第11章-体外试验与新生物技术在毒理学中的应用.docx

1、第八章毒理学评价的分子生物学方法分子毒理学固然应主要着眼于生物大分子，但也应当看到这些大分子是存在于细胞膜 上、细胞器内，乃至细胞间隙液中的。它们与细胞是不可别离的。因此，对亚细胞组分的研 究也是毒理学分子生物学评价的重要组成部分。第一节亚细胞组分的制备现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。现就细胞膜、微粒体 及线粒体的制备方法加以介绍。一、细胞膜的制备细胞膜指细胞外层质膜，厚度约610nm°它将细胞与外环境分隔，且参与细胞的生命 活动，细胞内各种细胞器也是由质膜分隔，称为细胞器膜，两者统称为生物膜。它是常用的 研究模型，用以从细胞和亚细胞水平研究外源化合物的中毒

2、机制。I .肝细胞膜的制备其基本原理是：首先，将肝组织在含有钙离子的低渗碳酸氢钠缓冲液中温和匀浆，使 细胞膜保持较大的膜片；其次，应用低速离心使细胞膜片与细胞核一起从匀浆中别离，再利 用细胞膜与细胞核之间的密度差异，用密度梯度离心将细胞膜从低速离心获得的粗核部分中 别离出来。2. 红细胞膜的制备哺乳动物红细胞不含任何细胞器，故其红细胞膜是较纯洁的细胞膜。(1) 红细胞血影膜常用的制备方法是在低渗条件下，红细胞膨胀，由双面盘状变成近乎球形，随后细胞内 容物因胞膜破裂而释放，2() OOOg离心。洗涤去除血红蛋白，即获红细胞膜。此种膜最接近 整体系统，仍保留着原有膜的生物化学和生物物理学等特性，毒

3、理学试验常用简易模型研究 外源化合物对细胞膜离子转运及相关酶类、膜脂流动性和细胞骨架结构等方面的影响，并探 讨其可能的机制。但它不能控制细胞质内的环境，在应用上有一定的局限性。此外，低渗制 备的红细胞膜虽然去除了细胞内质，但膜的封闭性差，有许多泄漏的空穴。(2) 再封血影近年发现，在一定条件下，胀破了的红细胞可以重新封闭，对K'等离了不通透，给研 究红细胞膜提供了另一模式。其制备的方法有： 向低渗胀破的红细胞加入浓盐溶液，成为等渗溶液，置于37C温育20min,期间可 缓慢地搅拌，即得一定比例的再封血影。 将低渗胀破的红细胞在0°C条件下，过Biogel A柱，柱上部的I/3

4、pH为7. 6,以 利膜与血红蛋白别离，其下的2/3pH为6. 0,有利于随后红细胞空泡的重新封闭，当膜从 柱上流出后再用一定浓度的Kcl调节为等渗液，在37°C温育lh,即获得重新封闭的血影。(3) 封闭的红细胞膜囊泡有时为了深入研究，需要将膜的内、外层翻过来。红细胞溶血后，在不含一价离子的碱 性低离子强度介质中，膜能自发地凹陷(无Mg"存在)或外凸(有Mg “存在)，形成小囊泡， 通过实验可制备封闭的红胞膜囊泡。其特点是不受胞浆内容物的干扰，可采用匀浆，等密度 梯度离心或屏障别离等技术制备胞浆面在外的翻转泡(其内、外层正好与血影膜相反)或胞浆 面仍在内的正转泡(即与红细

5、胞膜内外侧相同的囊泡)。3. 脂质体的制备脂质体是双层脂质包围-些水溶液的小滴，呈球形。它是最常用的人工膜之一，是较 为理想的生物膜模拟系统。大脂质体制备可将适量的磷脂溶于氯仿等有机溶剂，置于旋转蒸 发仪上蒸发至干，使玻璃壁上附有一层极薄的磷脂膜，然后加水溶液，并振摇，即可形成多检测单核细胞增生李斯特菌单核细胞增生李斯特I®是食品卫生中的重要病原茜，多通过食品经口感染，被列 为20世纪90年代食品中的4大病原菌之一。有关单核细胞增生李斯特菌污染乳制品、肉、 禽、蔬菜的研究国内外均有报道。该菌可诱发食物中毒，导致李斯特菌病，主要引起人类脑 膜炎、菌血症等，发病率虽低，死亡率却高达30%

6、70%。在食品李氏杆菌的检测中，过 去一直缺乏简单快速的别离鉴定技术，传统方法从食品中别离、鉴定该菌约需I2周才能 得出结果，免疫学方法和基因探针己用于该菌的快速检测，但前者可到达属水平的特异性， 后者敏感性差。PcR技术的引入可使检测过程大为缩短。李氏溶血素0基因与内化素基因是 单核细胞增生李斯特前最主要的致病因子与侵袭因子，针对其毒力基因可设计特异性高的引 物，快速扩增。有报道对食品中李氏杆菌的溶血。基因进行PcR扩增，结果可在I2h内完 成整个检测过程，对食品样品中李氏杆菌的检测限可达550个细菌。(1) 检测金黄色葡匐球菌金黄色葡萄球菌是各种类型感染和食物中毒的病原菌，能在食物内增殖并

