEM培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 200。 0培养基中的抗生素：抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN择性抗生素的竞争性抑制剂。 另外， 为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使

16、用比含血清培养基更少的抗生素量。细胞维护和培养的演变：可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次，不要使细胞保持融合超过24 小时。大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。 这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代 8 次的细胞表现出更高的转染效率。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。 因此， 如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞

17、以恢复最佳结果。细胞铺板密度： 用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时，贴壁细胞密度为 70%-90%悬浮细月fi密度为2X106-4X106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感， 所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺板密度最高的，CAT舌性也最高，试剂的量也相应增加。这些结果说明，对于转染相 同量的DN厮需的最佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而异。启动子的选择： 获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白

18、。CMVS动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子，如SV40和RSVffi比，在BHK-21中其活性最高。这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA 可以激活Jurkat细胞中CMVS动子，而单PMAft足以激活KG1和K562 （人骨髓 瘤白细胞）中的CMVI动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原（存在于COS-1 和COS-7时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。DNA1:高质量的DNA寸于进行高效的转染至关重要。瞬时和稳定表达：DNA专染后，转入基因的表达可以在1 4天内检测到。仅有 一部分转入

19、细胞的DNA®转运到细胞核内进彳T转录并最终输出 mRNA细胞质进 行蛋白合成。几天内，大部分外源DN心被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释； 一 周后就检测不到其存在了。瞬时表达分析检测非重组质粒DNA1基因的表达。因 此， 表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA®入效率和表达水平在不同实验中差异较大， 实验必须很小心。为了进行稳定表达，转入的基因必须能和细胞同步复制。在转染的质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此。在一小部分转染的细胞中，加入的DNAffi过重组整合到基因组上。包含整合DNA勺细胞很少，必须通过对

20、药物的抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定。稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需的时间更长。但得到的细胞系可以做为蛋白生产的稳定来源或用于得到转基因动物。瞬时转染和转染效率的监测： 基因的瞬时表达在24-72 小时内就结束了。这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目的细胞中不含此蛋白或水平很低。常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（CAT ,绿色荧光蛋白（GFP ,荧光素 酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖甘酶（b-gal ）。可以使用简单的非同位素方法 检测b-gal的表达以测定转染效率和活性。pCM

21、V-SPORT- bga质粒包含CMVn 动子调控下的LacZ基因，转染入真核细胞内后可以直接表达 bgal。结合简单的 检测步骤，可以做为监测转染条件的一种方便灵敏的方法。稳定转染细胞系的筛选： 连同带有药物抗性的筛选标记基因一起转染目的基因是建立稳定转染细胞系最常用的方法。氨基糖甘磷酸转移酶基因（APH£ neor）可 以合成APHB,通过磷酸化使药物失活，从而提供对GENETCI选择性抗生素（G418 Sulfate ）的抗性。抗生素抗性基因可以与目的基因在同一个质粒上，也可以在不同的质粒上。如果两个不同的质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子。 对于两种不同质粒的共转

22、染，带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为3:1 或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。瞬时转染效率的改进一般也会提高稳定转染效率。比如，使用LIPOFECTAMINELUS式齐I得到的NIH 3T3细胞GENETICING生素抗性克隆的数目比单独使用 LIPOFECTAMINE力口了大 约 3 倍。要进行稳定的表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力。生长的细胞比不分裂的细胞更快的受到GENETICING生素的影响。转染后，在开始筛选前等待 48-72小时，使细胞表达足够量的抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护。转染后 48-72 小时倒

23、掉培养基，加入含有GENETICIN%生素的培养基，抗生素的浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞。因为许多因子影响到筛选所需的 GENETICING生素的最佳 浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量 反应曲线，确定最佳浓度。筛选可能需要较长时间，因为在致死剂量的GENETICIN 抗生素存在条件下，细胞会分裂1-2次。在维持培养细胞时使用较低剂量的抗生 素，一般是筛选剂量的一半。筛选后的细胞一般是离散的克隆， 根据实验目的不 同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆的计数。蛋白表达和培养基的选择：哺乳动物细胞系合成可溶的，翻译后修饰

24、的蛋白，比 细菌，真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有可能有生物活性。稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达， 迅速地合成小量蛋白。常 用的细胞系包括 CHO293和COS-%Invitrogen 提供克隆的293-F , 293-H, COS-7 和CHO-SM胞，来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基。重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中 进行。这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白。使用基质珠做为固相支持可 以使贴壁细胞悬浮生长。用于蛋白生产的细胞的转染可以在添加有血清或无血清 培养基中进行。但更倾向于使用无血清培养基

