Gpnmb在急性肾缺血再灌注损伤肾脏和抗原提呈细胞的表达VIP

1、Gpnmbfc急性肾缺血再灌注损伤肾脏和抗原提呈细胞的表达急性肾损伤(acute kidney injury, AKI) 是临床常见病症 ,具有高患病率和死亡率。 AKI 发病机制复杂, 炎症和免疫反应在AKI 的病理生理进展中起重要作用。巨噬细胞(macrophages, M小)和树突状细胞(dendritic cells, DC) 均为抗 原提呈细胞(antigen presenting cells, APC),是炎症和免疫反应系统中的重要 成员。有研究证明在 AKI肾脏中,M中浸润至肾髓质，它既可引起肾脏损伤，也能促进肾组织修复, 但它所起的具体作用还不完全清楚。 在临床上 , 缺乏早期

2、诊断指标致使诊断及治疗延迟是AKI 至今死亡率仍高的一个重要原因。 目前最常用的检测指标是血肌酐(serum creatinine, SCr) 、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)及血清肌酐清除率(creatinine clearance rate, CCR), 它们检测 AKI 的特异性和敏感性都不高。我们以前的研究发现肾脏损伤分子-1(kidney injury molecule-1, Kim-1)是一个高特异性的 AKI 检测指标。 有报导认为中性白细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin

3、, NGAL), 白介素 -18(interleukin-18, IL-18) 和脂肪酸结合蛋白 (fatty acid binding protein,FABP也可以作为AKI的检测指标。但所有这些标志物尚处于评估阶段，距临床应 用仍有一段距离。所以 , 目前仍然缺乏一个或一组高特异性高敏感性的指标可早期诊断AKI,并指导后续治疗非转移性黑色素瘤糖蛋白 (glycoprotein non-metastaticmelanomab, Gpnmb是一种I型跨膜糖蛋白。它又称为造血生长因子诱导的神经、树突状激肽 (hematopoietic growth factor inducible neuro

4、kinin, HGFIN) 细胞相关的硫酸肝素糖蛋白整合素 (dendritic cell-associated heparinsulfate proteoglycan-dependent integrin ligand DC-HIL) 、骨激肽 (osteoactivin,OA)。它的胞外段包括一个肝素结合域、一个整合素精氨酸甘氨酸门冬氨酸基序、以及一个多囊肾序列。GpnmbE多种组织细胞中表达，如胚胎神经系统、胚胎肾单位、皮肤基底层、 毛囊生发细胞、成骨细胞、破骨细胞、MW、视网膜色素上皮细胞和 DC近年来 的研究表明，Gpnmb可能才制MD的炎症反应和T淋巴细胞的活化，但它是否在急 性肾

5、损伤中起作用目前还不清楚。 缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion, I/R)是引起 AKI 是常见原因之一。急性肾 I/R 动物模型是长期公认的 AKI 模型。 我们以前的研究对小鼠和大鼠I/R模型肾脏进行表达性差异显示分析，发现GpnmbS因在急性I/R模型肾脏中 升高明显，而GpnmbS受损肾脏中的具体表达位置并不清楚。有体外研究表明 GpnmbS因在MO和DC中表达,GpnmbS白分为膜型和分泌型，但Gpnmbfc尿液中 的表达情况目前尚无报导。所以我们进一步检测Gpnmbfc急性肾I/R动物模型肾脏和尿液中的表达水平 以期能更深入了解AKI 损伤和修复的机制 , 也

6、同时寻求更实用的 AKI 早期诊断指标；并在体外实验中，进一步探讨GpnmbE APC及肾脏细胞中的表达特点。本论 文分为两部分：第一部分为体内实验, 建立小鼠和大鼠急性肾I/R 模型 , 应用Northern blot 、实时荧光定量PCR(quantitative ploymerase chain reaction,qPCR).原位杂交、免疫荧光染色及流式细胞仪等技术，观察对照组和I/R组动物 肾脏中Gpnmbfe达水平,并用免疫荧双染色对Gpnmbfc肾脏的表达进行定位，同时 用Western blot检测Gpnmbfc对照组和I/R组动物尿液中的表达。第二部分为体外实验 , 原代培养小