7、产生体 外毒素一一肠毒素、内毒素一一中毒休克综合症毒素和脱皮毒素。FI前金黄色葡葡球菌肠毒 素D的鉴定主要依赖于免疫学技术，该技术需要细菌纯培养和制备肠毒素，实验周期长、 步骤繁多，使其在食品卫生学鉴定时受到限制。近年来PCR技术的发展为食品病原微生物 的鉴定提供了新的途径。(2) 检测沙门菌沙门菌是-种人畜共患的传染性病原菌，近年来，对沙门菌快速诊断的方法己有 了很大进展，如应用ELlsA法、EIA技术、间接血凝抑制试验、HRPSPA染色法和PcR 技术等。PCR技术由于具备高度特异、灵敏和快速的特点，已引起越来越广泛的重视。(3) 桧测致病性大肠杆菌肠毒素大肠杆菌是弓I起婴幼儿和幼畜腹泻的

8、主要病原菌之一。该菌可产生2种肠毒 素：热敏性肠毒素和耐热性肠毒素，它们均能引起肠黏膜细胞水与电解质的代解紊乱并导致 腹泻。肠毒素大肠杆菌引起的腹泻主要是食入了被该曲污染的食品所致。PCR技术为临床 和实验室提供了一个更为快速灵敏的检测手段。(4) 检测志贺氏菌该菌的致病性主要由其质粒决定，而传统方法的选择性富集培养易丧失质粒。PcR 技术克服了这一缺。PCR扩增及凝胶电泳分析检测中心质粒DNA的别离，可在67h完成, 而从抽样到最后出结果也不到1天时间。(5) 检测肉毒梭状芽泡杆菌肉毒梭状芽泡杆菌产生的肉毒神经毒素，在天然物质中毒力最强。依据抗原性不 同，肉毒毒素分为A, B, C, D,

9、E, F和G7型，分别由AG型肉毒梭菌(clostridium b。 (ulinum)产生，其中A, B,E和F型能引起人类肉毒中毒，致死率很高。肉毒梭菌一直缺乏 有效的快速检测方法，用常规方法从食物中别离鉴定出肉毒梭菌至少需要4d,不能到达快 速监测食品的目的。经设计引物扩增持异片段，实现了对食品中肉毒梭菌的快速、敏感、特 异性地检测。3. 存在的问题及展望PCR技术虽为一种快速、特异、灵敏、简便、高效的检测新技术，但其在食品中 致毒、致病性微生物检测的实际应用中也存在不少问题，必须认真分析各种具体情况，采取 必要的措施，以提高反应的特异性和敏感性，防止假阳性或假阴性结果。(1) 污染问题。

10、PCR是一种极为灵敏的反应，一旦有极少量外源性DNA污染，就可 能出现假阳性结果，所以在操作时必须加以注意。(2) 假阳性问题。食品是复杂的反应基质，影响PCR反应的因素很多，如果不能有 效排除各影响因素的干扰，很可能出现假阴性结果。此外，如果在PCR操作过程中各种实 验条件控制不当，很容易导致产物突变，也会导致假阴性结果。对于这些问题必须有充分的 考虑和排除措施。(3) 引物设计及靶序列选择。引物的设计及靶序列的选择是决定PCR结果的关键因 素，引物不同则扩增物不同，如果引物的设计不当，则直接影响对关键靶序列的选择，降低 PCR检测的灵敏度和特异性，甚至完全失败。因而必须对扩增序列有充分的了

11、解，并标准 PCR实验室操作计术。(4) 模板DNA的制备方法。肉类等食品增菌液中含有的油脂等杂质可抑制Taq酶活 性，影响PCR反应的正常进行。如用煮沸裂解法直接制备DNA模板，油脂等杂质难以除 去，会影响检测结果。因此，必须采用适当的模板DNA制备方法。有研究发现，采用快速 裂解吸附法制备DNA模板，经过2次清洗步骤可有效去除杂质，反应干扰小，稳定性好， 所获得的模板可保存较长时间。(5) 灵敏度问题。食品的成分极为复杂，其中许多成分都对PCR反应产生干扰作用， 从而降低PCR检测的灵敏性。为了提高检测的灵敏度，在PCR扩增前往往需要进行增菌培 养。如果不进行增菌培养而直接对样品进行检测，

12、其检出限可相差5个数晟级。结合PCR 技术与免疫磁性别离技术建立的MIPA方法，可不经增萌程序，提高可利用模板数量，去除 食品成分干扰，到达较好的检测灵敏度。(6) 检测效果。PCR方法只能检测微生物的存在与否，而不能检测微生物产生的毒 素，因而PcR技术用于致毒性微生物污染的食品的安全性检测方面，尚存在两个问题。其 一，致毒性微生物检测结果为阴性的食品并不能排除存在毒素的可能，因此检测结果为阴性 的食品并不一定是食用安全的食品：其二，致毒性微生物检测结果为阳性的食品中不一定都 含有微生物毒素。对前一种情况，PcR检测不具诊断价值，需用小鼠致死试验或免疫学方法 检测毒素。对后一种情况，PcR检

13、测具有参考价值，因为食品中存在引起食物中毒的潜在因 素。这说明，对于致毒性微生物安全性的检测，不能仅以PcR的检测结果为依据，还需要 结合对毒素物质的检测结果进行综合判断。尽管PcR技术在食品的微生物安全性检测方面还存在着-些问题，但相信随着研 究的深入，这项技术必将得以完善，并迅速成为可以信赖的快速检测手段。三、转基因食品PCR检测自1983年世界上试验成功第一棵转基因植物以来，以转基因技术为核心的现代生物 技术迅猛发展。近年来，利用重组DNA技术研究开发的转基因食品快速发展，有些商品己 经被批准商业化，并且开始进入普通消费者的餐桌。尽管多数学者认为转基因食品是安全的， 但在过敏性、毒性、致

