亚低温对局灶脑缺血再灌注后脑血流、血脑屏障、神经细胞损伤作用(精)

1、亚低温对局灶脑缺血再灌注后脑血流、 血脑屏障、神经细胞损伤作用的研究【摘要】 目的 对比研究不同时期亚低温(MHT 32C0.2C)对局灶脑缺血再灌注损伤的作用。 方法 64 只雄性 SD 鼠被随机分成常温(NT)、缺血期亚低温(MHTi)、 再灌注期亚低温(MHTr)、 缺血期加再灌注期亚低温 (MHTi+r)四组，并用改良 Koizumis 局灶脑缺血模型，分别观察了动物缺血 3 小时再灌注 3 小时过程中，缺血周边和核心区局部脑血流(rCBF)改变，再灌注3小时后血脑屏障(BBB)破坏及再灌注72小时后缺血梗塞灶体积。 结果 MHTi+r及MHTi均有改善缺血周边区再灌注后急性高灌注和继

2、发低灌流及核心区持续低灌流、减轻血脑屏障破坏、减少缺血梗塞灶体积的作用。该作用 尤以 MHTi+r为明显。MHTr 作用有限。结论 MHTi+r 对皮层的保护作用较 MHTi 好。 由此可推知，局灶脑缺血再灌注损伤是个持续的过程，亚低温治疗不但要考虑开始时间，其持续时间对疗效具有同样重要价值。【关键词】 脑缺血再灌注损伤亚低温The effect of mild hypothermia on cerebral blood flow blood-brain barrier and infarct volume after focal cerebral ischemia and reperfusi

3、onin r atsHUANG Fengping, ZHOU Lia ngfu.Dept. of Neurosurgery of HuaShan H os pital, SMU, Shanghai 200040【Abstract 】 Objective To compare the effects of mild hypothermia(MHT 32C0.2C) induced in different time courses of cere bra l ischemia and reperfusion.Methods 64 male SD r a ts weredivided into t

4、hree mild hypothermic groups, which in clud ing in tra- ische mi a(MHTi),in tra-reperfusi on(M HTr), in tra- ischemia/reperfusio n(MHTi+r) group, an d one normothermic group(NT 37C0.2C) as control. Reversible focal ischemia wa s carriedout in rats with modified Koizumis model. Cortical blood flow wa

5、s meas ured duri ng3hr of ischemia followi ng 3hr of reperfusi on. The permeability of bl ood-bra inbarrier(BBB) was estimated after 3hr of ischemia and 3hr of reperfusi o n. The infarctvolume was measured at 72hr after reprefusi on. Res ults The acute postischemichyperperfusi on and delayed hypoper

6、fusi on in ischemic perifocal regi on and sustained hypoperfusi on in ischemic core were inhi bit ed in both MHTi+r and MHTi groups.The disruption of BBB and the infarct volume in the basal ganglia and cortex regionswere significantly less in both MHTi+r a nd MHTi groups, especially in the MHTi+rgro

7、up. The effect of MHTr on prolonged ischemia/reperfusion injury was limited.Conclusion This study demonstrated that MHTi+r has more substantial protectiveeffects on reduc ing ischemia/reperfusion injury than MHTi. These differencesbetween MHTi and MH Ti+r suggest that ischemic and reperfusional inju

8、ry is anongoing process, and t he concept of MHT therapeutic window must include not onlythe time of initiating but also the duration of the intervention.【Key words 】 Focal cerebral ischemia Reperfusion injury Mild hypothermia脑缺血后再灌注的作用已被广泛研究。短期缺血后再灌注有减轻缺血损伤 的 作用，长时间的缺血后再灌注可导致急性高灌注和 (或) 继发持续低灌流、加 剧血

9、脑屏障破坏 和脑水肿、加重脑缺血损伤1。近期研究表明，缺血期亚低 温有抑制缺血后过度 灌注、减轻神经细胞损伤的作用2。但是，采取缺血期 持续至再灌注期的亚低温 对缺血再灌注后脑血流改变、血脑屏障破坏及神经细 胞损伤的影响却未见报道。本研究用 SD 鼠改良 Koizumis:局灶脑缺血模型，通过测量局部脑血流 (CBF)、血脑屏障(BBB)及梗塞灶体积，对比研究缺血期(MHTi),再灌注期 (MHTr)及缺血期加再灌注期(MHTi + r)亚低温(mild hypother mia MHT322)对 局灶脑缺血再灌注损伤的作用。材料和方法1. 动物准备：雄性 SD 鼠，体重 280310g。实验

10、时动物行气管插管，呼吸机(rod ent ventilator model 683. Harvard USA)吸入 0.5%1%异氟醚与7O%!2O 30%O 勺混合气体维持麻醉。PE50 管行右侧股动脉插管，以连续监测 血压，并于缺血前 5 分钟、缺血后 9 0 分钟、再灌注后 90 分钟抽血，做血气、 血糖测定，以利调整呼吸机。测体温探头经肛门插 入，并与自动控温仪相连 (MTA-4702,Meditherm Gaymar Inc. USA)以控制体温在 32C或 37C。2. 动物模型： 实验采用改良 Koizumis 大鼠大脑中动脉(MCA)局灶缺血模型3。缺血时间为 3 小时，再灌注