7、鼠和大鼠骨髓源性巨噬细胞（bone marrow derivedmacrophages, BMMcp）和小鼠骨髓源卜t树突状细胞（bone marrow derived dendritic cells, BMDC）,并结合小鼠巨噬细胞株（RAW264.7细胞），观察Gpnmb在APC （M6和DC）的表达特点，并对其作用进行初步探讨。我们还原代培养了小鼠和大鼠近端肾小管上皮细胞（proximal tubularepithelial cells, PTC）, 并利用不同种属不同肾小管节段的细胞株（如 LLC-PK1、NRK 52b MDCKMIMCD3）人肾胚胎细胞株（293）及人肾癌细胞株（7

8、69-p）,研究 Gpnmb否在肾小管上皮细胞、肾癌细胞及肾胚胎细胞表达。目的：建立小鼠和 大鼠急性肾I/R模型，观察在对照组和I/R组动物肾脏中GpnmmRNA口蛋白表达 水平（体内实验），并通过原代培养BMM , BMDC口 PTC及巨噬细胞株及各种肾小 管上皮细胞株、肾癌细胞株及肾胚胎细胞株（体外实验），观察Gpnmta些细胞中 的表达特点，初步探讨Gpnmb勺作用。方法：1、建立小鼠和大鼠急性肾I/R模型： I/R 组小鼠和大鼠予以双侧肾蒂钳夹阻断血流30 分钟 , 对照组 （ 即假手术组） 仅切开皮肤和肌肉 , 不作肾蒂血管钳夹。分别于术后第1、 2、 3、 4、 5、 7、 14

9、天处死小鼠和大鼠。留取尿液和血液,收集处理肾组织标本。通过检测血. 肌酐 , 观察，肾织织光镜形态学及Kim-1 和vimentin 的免疫荧光染色对I/R 模型进行览鉴定。2、检测Gpnmbt对照组和I/R组肾脏及尿液中的表达：采用Northern blot, qPC谕测Gpnmb勺mRNAt达水平；采用原位杂交定位 Gpnmb mRNA肾脏中的 表达部位；采用免疫荧光染色观察 Gpnmbg白在I/R组肾脏中表达的动态变化； 采用免疫荧光双染色及流式细胞技术进一步确定GpnmbE I/R组肾组织中APC（M小和DC）ffiT淋巴细胞上的表达，并通过Western blot检测Gpnmbt对照

10、组和I/R组尿液中的表达。3、原代培养小鼠和大鼠BMMc咂过免疫荧光染色和流式细胞 仪检测MD表面标志物（小鼠：F4/80和CD11b大鼠：CD68）,来验证BMMc用1养 成功与否。通过以上技术检测 Gpnmbfc BMMcp勺表达。然后用不同细胞因子将 BMMc例激分化成M1型和M2型BMMcp®过检测M1 型和M2型M通的表面标志物及所表达细胞因子,来验证M1型和M2型BMMc分 化成功与否。再通过免疫荧光染色、流式细胞仪、Western blot及ELISA等技术检测GpnmbS M1型和M2型BMMc麦达的特点。4、培养小鼠巨噬细胞株 （RAW264.7），分成两组：一组用

11、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS） 处理24小时 （LPS组），另一组不用LPS处理（对照组），采用qPCR. Western blot及ELISA等 技术，观察GpnmbS LPS组及对照组RAW264.7M胞中的表达特点。5、原代培养小鼠BMDQt长过免疫荧光染色和流式细胞仪检测小鼠 DC的表面 标志物（CDllc）,来验证BMDCS养成功与否。再通过同样方法检测 GpnmbS小鼠 BMDCP的表达。6、原代培养小鼠和大鼠PTC并培养各不同种属不同节段肾小 管的细胞株（如LLC-PK1、NRK52e、MDCK MIMCD3）人肾胚胎细胞株（293）及人 肾癌细胞株（7

12、69-P）,通过qPCRt免疫荧光染色检测Gpnmbfc以上细胞的表达。用红色荧光标记的Gpnmb （Gpnmb-Fc-Cy3处理原代培养的小鼠和大鼠 PTC, 检测PTC是否结合或吞噬外源性的Gpnmb结果：1、小鼠和大鼠急性肾I/R模 型建立成功：（1）SCr：与对照组相比，I/R组小鼠和大鼠SCr在术后第1天明显 升高 , 于第 2 天起下降 , 至第 7 天基本恢复到正常水平。 （2） 光镜 （HE 染色 ） ：对照 组肾脏组织结构基本正常,I/R 组肾组织可见肾小管肿胀、 坏死、 脱落 , 管腔扩张 ,肾间质炎性细胞浸润。（3）Kim-1（ 免疫荧光染色） ：对照组肾脏组织中 ,Ki