14、癌性、食品营养品质改变以及环境等方面，仍存在不少争议。目前， 对转基因食品各国普遍的态度是：对相关食品必须给消费者真实而明确的信息，大多数国家 要求对转基因食品进行标识。挪威是世界上第一个要求对转基因食品进行标识的国家，规定转基因成分的标识 限量为2%,欧盟和日本分别为1%和5%。我国政府规定，但凡列入标识管理目录并用于 销售的农业转基因生物，应当进行标识；未标识和不按规定标识的，不得进口和销售。因此 必须对转基因食品进行有效的检测。从转基因技术建立之日起，转基因检测技术亦随之建立。目前主要有两类转基因 检测方法：基于特异性DNA片段的PCR检测技术和基于特异性蛋白的EuSA(enzyme：

15、一 linked immunosoibent assays)检测方法。两种方法的出发点不同，各有优缺点。ELIsA分析法检 测的特异性蛋白主要是外源目的蛋白和一些报告基因所表达的蛋白，尤其适用于无需加工的 原料性食品，但对于加工品则有局限性。因为重组基因产物会因加工(特别是高温)处理而失 活、分解或消失而使检测的不确定性增加，假阴性率增高。PcR法检测特异性DNA片段包 括外源启动于、终止子、报告基因和目的基因。PcR法也不完全适用，因为核酸也会被降解, 但其灵敏度高、适用范围最广，目前仍是对转基因食品最常用的检测方法。转基因食品(GMO, genetically modified organ

16、ism)的PcR检测分成三个层次：首先 要求检测出是否含有转入的外源基因，判断是否为转基因产品，即定性检测。一旦确定为转 基因产品后，需要进一步明确两个问题，首先要确定是哪种转基因产品，特别是要确认是否 为已批准的转基因产品，即要进行转基因产品品系的检测鉴定；鉴定了转基因产品品系，并 确认为己批难的转基因产品后，往往还要检测出其中转基因产品的含后，以明确是否到达需 标识的含量(阈值)，即需要进行定量检测。目前，对转基因食品的检测主要有以下几种PcR方法。1. 定性PCR技术由于定性PCR所需设备简单，试剂也相对廉价，因此是目前转基因检测中最为常 用的方法之一，一些国家将其作为有关食品法规的标准

17、检测方法。定性PcR常以启动子、 终止子、报告基因、目的基因等特异性DNA片段作为检测目标。统计说明，【实时荧光聚合 酶链反应(PcR)检沸J技术CaMv35S启动子、FM V35S启动子、Nos终止子、唧£ Ik c,), 3A、Bar和Pat这7种基因片段用做筛查日的靶核酸序列时可覆盖绝大多数的GM0品种。 在实际检测中，可以根据以上7种基因片段设计引物和探针进行筛检。多重PCR经过一次 扩增可同时得到多个所需的DNA或基因序列，对于检测是否含有转基因成分的DNA样品 明显减少了反应次数，大大节省了时间和精力。但由于PcR的高灵敏度己造成假阳性现象, 以及由于操作失误和一些反应抑

18、制因素带来假阴性现象，各个实验室间常存在一定误差，且 不能用于定量分析，使该法具有一定的局限性。2. 竞争定量 PCR 法(quantitative competitive PCR)随着各国有关转基因成分标签法的建立和不断完善，对GM0的准确定量检测变得 口趋重要。一些定量PcR技术相继发展起来。竞争定量PcR就是其中一种。竞争定量PcR 法的原理是采用构建的竞争DNA(往往与样品DNA具有相同的引物结合序列，但大小相差 一定bp,便于电泳时分开)与样品DNA在同体系中相互竞争相同的引物和底物，并根据 电泳结果做工作曲线，从而得到可靠的定量分析结果。该法对实验仪器的要求不高，与定性 PcR相比

19、，降低了抑制因素的影响以及实验室问的误差。不足之处是需要用基因重组技术构 建竞争DNA,对一般实验室来讲难度太大，且定量程度难以提高。3. 实时定量 PCR(realtime： PCR)上述这些方法进行检测时都依赖于各种不同类型的PcR后处理过程，而这些处理 过程很易使数量巨大的PcR产物飞散到空气中，使PcR假阳性污染成为可能，尤其是电泳 所用的染色剂EB(漠化乙锭)为强烈致癌物质，假设操作不当，会严重危害操作者的健康。另一方面，竞争定量是针对PcR终产物来进行的，而PcR的平台效应在一定程度 上干扰了 PcR的原始模板数量和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。与这些传 统方法不同，实

20、时定量PCR方法采用完全闭管检测，不需PCR后处理，防止了交叉污染。 采用实时监测技术，从检测开始到定量结束，整个过程耗时短，操作方便。目前，用于转基因产品实时定量检测的RcR仪主要有：(I)ABI公司生产的ABI Prism 5700 型、7700 型、7900HT 型 PcR 仪；(2)Iloch：公司生产的 Light： (ycler-PcR 仪。这两 种PcR仪既可用于转基因产品的定性筛选，也可用于转基因产品含量的定量检测及品系鉴 定。不同的厂家生产的实时定量PcR仪其荧光探针的设计和荧光信号的监测机理不尽 相同。下面以ABI公司生产的ABI Prism系列PcR仪为例说明实时定量Pc