25、表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白的纯化。无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血 清培养基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培 养基低得多）。无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化学成分的培养基不含有蛋白或未知组成的成分。多种多样的配方使您可以选择最适 合您应用的一种。在含血清时转染的细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分的培养基。在部分情况下（如293-F, 293-H, COS-井口 CHO-S , 对于已适应无血清或无蛋白培养基的细胞，可以使用其培养基进行转染。其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染的成

26、分。在这些情况下，有必要在诸如 D-MEME OPTI-MEM 等培养基 中进行培养和转染.转染FAQs针对同种阳离子脂质体的疑难解答Q1:转染效率低A1:1）没有使用优化的阳离子脂质体试剂。解决建议：选择针对您的细胞类型转 染效率可能最高的阳离子脂质体试剂。 参见附录A或网站（ ） 上“Transfection Collection ”中的参考文献列表。2）没有使用优化条件。解决建议：优化阳离子脂质体试剂和 DNA勺量。参见第7 章优化步骤。参见网站（ 在Tech-online 分子生物学部分） 上的细胞特异性的转染步骤。3）DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。解决建议：在复

27、合体形 成时不要使用血清。OPTI-MEMI培养基和DMEMI用于复合体形成的较好的培养 基。如果使用含有血清的培养基进行转染，保证在无血清条件形成复合物。注意： 不要将OPTI-MEM I培养基用于LIPOFECTAMINE PLUS剂或昆虫细胞。对于 Sf9 和Sf21细胞，Sf- 900II SFM会得到最佳结果。4）存在抑制剂。解决建议：不要在用于制备DNA阳离子脂质体复合物的培养基 中使用抗生素，EDTA柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI硫酸软骨素，透明质酸，硫酸 葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。5) 不恰当的细胞密度。解决建议: 细胞密度应该在转染时融合度为70%-90%。6)转染DNA勺启动子

28、-增强子没有被宿主细胞识别。解决建议：确保转染DNA勺启动子 - 增强子同目的细胞类型兼容。7) 阳离子脂质体试剂冻结。解决建议: 不要使用冻结的或储存温度低于4的阳离子脂质体试剂。8) 转染分析的问题。解决建议: 转染分析中加入阳性对照。9) 质粒纯化的问题。解决建议: 请核对是否使用转染级的质粒纯化试剂盒。通常转染级的质粒纯化试剂盒使用 DEAEW脂而非硅树脂，并且最好是用重力流动(过滤) 的方法而不是离心技术，因为树脂带来的污染会导致较高的内毒素。另一种方法(可用于任何级别的纯化试剂盒)，是在最后一步从树脂柱上洗脱质粒后，将溶液置于55的水浴上保温5 分钟。 最后小心地从上至下吸取2/3

29、 的溶液 (不要碰到底部)使用。这是减少树脂的交叉污染的方法。Q2:细胞死亡率高。A2:1)DNA量太高。 解决建议：作一个剂量-反应曲线以确定最佳的DNA1。在剂 量-反应转染中加入阳离子脂质体试剂，因为单独DN岫会对细胞生长有一个基础的影响。参见第7 章微调优化方法。2) 阳离子脂质体试剂量太高。解决建议: 作一个剂量- 反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。在剂量-反应转染中加入DNA因为单独阳离子脂质体试剂也只对细胞生长有一个基础的影响。参见第7 章微调优化方法。3) 在转染过程中使用抗菌素。解决建议: 在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。

30、4) 细胞太少。解决建议: 作一个剂量- 反应曲线以确定每个转染过程中最佳的细胞数量。根据您的应用所要求的效率调整细胞数量。5)在无血清条件下细胞活性降低。解决建议：使用OPTI-MEM培养基。降低或省去在无血清培养基中清洗的次数。在转染培养基中使用5%到 10%的血清。确保在不存在血清的条件下形成复合物。6) 阳离子脂质体试剂氧化了。解决建议 : 不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂；这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。7) 对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快。解决建议: 在加入筛选性抗生素前至少预留 48 小时使细胞表达抗性基因。Q3:阳离子脂质体试剂-DNA复合物沉淀。注意：在显微静下可以在细胞上观察到 小的颗粒状颗粒沉淀。这是正常的。此