核酸含量测定ppt课件

1、生物仪器分析技术生物仪器分析技术核酸含量测定核酸含量测定紫外分光光度法紫外分光光度法主讲教师：林叶副教授实验目的实验目的1 学习和掌握运用紫外分光光度法直接测定核酸含量与纯度的原理与技术；2 熟习核酸定量分析仪的根本原理与运用。型号：型号：GeneQuant pro GeneQuant pro 品牌：通用品牌：通用GEGE产地：美国产地：美国波长校准：启动后自动波长校准：启动后自动进展进展 波长范围：波长范围：230, 260, 280, 320,546,562, 595,600nm 核酸定量分析仪DNA/RNA计算器用用 途途1核酸和引物样品扫描测定；2可检测低至20ng 的核酸样品用7微升

2、超微量比色杯，显示A260/280和A260/230比值作为核酸纯度检测的目的 ；3可采用在 595nm 的Bradford 法、546nm 的双缩脲法和562nm 的BCA 法进展蛋白检测，样品经过存贮的规范曲线进展丈量，直线的线性回归结果可打印出来；4OD600 细菌细胞培育测定；5计算寡核苷酸分子量，实际Tm值用于PCR退火温度。l546nm双缩脲法/lowry法Folin-酚法 l双缩脲法：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成蓝紫色复合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。 llowry法的显色原理与双缩脲方法是一样的，只是参与了第二种试剂，即Folin酚试剂，以添加显色量，从而提高了检

3、测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基复原，产生深蓝色钼兰和钨兰的混合物。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。 l562nmBCA法l在碱性条件下，蛋白质将Cu2+ 复原为Cu+ ,Cu+ 与BCA 试剂构成紫色络合物，其吸光值与蛋白浓度成正比。l595nm考马斯亮兰法Bradford法 l考马斯亮蓝G-250在游离形状下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比。lOD600 检测细菌培育液的浓

4、度l利用细菌的吸光来丈量细菌培育液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以通常用来指菌体细胞密度。l丈量细菌培育液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值假设在0.6-0.8之间，阐明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD6003阐明细菌曾经饱和。l细菌的生长情况,可以经过测OD600来监测。细菌的生长比较好的时期是在OD600为1时，此时可以进展传代等研讨。 比色杯l参数设定参数设定lDNAlSet-uplSelect 修正参数修正参数lEnter确认确认l设定空白设定空白l将空白溶液参与比将空白溶液参与比色杯中色杯中lSet refl核酸含量和纯度测定l将待测核酸样品按照比例稀释后，参与比色

5、杯中lDNA 或 enter实验原理实验原理 核酸、核苷酸及其衍生物的分子构造中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统-C=C-C=C-，可以剧烈吸收250-280nm 波长的紫外光。 核酸DNA、RNA的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以利用紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。Lambert-Beer 定律定律 光吸收根本定律光吸收根本定律 l当一束平行的单色光经过溶液时，溶液的吸光度 A 与溶液的浓度 C 和厚度 b 的乘积成正比。它是分光光度法定量分析的根据。 l在不同pH 溶液中，嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差别，它

6、们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质含量时均应在固定的pH溶液中进展。实验原理实验原理碱基的互变异构碱基的互变异构l嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互变异构景象，普通生理pH条件下呈酮式。l互变异构会使碱基间发生错配，使A-C、T-G等 。l当胸腺嘧啶以正常方式即酮基型为模板时，配对的互补碱基为腺嘌呤；当前者变为烯醇型构造时，经过氢键配对的碱基可变为鸟嘌呤。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm 波长下，10mm光径的比色杯中，光密度为1.0的DNA或RNA溶液的浓度为50或40g/ml 。因此，测定未知浓度的DNARNA溶液在OD260nm的吸光度值，即可计算测出其中核

7、酸的含量。实验原理实验原理DNA浓度计算 DNA浓度浓度g/mL系数系数Abs260系数系数=光径光径稀释倍数稀释倍数lOD230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、苯酚等，Tris，EDTA和其他缓冲液的盐在这个波长都有吸收；lOD320 表示检测溶液的混浊度和其他干扰因子，纯样品OD320普通是0，假设溶液盐浓度越高，OD320的数值也越高。实验原理实验原理lOD260/OD280的比值用于评价核酸样品的纯度l纯真的DNA OD260/OD2801.8l纯真的RNA OD260/OD2802.0l比较纯真的核酸样品 l OD260/OD230 2.0l假设有小分子及盐离子存在，如核苷

8、酸、氨基酸、酚等l OD260/OD230 2.0实验原理实验原理植物基因组植物基因组DNADNA提取提取产品简介产品简介 本试剂盒适用于从多种植物的不同组织中快速提取基因组本试剂盒适用于从多种植物的不同组织中快速提取基因组DNA，特别适用于多酚、多糖含量高的植物组织和植物干粉。离，特别适用于多酚、多糖含量高的植物组织和植物干粉。离心柱中独特的硅基质资料和其配备的缓冲溶液能有效去除植物组心柱中独特的硅基质资料和其配备的缓冲溶液能有效去除植物组织中多糖、多酚复合物和酶抑制剂，纯化过的基因组织中多糖、多酚复合物和酶抑制剂，纯化过的基因组DNA可直接可直接用作用作PCR模板、酶切、杂交等分子生物学实

9、验。模板、酶切、杂交等分子生物学实验。产品特点产品特点 简单快速：简单快速：1 小时内即可获得超纯的基因组小时内即可获得超纯的基因组DNA。 纯度高、质量好：纯化过的基因组纯度高、质量好：纯化过的基因组DNA 可直接用作可直接用作PCR 模板、模板、酶切、杂交等分子生物学实验。酶切、杂交等分子生物学实验。产品运用产品运用 运用广泛，可运用于多种植物的多种组织运用广泛，可运用于多种植物的多种组织 特别适宜于多糖、多酚含量高的植物特别适宜于多糖、多酚含量高的植物 特别适宜于植物干粉特别适宜于植物干粉保管条件保管条件: 室温室温1 取大豆粉100mg，参与700l 65预热的GP1溶液，迅速颠倒混匀

10、后，将离心管放在65水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；2 参与700l氯仿，充沛混匀，12000rpm 离心5min；3 小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，参与700l缓冲液GP2，充沛混匀；4 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm 离心30s，弃掉废液；5 向吸附柱CB3中参与500l缓冲液GD，12000rpm 离心30s，弃掉废液，将吸附柱CB3放入搜集管中；操作步骤操作步骤6 向吸附柱CB3中参与700l 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃掉废液，将吸附柱CB3放入搜集管中；7 向吸附柱CB3中参与500l 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃掉废液；8 将吸附柱CB3放入搜集管中， 12000rpm 离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附资料中剩余的漂洗液；9 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200l 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min， 12000rpm 离心2min，将溶液搜集到离心管中。操