21、R原理。ABI Prism系列荧光定量PcR仪采用的是TaqMan实时荧光PcR技术，它是在常规 PcR方法基础上，添加了一条标记了 2个荧光基团的探针来检测PcR产物的数量。荧光报 告基团(R)标记在探针的5' 一端，荧光淬灭基团(Q)标记在探针的3' 端，两者可构成能 量传递结构，即荧光报告基团所发出的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑 制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在PcR过程中，TaqMan探针同PcR产物杂交，由于 Taq酶具有5' 到3' 的外切酶活性，在引物延伸阶段将TaqMan探针切断，荧光淬灭 基团(Q)淬灭作用消失，报告基团荧

22、光信号增强。伴随PcR产物的增加，荧光信号随之增强, 第n循环时的荧光信号增加值3R等于Rn / Qn - RO / QO, Rn, RO分别为第n循环和PcR 反应开始时的报告基团荧光值。Qn、Q0分别为第n循环和PcR反应开始时的淬灭基团荧光 值。PcR反应的第315个循环的荧光值作为荧光本底信号，315个循环的AR。的标准 偏差的1()倍被设定为荧光阈值(threshold),当信号到这该荧光阈值时的循环次数(G,值洞 PcR反应的初始模板量成正比。通过检测作物本身所具有的内源参照基因(endogenous reference： gene),如玉米醇 溶蛋白(zein)基因、高速泳动蛋白

23、(HMGprote' n)基因、大豆凝集素(led： in)基因，可以测 定样品中转基因作物和非转基因作物的总DNA模板量；通过检测转基因作物中转入的外源 基因，如CaMv35S启动子、CP4 EPSPS基因、c叫LA(6)基因等可以测定样品中转基因 作物DNA模板量，通过建立转基因作物标准参照样品的内源参照基因与外源基因c,值之 差(:,)与转基因成分百分含量的标准曲线，可以计算出样品中转基因成分的百分含量。TaqMan探针技术巧妙地运用了 PcR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和 荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏 等优点。层大脂

24、质体。用超声波法和微量注射法、去垢剂法可获得单层脂质体。4. 突触体膜的制备制备突触体膜的基本原理是将脑组织在预冷的蔗糖溶液中进行匀浆，再利用脑突触体 膜的蛋白质与脂的比例、电荷性质、颗粒大小、形状等不同于其他的细胞器膜进行蔗糖密度 梯度离心，将其别离出来。二、微粒体的制备微粒体是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。由于微粒体 含有代谢外源化合物的混合功能氧化酶，在毒理学研究中有着重要地位，是较常见的试验模 型。制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法、凝胶过滤法及等电点沉淀法。基本步骤为：将肝组织匀浆后，2500g离心；弃去沉淀（主要是细胞核及碎片），取上 清液9000g离心

25、；弃去沉淀（主要是线粒体），取上清液，lOOOOOg离心，得到的沉淀即为线 粒体，上清液为胞浆。所得微粒体用缓冲液悬浮后，贮存在一 20一 70C冰箱中。除超速离心法制备微粒体外，用凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法也可以制得 微粒体。三、线粒体的制备1. 肝脏线粒体的制备所有操作应在低温条件下进行。全部器械如匀浆器、烧杯、离心管等，以及缓冲 液应放4°C冰箱内预冷。2.亚线粒体颗粒的制备亚线粒体颗粒是指经特殊处理，除去线粒体外膜和基质部分后形成的小囊泡。它含 有氧化磷酸化过程所有的酶类，是观察呼吸链氧化反应、ATP酶活性及其他一些特殊反应的 模型。亚线粒体颗粒制备的原理是利用超声波作

26、用，破坏线粒体外膜，再经超速离心获 得仅有内膜的亚线粒体颗粒。在超声处理过程中应注意保持线粒体制备物温度，不要升高， 维持在4°C以下。第二节核酸的提取与制备核酸的提取是分子生物学中很重要的基本实验技术，也是其他分子生物学分析方法的 前提条件。核酸样品的提取质量将直接关系到有关分析检测的成败。别离纯化核酸总的原则是应保证核酸-级结构的完整性及排除其他分了的污染。为了 保证孩酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一 级结构之内。核酸的一级结构还决定着其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方 式。经纯化的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过

27、高浓度的金属离子，其他 生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度，此外还要排除其他核酸分 子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA分子，反之亦然。为了保证别离核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学因素对核酸的降解，为防止过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏, 操作多在DH41（）的条件下进行。 减少物理因素对核酸的降解。物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。 机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于 低渗液中，细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。机械

28、剪切作用的主要危害对象是 对分子质量大的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNAo对分子质量小的环状DNA分 子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些。高温，如长时间的煮沸，除水沸腾带来 的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，常规操 作温度为04C,此温度环境可降低核酸酶的活性与反应速率，减少对核酸的生物降解。 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键， 直接破环核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价离子Mg “，ca “的激活，使用金属 二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐基木上可以抑制DNA酶的活性。而RNA

29、 酶不但分布广泛、吸易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以生物降解是 RNA提取过程中的主要危害习素。总的来说，核酸提取的主要步骤就是破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、 脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质， 纯化核酸等。核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。一、DNA的提取与制备从细胞中提取DNA要用尽可能温和的细胞破碎法，以免DNA被机械破碎。操作时还 需要有EDTA的存在，以螯合镁离子，镁离子是DNA酶降解DNA所必需的。如果有细胞 壁，要用酶进行消除，如用溶菌酶处理细菌，对于细胞膜要用去污剂溶解。对