11、时间为 3 小时或 72 小时。3. 脑温的测定和维持：脑温用硬膜外温(EDT)间接反映。切开右侧头皮，于前囱右旁3mn前1 mm处钻孔， 于硬膜外内扳下间隙插入 26G测温探头(E-type OmegaEngineering Inc. USA)并与测温仪(450 AET Omega)连接。EDT 维持在37C者为常温组，32C者为亚低温组。脑温的 升降及维持，采用 60W 白炽灯加 热、冰袋降温、调节自动控温仪来完成。4. 实验动物分组： 实验分常温组 (NT) 、缺血期亚低温组 (MHTi) 、再灌注期 亚低温组 (MHTr) 、缺血期持续至再灌注期亚低温组 (MHTir) 四组，每组动物

12、 16 只。其中 8 只大鼠缺血 3 小时 再灌注 3 小时后处死行 BBB 破坏体积测定， 另 8 只缺血 3小时再灌注 3 小时过程中行 CBF 测定，再 灌注 72 小时后动物处 死，行梗塞灶测定。5. 梗塞灶测定：动物麻醉断头取脑，冠状切片层厚 2mm 2%TT(磷酸缓冲液(pH7.4)37C恒 温染色 30 分钟，4%Formalin 缓冲液(DBpH7.4)固定 30 分钟后 拍照留用。梗塞灶体积计算用电 脑完成 (Medical Image Processing System ，FG-100 Series. Imag ing Tech no loyg In c. USA)6. 局

13、部脑血流量测定：用激光多普勒血流测定仪（LDF： MultichannelLaser Doppler Syst em, Perimed Sweden），分别测定实验侧前囱后 1mm 旁开 5mm 和 1mm 两点（该两点分别代表本 实验模型缺血灶的核心区及周边区:4） 脑皮层表面血流。以缺血前 CBF 为基值，缺血期、再灌注期各点 CBF 值为基值 的百分比。7. BBB 测定：本实验组动物，在实验结束前 3 小时，经静脉注入 3%Evans蓝 Krebs 平衡液 0.5 ml，实验结束时，加深动物麻醉，先用100ml 肝素盐水（肝素 100mg/L）心内灌注冲洗，再用 4%多聚甲醛磷酸缓冲液

14、（pH7.4）灌注固定 20分钟，取脑冠状切片，层厚 2mm 拍照留用。BBB 破坏程度以 Evens 蓝渗 漏出血管壁而着色的脑组织体积表示，具体计算方法同梗塞灶体积测定。8. 统计学处理：各组间 CBF 值比较，用配对资料 t 检验；各组间 BBB 和W值比较，用非配 对资料 t 检验。各数值均用 mea SD 表示，Pv0.05 示差别 显著。1. 亚低温对生理指标影响： 在整个实验过程中各生理指标包括血压、血 气、血糖均控制在正常范围内。 虽然各组实验动物缺血开始后平均动脉压均有 不同程度下降，但下 降后的平均动脉压值仍维持在正常生理范围内，各实验组 间，生理指标统计无差异。2. 亚低

15、温对脑血流的影响：缺血开始后，各实验动物 CBF 值均迅速下降，20 分钟后趋于稳定。其中缺血周边区平均下降至缺血前的12%- 30%核心区降至 8%-15%各实验组缺血周边 和核心区 CBFfi无显著差异。再灌流后，在 缺血周边区，MHTr 和 NT 组可见明显的急性高灌注 和继发低灌流；MHTi+r 组维 持在 87%-103%之间；MHTi 组再灌注早期 CBF 变化与 MHTi+r 组相似，再灌注 2 小时后 CBF明显下降，与 MHTi+r 组比 Pv0.05。在缺血核心区，MHTr 和 NT 组再 灌注后则表现为持续低灌流。尤其是 NT 组，再灌注后 CBFfi尚不到缺血 前的 3

16、0% MHTi 组再 灌注 1 小后 CBF 下降至 61% 16%与对照组相比 Pv0.05， 与 MHTi+r 组比无显著差异。3. 亚低温对血脑屏障的影响：4 个实验组共 8 只假手术动物中，除 1 只因 钻孔放置硬膜外测温探头时，误伤皮层造成该皮层区点状 Eve ns blue 浓染 外，余 7 只动物脑组织均无染色，因此 ，亚低温并不影响正常 BBB 的通透性。 但各实验组间，BBB通透性差异明显（1）。1 各组动物血脑屏障破坏及分布情况*Pv0.05 vs NT,+Pv0.05 vs MHTra Pv0.05 vs MHTi4.亚低温对缺血梗塞灶的影响： 实验 72 小时内，MHT

