流行性脑脊髓膜炎实验室诊断ppt课件

1、流行性脑脊髓膜炎实验室诊断 天津市卫生防病中心病原生物学部 井良义何谓流行性脑脊髓膜炎？流行性脑脊髓膜炎简称流脑，是由脑膜炎奈瑟菌Neisseria meningitides，Nm经过呼吸道传播所引起的化脓性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行,患者以儿童为多见，如今成年人发病有增多趋势。人受Nm 感染后大多数表现为鼻咽部带菌形状，只需少数成为流脑患者。 正常人群中Nm带菌率可达5 30%。，带菌者为流脑流行的重要传染源。细菌经飞沫传播，患者埋伏期1 4天，其开展经过可分为三期：1.首先侵入鼻咽腔，引起上呼吸道感染，有时部分有炎症。2.少数细菌侵入血流，呵斥单纯 菌血症，可有忽然发作的恶寒、发热

2、、恶心、呕吐等，并可有出血性或红斑性皮疹，或称淤血点。3.大量细菌侵入，由血液或淋巴到达脑脊髓膜，引起脑脊髓膜炎的病症与体征，如头痛、呕吐、颈项强直、发热等普通脑膜炎病症。适宜的检测样品鼻咽拭子、血液、皮肤粘膜出血点挤出液、血清及脑脊液等。其中脑脊液、血液、皮肤粘膜出血点挤出液中检出脑膜炎奈瑟氏菌可直接作为确诊根据。样品采集与运送样品采集与运送 样品采集一样品采集一 脑脊液：无菌操作，吸出CSF 35mL，立刻放到无菌试管内离心(2000 3000r/min，30min)，用灭菌过的毛细管汲取沉淀物直接接种到10羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于20待测)，5

3、二氧化碳环境37培育24 72h，每日检查细菌生长的情况，及时分别纯培育物供鉴定。样品采集二样品采集二 血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液(余下的2mL血液同上离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于一20待测)，同上述条件培育2472h，每日进展分别培育。 样品采集三样品采集三淤血点：选病人皮肤上的新颖淤血点或淤斑，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌812h后分别培育或直接接种10羊血巧克力色琼脂；涂片，干后革兰染色，直接镜检。 样品采集四样品采集四咽拭子：用长柄棉拭子

4、采咽后壁两侧分泌物，立刻接种卵黄双抗培育基或巧克力双抗平板，也可将咽拭子放入液体双抗增菌管内，增菌8 12h后分别培育 。咽拭子接种咽拭子接种不合格咽拭子接种不合格咽拭子接种样品的处置和运送样品的处置和运送 早期采集样品：应尽能够采集病人用药前的早期样品，这可以明显提高病原的检出程度。及时处置样品：应尽能够地做到床边接种，假设无能够那么应在最短的时间内送到实验室进展接种培育。保温运送：应尽能够坚持样品处于2036之间，切记不能低温运送检测抗体的血清标本除外。 流脑病原学检查方法流脑病原学检查方法 生长特性脑膜炎双球菌为专性需氧菌，初次分别时需510%的二氧化碳环境才干生长，最适生长温度为37

5、。 菌落特征及菌体形状菌落：Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5%CO2，37 培育24小时后，其菌落直径约1mm ，外表突起、光滑、潮湿、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。细菌形状：为革兰氏阴性，呈卵圆形和肾形，0.80.6大小。常成对陈列，临近两边扁平凹陷 菌 落 特 征菌 落 特 征脑 脊 液 涂 片 生化特征 分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分别蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性 血清分群鉴定 检查从病人分别的疑似Nm时，先用多价、多价、多价抗血清检测，假设阳性再用分群血清A群、 B群、C群、W群抗血清等检测。不与盐水发生凝集，与一种脑膜炎抗血清发生凝集反响，即为某一型的流脑

6、菌。在盐水中发生凝集反响，不能作为抗血清分群。菌种保管菌种保管 短期保管：保管脑膜炎双球菌，用卵黄盐水保管，可保管7天。2长期保管：最好方法是低温冷冻或冷冻枯燥。一切的细菌都可在-70冰箱中冷冻保管。将脑膜炎双球菌接种巧克力平板中，放二氧化碳培育箱中35 37 孵育18 20小时，搜集细菌放到含1ml脱脂牛奶的2ml螺盖冷冻瓶中。将菌苔在管壁研磨振荡，使细菌分散在培育基中。-70 低温冰箱分类保管。 流脑血清学检查方法一流脑血清学检查方法一 玻片凝集实验:运用玻片凝集实验对Nm病原菌株或带菌者菌株进展血清学分群。Nm诊断血清：国产售品有多价包含A、B、C、D群，多价 含1889Y、 1890H

7、、189229E，多价含319W、1916X、1486I、1811K群及各群单价血清，合计14种。括号内为国际编码 流脑血清学检查方法二流脑血清学检查方法二酶联免疫吸附实验ELISA：运用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中抗A群流脑IgG的抗体程度。此方法也可以运用于安康者血清抗体的测定。假设病人恢复期血清抗体效价较急性期呈现4或4倍以上升高有追溯诊断的意义。 流脑血清学检查方法三流脑血清学检查方法三杀菌力实验：运用微量杀菌力实验(TTC法)测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体程度。此方法也可用于安康人群的血清抗体测定。流脑其它检查方法一流脑其它检查方法一胶乳凝集实验运用胶乳凝

8、集实验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流脑临床诊断。可用市售的脑膜炎乳胶凝集试剂盒如法国梅里埃公司的试剂盒。方法：一滴乳胶试剂30l加上一滴病人的脑脊液，涂匀，在2分钟内出现明显凝集者为阳性。 流脑其它检查方法二流脑其它检查方法二 PCR检测：运用PCR检查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，对流脑病人进展早期诊断。 培育基制备培育基制备巧克力色血液琼脂： 成份：营养琼脂pH7.6 100ml 脱纤维血 510ml制法：将营养琼脂溶解，以无菌手续参与羊血，摇匀。置水浴锅内，维持在902030min。待培育基冷至50 时才倾注平板。如做病人亲密接触者或安康人群带菌调

9、查时，那么需加双抗，每1000ml培育基参与多粘菌素4.2mg或2.5万单位，万古霉素3.3mg。卵黄盐水将新颖鸡蛋洗净，在70%酒精中浸泡消毒1h后取出，用3%碘酒消毒蛋壳，以无菌操作于鸡蛋的一端开一小孔，使蛋清全部流尽，蛋黄倒入置有玻璃珠的三个烧瓶中，打碎后，一份蛋黄加一份生理盐水，再在摇珠瓶中振摇，使其混匀呈乳状分装试管，56 加温30 min ，置37 作无菌实验。脑膜炎双球菌保菌用 增菌肉汤成份：新颖牛肉汤 100ml 葡萄糖 0.5g配制： 混合上述成份，调pH至7.47.6分装试管，2ml/管或30ml/瓶，高压灭菌10磅10分钟，无菌检验合格后供增菌用。 诊断试剂诊断试剂1、诊断血清：中国CDC传控所呼吸道细菌室流