30、于不同来源的 细胞、组织应使用不同的裂解液，如果必须使用物理破碎，一定要尽可能地轻缓。细胞破碎 以及其后的操作都要在4cIC条件下进行，所用的玻璃器皿和溶液都要经过高压灭IS以破坏 DNA 酶。上述方法只适用于细胞总DNA的提取。不同来源的样品，处理时有不同的注意事项。 对于新鲜动物组织脏器等提取材料，巾于含有较丰富的DNA酶，应迅速冷冻保存备用，以 减少DNA的降解；石蜡包埋组织块中DNA应先进行脱蜡处理；培养细胞裂解之前应用相 应的缓冲液进行洗涤；质粒DNA提取之前先要经过细菌培养，获得对数生长后期的细胞后 进行离心集菌收集，再通过碱性裂解法、去污剂法或煮沸法等进行提取，纯化过程也可使用

31、酚/氯仿萃取法，对于小分子DNA(小于10kb),可用涡旋混合器以保证溶液中有机相与水 相混合均匀，当纯化DNA分子介于1()3Okb时，应轻微振荡，防止DNA被机械剪切，小 于30kh的DNA分子纯化时应更小心。二、RNA提取与制备RNA提取技术与上述DNA提取技术相似。由于RNA分子相对较短，不易被剪切 力损伤，因此细胞破碎可以用较强有力的方法。RNA对RNA酶敏感，而RNA酣在自然界 广泛存在，不仅各种细胞内都有RNA酶，操作者的手指上也有RNA酶，因此操作者必须 带手套，并旦提取液中要有较强的去污剂存在，以便快速灭活RNA酶。接下来的去蛋白操 作须特别强有力，因为RNA常常和蛋白质紧密

32、结合在一起。用DNA酶去除DNA,用乙醇 沉淀RNAo RNA提取要用硫策酸弧.它既是较强的RNA酶抑制剂，又是蛋白变性剂。制 备RNA时所用物品应完全无RNA酶。第三节 基因突变分析与PCR检测一、基因突变分析基因突变(gene mutation)包括碱基置换、移码突变和片段突变(参见第五章第二节)。 基因突变是分子水平的变化，在光学显微镜下无法看见，一般是以表型(如生长、生化、形 态等)的改乏为基础进行检测的，也可通过DNA测序、DNA单链构象多态分析(sscP)、基因 差异分析及基因芯片检测等分子生物学方法检测DNA序列的改变来确定。1. PCRSSCP 技术聚合酶链反应一一单链构象多态

33、性分析 在能够检测单个碱基变化的技术中，单链 构象多态性分析因其简单而有效己成为最常用的技术。(l) PCRSSCP的基本原理PCRSSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。首先PCR扩增特定靶序 列，然后将扩增产物变性为单链，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳。此时， DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。 在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA 单链的碱基顺序决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主

34、要为氢键)来维持。相同长 度的DNA单链，其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。 靶DNA中如含单碱基置换或数个碱基插入、缺失等改变时因迁移率变化会出现泳动变位 (mobility shift)»从而可将发生突变的DNA与正常DNA区分开。经典的PCR-SSCP技术采用放射性同位素标记引物或核首，再通过放射性自显影 显示结果。但由于放射性同位素的污染及半衰期的问题，限制其推广应用。现已发展多种 PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，使用荧光素代替核素进行标记，也可以 在电泳后用银染(银染显示法也称冷sscp)。银染法利用对单链DNA亲和力较强的

35、特点，大大提高了分辨率 剂检测的敏感性，且技术操作简单、可重复性好，单链带型清晰，带与带之问易于-识别，既 防止了污染，又提高了灵敏性。此外，使用RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度，尤其是 对大于20(). b. p的片段检测更显优势。RNA分子形成的构象稳定、种类多，对单碱基置 换等改变敏感，RNA的sscP分析可检出多条单链带，提高基因变异检出率，是PCR-SSCP 技术又i发展方向。(2) PCRSSCP的优缺点PcR-sscP优点包括：技术原理明确，操作简单，不需特殊仪器，技术容易掌握： 实验步骤少、速度快、周期短；检测灵敏度高，一般无假阳性结果；可运用于大样本筛查； 可有效检测单碱

36、基置换和多碱基插入、缺失等基因突变类型。但PCRSSCP也存在一些不足之处：1) 、该方法最突出的问题是不能检测出所有的突变，由各实验室报道的突变检出 率从35% 99%不等，且分析片段太小，可能呈假阴性结果。由于随DNA片段大小的增 加迁移率的改变明显减少，故该方法只适用于检测150200bp的DNA片段。一般来说， 小于200bp片段的检出率可达90%,而大至400bp的片段，其检出率只有70%80%,片段 越小，检出率越高。2) 、SSCP分析影响因素较多。凝胶浓度和交联度、电泳温度、凝胶中甘油的浓度、电 泳缓冲液的离子强度等均可通过影响DNA单链构象从而影响DNA单链的电泳迁移率， 种