17、i+r 组和 MHTi 组无一 例动物死亡，MHTr 组死 亡 1 例，NT 组死亡 2 例。尸体解剖示 3 例均死于脑肿 胀。且MHTi+r 和 MHTi 组梗塞灶体积明显较 N T 和 MHTr 组小 。2各组动物 72 小时后皮层，基底节及总的缺血梗塞灶体积*Pv0.01 vs NT,+Pv0.05 vs MHTr a Pv0.05 vs MHTi讨论本实验证实，MHTi 和 MHTi+r 有减轻局灶脑缺血再灌注后神经元损伤、BBB破坏、C BF 紊乱的作用，MHTi 对局灶脑缺血再灌注损伤的保护作用，在不同的 缺血模型中均得到证实 a5 0MHTi+r 的作用却未见报道。从临床角度看，

18、降 温麻醉 (如脑、心脏等手 术)经常形成于手术开始之前，并维持到手术结束，复 温是个缓慢、渐进过程；颅脑外伤病 人亚低温治疗初步结果提示，持续 24 小 时以上的亚低温治疗效果明显，且不增加出凝血障碍 、脑内出血、感染等并发 症。因此，MHTi+r 作用的研究， 对临床上开展亚低温 治疗具有重要意义。本实验第一次对比研究 MHTi 和 MHTi+r的作用，发现 MHTi+r 具有明显地 减轻 脑缺血损伤作用，且其作用较 MHTi 更显著，尤其是对皮层损伤的保护作用。从 本实验结果看，单纯的 MHTr 对梗塞灶大小并无明显的保护作用，这与 Xue 等5实验结果相反0结果不同原因，可能与梗塞灶计

19、算时间不同有关0研究证 明脑缺血再灌注损伤是慢性、进 行性的，低温可延缓脑梗塞发生，一般到实验 后 72 小时，脑梗塞才定型70Xue 等 在实验 6 小时后即计算梗塞灶体积，显 然较实际小，不能真实反映脑缺血再灌注损伤程度及 亚低温的作用0局部脑血流的改变，是脑缺血和再灌注损伤的根本原因0局部脑组织血供 的下降，使该部分 脑组织能量代谢障碍，各种能量依赖型的离子通道功能 失 调，进而引发多种神经递质的大 量释放、调节酶失衡、自由基生成、细胞膜破 坏、蛋白质合成障碍，最终导致神经细胞的急性或慢性死亡80缺血后再灌注早期的急性高灌注，会加剧血脑屏障破坏和脑水 肿，是再灌注后继发性脑损 伤的重要因

20、素40再灌注后持续低灌流对脑缺血再灌 注损伤的直接作用目前 尚不明确，但干扰药物实验表明，抑制持续低灌流能明显减小脑缺血 梗塞灶体 积90因此改善缺血脑组织血供，抑制再灌注后急性高灌注和持续低灌 流， 是预防治疗脑缺血再灌注损伤的关键。本实验结果证实，MHTi 和 MHTi+r，尤其是后者， 明显具有抑制再灌注后的急性高灌注和继发低灌流，改善持续低灌流 的作用0血脑屏障破坏是血管内血清蛋白，水分及各种有害物质外渗，继发血管性 脑水肿和脑实质损 伤的基础100Dietrich 等11用全脑暂时性缺血模型证 实，MHTi(3 0C33C)能有效降低缺血再灌注后血脑屏障对辣根过氧化酶的通 透性。本实

21、验用局灶脑缺血模型也得出了同样结论。同时还发现，MHTi+r 对血脑屏障，尤其是皮层血脑屏障的保护作用较 MHTi 更明显(1)。研究证实，血脑屏障通透性的增加与各种原因引起的缺血后高灌注 有关，阻止高灌注的发 生，就能明显抑制血脑屏障的破坏和血管源性脑水肿的发生，减轻继 发性脑损 伤0结合前面的结果，本实验的第一个结论也证实了这一点0但单用这一机制 很难 解释本实验第二个结论即 MHTi+r 对血脑屏障保护作用较 MHTi 更强。从本 实验看，MHTi+r 组和 MHTi 组动物除缺血周边区再灌注 2 小时后局部血流存在 差异外，并无其它明显差别0由此可 推知，血脑屏障破坏程度，与继发低灌流

22、 也有密切联系0作者单位：200040 上海医科大学华山医院神经外科 参考文献 1 Memezawa H, Smith ML, SiesjoBK. Penumbral tissues salvaged b y reperfusion following middle cerebral arteryocclusion in rats. Stroke, 1992, 23:552-559.2 Goto Y, Kassell NF, Hiramatsu K, et al. Effects of intraischemic hypot hermia oncerebral damage in a mode

23、l of reversible focal ischemia. Neurosurgery, 1993,32:980-984.3Longa EZ, Weinstein PR, Carison S, et al. Reversible middle cerebral a rteryocclusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989, 20:84-91.4Yang GY, Betz AL. Reperfusion-induced injury to the blood-brain barr ie r aftermiddle cerebral art

24、ery occlusion in rats. Stroke, 1994, 25:1658-1665. ZK) 5Xue D, Huang ZG, Smith KE, et al. Immediate or delayed mild hypothermi aprevents focal cerebral infarction. Brain Res, 1992, 587:66-72.6Marion DW, Obrist WD, Carlier PM, et al. The use of moderate therapeut ichypothermia for patients with severe head injuries: a preliminary report. J N eurosurg,1993, 79:354-362.7Gehrmann J, Bonnekoh P, Miyazawa T, et al. The micro