13、m-1 很少表达；在I/R 组肾组织 ,Kim-1 表达升高。 （4） Vimentin（ 免疫荧光染色） ：对照组肾脏组织中,Vimentin很少表达，I/R组肾组织,Vimentin表达升高。2、Gpnmbft小鼠和大 鼠急性肾I/R模型中的表达升高；（1）Northern blot 、qPCRffi原位杂交结果示： 对照组大鼠肾脏中Gpnmb mRNA达低，而在I/R组大鼠肾脏中Gpnmb mRNA表 达显著增高。Gpnmb mRNA要表达在肾髓质外部外缘 （outer stripe of outer medulla, OSOM浸润细胞中。（2）免疫荧光染色和流式细胞仪结果示：对照组大鼠

14、肾脏 中,Gpnmb®白表达低，而在I/R组大鼠肾脏中明湿增多。Gpnmbfc要表达在OSOM 的浸润细胞中。I/R损伤第2天的肾脏中，Gpnmb名田胞位丁 OSOM5肾间质中，至I/R损伤第4 天，大部分Gpnmb细胞进入了 OSOMm小管管腔内。肾小球和肾小管上皮细胞 未见 Gpnmbg达。Gpnmbf MD 标志物 F4/80、CD68, MHC-I CD8物共表达； （7）Western blot 结果示：对照组小鼠尿液中 Gpnmb1达水平很低，而I/R组小 鼠的尿液，Gpnmbft术后第1天和第2天表达明显升高，第3天恢复到正常水平。3、Gpnmbfc原代培养的小鼠和大鼠

15、BMM中表达：（1）免疫荧光染色结果示： 小鼠BMM中Gpnmbt F4/80共表达;大鼠BMM中,Gpnmb与CD6瞰表达。（2） 流式细胞仪结果示：原代培养小鼠BMM中有94.7 ±6.1%细胞表达CD11b在CD llb+BMM（|）中 GpnmbB性率为 75.1 ± 4.8%。（3）MO型 BMM （未分化型）和 M2型 BMM的GpnmbS表达量没有差别，但M1型BMMc酌Gpnmbg达总量增多。相对于M2型BMM , Ml型BMM细胞培养液中Gpnmbg达高,而细胞蛋白裂 解液中的表达较少。根据 Gpnmbfc BMM的表达特点，BMMcp可分为三种类型： G

16、pnmb BMM;小单核 Gpnmb+BMM 大多核 Gpnmb+BMM1 4、Gpnmbfc RAW264.7 巨噬细胞株表达：(1)qPCR和Western blot结果示，相对于对照组，Gpnmb mRNA 表达和蛋白表达在LPS组增高(p<0.05)。(2)免疫荧光染色结果示，有三种类型的RAW2647田月fi: Gpnmb- RAW264.7 细胞；小单核 Gpnmb+RAW264细胞；大多核 Gpnmb+RAW264细胞。在对照组 中,Gpnmb表达在细胞核周围：在 LPS组中，小单核Gpnmb+RAW264细胞的 Gpnmbfe进入细月fi内小泡，经细胞膜释放到细胞

17、外；而在大多核 Gpnmb+RAW264.7 细胞中Gpnmb勺表达仍在细胞核周围。5、Gpnmbfc原代培养的小鼠BMDCfe达： (1)免疫荧光染色显示，我们培养的细胞中大部分表达 CD11c, Gpnmbtf CD11cW 共表达。(2) 流式细胞仪结果示, 在我们培养的细胞中 , 有 70.28 ± 8.25%细胞为CD11c阳性；33.51 ±2.32%CD11c细胞为GpnmtTO性6、Gpnmbt原代培养的小鼠和大 鼠PTC各肾细胞株表达很低：(1)相对于RAW264.70胞,Gpnmb mRNAE原代培 养PTC及各肾小管细胞株(如LLC-PK1 NRK 52e MDCK. MIMCD3)人肾胚胎细胞 株 (293) 及