37、PcR产物单链的良好的电泳条件需要反复试验摸索。3) 、PCR-SSCP分析只能发现是否有突变或碱基序列组成方面的变化，并不能了解 DNA序列变化的性质及位点。解决问题的方法是将2知有改变的样本的PCR产物进行DNA 序列分析.即PCR、SSCP、DNA测序三种方法的联用(PCRSSCPDNASequencing技 术)。2. DNA测序基因突变检测的“金标准”是直接进行DNA测序，一些基因突变筛选方法得出的结 论往往还需DNA测序来证实。经典的DNA测序就其原理来说主要分为化学降解法和Sanger双脱氧链终止法。在 此基础上乂发展了一些基于非放射物质标记和自动化测序的方法，近年来还发展了一些

38、全新 的DNA测序方法，如毛细管凝胶电泳法、阵列毛细管凝胶电泳法、超薄层凝胶板电泳法等 以及不用电泳别离直接测序技术，如杂交法、质谱法、原子探针法、流动式单分子荧光检测 法等。(1)化学降解法1977年.Mao am和Gilb。rt报道了通过化学降解测定DNA序列的方法，即化学降 解法(chcm lei。a。gem。thod,也叫M. dxam一Gilbert法)。它的原理是用-些特殊 的化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，分别作用于DNA序列中4种不同的碱基, 使其在核昔酸序列中形成的糖昔键连接变弱，易从DNA链上脱落下来。丧失了碱基的核昔 酸链再经适当处理，就可在缺失碱基处断裂。在进

39、行这些反应时，将反应条件控制在每条 DNA链断开一处，因此经过处理可产生一系列长短不等的DNA片段。根据所用的试剂不 同，其末端分别为G, A, C, T,再对一系列这样的片段进行电泳及放射自显影，综合分析, 就可测得DNA分子中的核昔酸排列顺序。(2) 酶促双脱氧链终止法酶促双脱氧链终止法又叫Sanger法或链终止法(chain termination method)o由于这 种方法要求使用一种单链DNA模板和一种合适的DNA合成引物，因此有时也叫引物合成 法或酶催引物合成法。其基本原理是利用了 DNA聚合酶所具有的两种能催反应的特性：第 一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA为模板，合成出准

40、确的DNA互补链；第二，DNA 聚合酶能够利用23' 一双脱氧核昔三磷酸作底物，使之参与到寡核甘酸链的3' 一末端， 从而终止DNA链的生长。在同一反应管中加入链终止剂2' ,3'双脱氧核昔三磷酸(ddNTP) 中的某一种，以及引物、模板、dNTPs。ddNTP能随机掺人合成的DNA链，一旦掺入，DNA 合成即终止，于是各种不同大小的片段起始端相同，而末端核昔酸必定为该种核昔酸。经电 泳及放射自显影可从图谱上直接读出DNA序列。双脱氧法极适于大规模测序。(3) 自动化测序法Sanger双脱氧链终止法和Maxam一Gilbert化学修饰法在DNA测序原理上是公认

41、的两大成就.但两者也都存在着一些共同的问题有待解决。例如，这两种方法都需要使用放 射性核素作为标记物，尽管灵敏度很高，但存在辐射危害，而旦放射性材料在保藏、处理和 运输方面也是相当麻烦的,再如，这两种DNA序列分析法都存在着操作步骤繁琐、效率低、 速度慢等缺点(特别是在结果的判断环节中)。自DNA序列分析技术问世不久，为适应大规 模测序的需要，许多科学家开始致力于DNA分析自动化方面的研究。自动测序仪的原理沿 用Sanger等建立的双脱氧链终止法.DNA聚合酶催化延伸反应产生的DNA片段仍需通过 序列胶电泳别离，采用荧光标记取代放射性标记，通过激光激发荧光，并与电了电脑程序的 自动化技术相结合

42、，到达自动检测碱基的目的。而在荧光染料标记方式上，美国应用生物系 统公司ABI公司(applied biosystem)的自动DNA序列测定仪采用4种荧光基团标记，而欧洲 分子生物学实验室(EMBL)与瑞典PharmaciaILKB公司联手推出的全自动激光序列分析仪 (A. L. F., automated laser fluorescent sequencer)则采用 了单神荧光素标记。使用DNA自动测序仪，熟练的操作者一天可以测1000个以上的碱基，而其他测序方 法一般1人1年只能测50 00()个碱基。这种方法因采用电子电脑控制，自动化操作，大大 缩短了测定时间，而且结果准确可靠，是目前

43、最优越的测序方法。(4) DNA测序的新方法分子生物学技术的发展日新月异，除了上述DNA测序方法，近年来又发展了一些 全新的DNA测序方法。 以凝胶电泳为基础的测序方法在传统聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上又发展了毛细管电泳激光荧光法、超薄层板 电泳激光荧光法等技术。毛细管凝胶电泳比传统凝胶电泳别离速度提高了 25倍，但1只毛细管只能别离1 个样品，因此分析效率并未提高。阵列毛细管电泳新方法的出现提高了分析效率。1992年, 美国科学家采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1. 5h 内可读出35()bp, DNA序列分析效率可到达6000bp/h° 1994年，

44、日本科学家提出的另一 种测序装置，20只毛细管并列电泳，采用激光荧光电荷耦合阵列检测器(ccD)检测，有较高 的灵敏度。采用ccD检测器，100只毛细管阵列电泳装置，可同时检测100只毛细管的DNA 别离样品。使用超薄层凝胶板电泳进行测序，凝胶板厚度仅为50100斗ni,配备流水冷却 装置，场强提高到250V/cm,大幅度地提高了电泳速率。而一般的电泳胶厚度为20()400 肛m,电场强度较低(75v / cm),限制了测序的速度。在此基础上如采用激光荧光ccD检测 器检测，则可比常规电泳测序速度提高9倍，到达8()0()bp/h以上。 不用电泳别离的洲序新方法DNA测序方法研究的一个热点是不

45、用电泳别离的技术。这一类尝试主要包括：杂交法(sequencing by hybridization, SBH),这是有希望用于快速DNA测序分析 的-种新技术。它应用套巳知序列的寡核昔酸探针，与待测DNA样品进行杂交，寻找靶 DNA链上的互补序列，形成完全互补的双链，根据杂交情况排列出样品的序列信息。目前 SBH技术用于同源序列的比较测定、点突变的检测已日趋成熟。SBH作为一种快速、自动 化的测序方法，相信未来几年中会有迅速发展，在今后的大规模测序以及分子生物学和基因 诊断中发挥重要的作用。质谱法中发展较快的是基体协助激光解析离子化(MALDI) 一时问飞行质谱法用 来检测双脱氧循环产生的D

46、NA片段的序列，相关的延迟离子抽提技术(delayed ion exlraclion, DEMALDI),可提高 MALDI 分析精度，还有 MALDI' FOF' DNA 测序方 法。这一类技术提供了一种新的非凝胶碱基DNA测序方法，最终有可能比传统的方法学更 加快速，并为将来的大规模质谱DNA测序提供了可能。原子探针显微镜、扫描隧道显微镜(sTM)和原子力显微镜(AFM)新技术的发展， 使快速、高分辨直接观测DNA分子构象成为可能。流动式单分子荧光检测法也在发展中。3. 荧光原位杂交原位杂交(ISI, in situ hybr idization),是一种在保持组织、细胞或

47、染色体原有形态 结构的基础上，对其内部特殊核昔酸顺序进行检测及定位的分子生物学手段，可用于染色体 畸变分析。其原理是将己标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中的 DNA、RNA杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而到达对特殊目标顺序 进行检测、定位的目的：用放射性同位素标记探针和放射自显影曾一度作为惟一、高度敏感 的IsH手段。近年来，利用化学修饰合成核昔酸(如dig-uTP, duTP及ddUTFo等)，并将 这些核苜酸掺入可与被检目标序列杂交的RNA、DNA或寡核昔酸片段中，杂交后通过荧光 法、酶沉淀法或发色团检测来鉴定目标序列是否存在及其位置。荧光原位杂交(

48、fluorescence in situ hybridization, FIsH)是目前最常用的ISH手段之。(I)荧光原位杂交的原理和特点荧光原位杂交的基本原理为：只要两个核酸分了的碱基序列互补，就可在适宜条 件下形成稳定的杂交分子。FISH就是利用这一原理将标记探针同组织、细胞核或染色体 DNA进行杂交，在下改变其结构和分布格局的情况下进行细胞内DNA、RNA某特定序列 的测定。FISI-I可用于染色体精细结构分析，非整倍体检测，中期、间期细胞染色体数目分 析，微核来源鉴定及精子非整倍睦检测。荧光原位杂交技术具有操作及观察分析简便、立体 分辨率高、信号明亮清晰以及安全风险性小等优点。此外，

49、利用不同荧光物质所修饰的核昔 酸标记不同探针，可在同一样品中同时识别和分析多个目标顺序。特别是20世纪90年代发 展起来的多色FISH计术，在同细胞核或中期染色体中显示出不同的颜色，从而可同时检 测2种以上DNA的二维结构，制备出染色体的光谱核型，使全染色体的自动化分析得以实 现，大大拓宽了 FSH的应用范围。而20世纪90年代出现的DNAfibre。- FISH,除显著 提高了 FISH的空间分辨率外，也使FlsH灵敏度进一步提高。（2）荧光原位杂交技术一般程序一般包括探针制备、组织或细胞的处理、杂交以及信号的显示与分析。其流程如 T：DNA探针标记（利用化学修饰合成的核昔酸进行缺口平移、随

50、机引物或PcR扩增标 记）己经固定的组织、细胞或染色体与探针的变性处理D37qC湿盒内杂交272h荧光显微镜下直接检测杂交信号（探针上的信号分子可被激发荧光）以荧光标记抗体勺探针信号分子结合D荧光显微镜下观察杂交信号具体操作步骤包括： 制备和标记探针在遗传毒理学研究中一般用DNA探针。目前识别畸变的FlsH探针大致可分为染 色体序列探针、由许多DNA大片段组成的全染色体探针和着丝点探针。现在主要通过质粒 重组、PcR扩增和人工合成等3种途径制备探针。常用的探针信号标记方法有2种：直接 标记法。将荧光分子直接标记于探针DNA/RNA上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测J, 这种方式快速简捷，背景干

51、扰很少，但杂交信号较弱，且不能进一步放大，目前己较少采用； 间接标记法。采用一个中间分子标记探针，杂交后再用生物素或地高辛等荧光分子标记的 中间分子的亲和物或抗体进行检测。 染色体原位杂交杂交前变性处理染色体标本，使染色体DNA变为部分单链，并去掉附着的RNA及 蛋白质，变性处理生物素或地高辛修饰的探针。变性常用加热或碱变性，变性的温度和时间 随探针和组织类型的不同而变化，目的是为了保存组织的完整性和最大的杂交效率。变性后 的探针与变性后的染色体单链DNA在适合的温度、盐浓度等条件下复性杂交成双链。此后， 经一系列洗涤，将标本中未结合的探针或非特异性杂交的探针全部洗净。 荧光检测清洗后的标本用

52、荧光标记的试剂进行检测，对生物素标记的探针一般用荧光标记的 卵白素检测，而其他中间分子，主要采用荧光标记的相应抗体来检测。常用的荧光标记分子 有AMCA（蓝光）、异硫敏荧光素（绿光）、罗丹明（红光）、德州红（深红）等。 染色体显带通常在杂交后显带，如先进行常规显带，再进行FISH会明显降低杂交信号的检出率。 常用的显带方法包括：Actinomycin/DAPI显示G带、经浪服嚅嚏处理后再由Hoechest显 示R带,或采用Alu或Line重复序列与探针同时进行杂交，亦可得出显示G带或R带的效 果。 荧光显微镜检测荧光染料受到特定波长的光波激发便会在其所排布的位置上发光。此时选择合适的 滤色镜，

53、可在同一分裂相上观察到不同颜色的标记物。荧光镜检时显微镜的质量及滤片的选 择至关重要，特别是滤片系统，应严格按照相应荧光分子的荧光激发/发射光波长，选择最 适的激发/阻挡滤片组合。摄影记录系统由于固态电荷耦联扫描装置及图像分析仪的应用， 可以使背景着色很大程度地减低。应用激光共貌聚焦显微镜，可通过对染色片标本的不同平 面进行断层扫描，并将得到的结果经电脑处理，获得高质量的图像结果。4. 基因差异分析分子生物学的许多杂交、扩增技术都依赖于特定的探针或引物，才可检测到基因 改变的情况。而某基因的探针或引物的设计是在对该基因序列有定了解的前提下进行 的。对于未知序列的分析，此类方法往往无用武之地。各

54、种化学毒物和环境危害因素引起的 基因改变或新基因的出现大多是未知的。对于此类基因的分析更多应用的是差异分析技术。目前应用较多的是mRNA差异显示法以及新近发展的cDNA代表性差异分析法。(1) mRNA差异显示法IJiang和Pardee等于1992年最早报道了差异显示法(DDRTPCR, mRNA differential display)o其一般原理是，对mRNA进行反转录合成cDNA,在此基础上对每 一类cDNA的PCR选择性扩增产物进行凝胶电泳分析，寻找差异片段。该方法主要由以下 三部分组成： 用3'锚定引物对DNA进行逆转录； 用3,锚定引物及假设干数最一定长度的5'

55、随机引物对逆转录后的cDNA进行 PCR扩增，以获得代表不同mRNA的cDNA片段； 用测序胶别离PCR扩增后的cDNA片段，得出的差异片段在相同条件下再进行 PCR扩增、别离、纯化、克隆和测序，即可得到差异片段的序列。差异显示技术的不足之处主要是高频率的假阳性，有时甚至高达70%以上。为了 消除假阳性，应严格设置对照。Sompayrac(1995)曾提出一些降低假阳性的策略。近儿年来 随着此项技术的应用日益广泛，其方法也在不断改良之中。(2) cDNA代表性差异分析法1994 年 Hubank 等建立 cDNA 代表性差异分析(cDNARDA,cDNA representational di

56、ffer。. Ivo io )。该技术的基本原理是将差减杂交与PCR有机结合，利用双链DNA 为模板时可通过PCR呈指数扩增,而单链DNA为模板时呈线性扩增的原理，首先制备cDNA 并用限制性内切酶消化成平均长度为256bp的cDNA片段，随后利用PCR技术使cDNA片 段得以富集。接着连续进行3次差减杂交，最后再利用PCR技术富集特异表达基因。差减杂交法的工作过程是：从基因表达特异的组织中提取mRNA,反转录为cDNA, 然后与基因无特异表达的组织中提取的mRNA过量杂交，在基因特异表达的组织与基因无 特异表达的组织中均表达的基因产物形成了 cDNA / mRNA双链杂交分子，而特异mRNA

57、 转录的cDNA仍保持单链状态，将这种单链cDNA别离出来即为差异表达的序列。由于。DNA-RDA能发现与表型相关的基因异常，并能随基因表达的时效性不同 而别离出表达差异的基因，从而对基因的结构和功能有更多的了解。与mRNA差异显示法 相比，由于RDA进行了消减杂交，从而大大地减少了 mRNA差异显示中易于出现的假阳件 结果。同时，由于消减富集和PCR动力学富集的特点，可使mRNA差异显示法中难以显示 的稀有mRNA的cDNA得以富集并予筛选和克隆。在毒理学领域，基因差异分析用于寻找外源化合物或环境诱导基因的研究才刚刚 开始，但由于其在寻找未知新基因方面的独特优势，必将为分子毒理学的深入研究做

58、出奉献。5. 基因芯片检测基因芯片(gene chip),又称DNA芯片。基因芯片技术是新近出现的将电脑科学、核 技术、物理学、数学等学科的多种理论和技术有机结合而发展起来的具有划时代意义的新的 基因分析方法。它将成千上万个寡核昔酸固定在厘米大小的硅片上，将待测的材料用荧光素 或核素标记，在基因芯片上与探针杂交，通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描获取杂交探 针的荧光信号。其制作方法包括:原位合成法(in situ syonthesis)离片合成法(off chip synthesis) 及大规模的cDNA微排列。基因芯片的突出特点是可准确地确定突变位点及突变类型，尤 其是可以同时检测成千上万个基因乃至整个基因组的所有突变。它将核酸样品制备、核酸扩 增和定性定量