诱导性多能干细胞的制备、优势及临床应用前景

1、-诱导性多能干细胞的制备、生物学特性、优势及临床应用前景医科大学根底医学院 2021 级临床医学三大班16小班泽夫*摘要：2021年10月8日，John B. Gurdon与Shinya Yamanaka 因制备出诱导性多能干细胞induced pluripotent stem cells，iPSCs及相关领域的研究被授予诺贝尔生理学或医学奖。两位科学家在相差40多年的时间，探索着一个共同科学问题。1962年，戈登教授发现细胞的特化是可以逆转的。在一项经典实验中，他将美洲爪蟾的皮肤细胞核注入去核的卵细胞中，结果发现局部卵细胞依然可以发育成蝌蚪，其中的一局部蝌蚪可以继续发育成为成熟的爪蟾。戈登爵

2、士做出这一重大发现之时，正是山中伸弥出生之年。2007年，山中博士所在的研究团队通过小鼠实验，发现诱导表皮细胞使之具有胚胎干细胞特征的方法。此方法诱导出的干细胞可转变为心脏和神经细胞，为研究治疗多种心血管绝症提供了巨大助力。诺贝尔奖委员会认为，他们精彩的成果完全颠覆了人们对发育的传统观念，关于细胞命运调控和发育的教科书容已被重新改写。关键词：诱导性多能干细胞、制备方法、生物学特性、与ES细胞相比的优势、临床应用前景与试行治疗方案引言：诱导性多能干细胞iPSCs具有类似于胚胎干细胞(ESC)的全能性，又无道德伦理争议，而且来源广泛，防止了免疫排斥反响，为整个干细胞生物学领域和临床再生医学提供了新

3、的研究方向，因而被评为2021年年度十大进展之首。山中博士亦因在细胞重编程领域的出色奉献，获得了2021年诺贝尔生理学或医学奖。诱导性多潜能干细胞在疾病的模型建立与机制研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值，因此在用于临床治疗前，国外学者针对其平安性问题进展了广泛深入的研究，采取了多种措施提高诱导性多潜能干细胞的平安性。本文重点对诱导性多能干细胞的制备方法、生物学特性、与ES细胞相比具有的优势、临床应用前景和面临的问题及从理论上设计应用诱导性多能干细胞临床治疗帕金森病方案进展论述。1 .诱导性多能干细胞的研究历程2006年日本京都大学山中伸弥领导的实验室在世界著名学术杂志

4、?Cell?上率先报道了iPS的研究。他们选择已证实的与“分化能力相关的24种基因作为候选基因，寻找能够诱导细胞转化为其他类型的关键因子，通过研究，他们把Oct3/4、So*2、c-Myc和Klf4这四种基因通过反转录病毒载体导入小鼠胚胎或皮肤成纤维细胞，发现可诱导可诱导其发生转化，产生iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞极为相似。2007年11月，Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。所不同的是，日本实验室依然采用了

5、反转病毒引入Oct3/4、So*2、c-Myc和Klf4四种因子组合而Thompson实验室采用了以慢病毒载体引入Oct3/4、So*2加Nanog和LIN28这种因子组合。这些研究成果被美国?Science?杂志列为2007年十大科技突破中的第二位。2021年哈佛大学George Daley实验室利用诱导细胞重新编程技术把采自10种不同遗传病患者的皮肤成纤维细胞转变成iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、药物筛选等方面发挥重要作用。美国科学家还发现，iPS可在适当条件下定向分化，如变成血细胞，再用于治疗疾病。哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰

6、腺外分泌细胞，可以直接使其转变成与干细胞极为相似的细胞，并且可以分泌胰岛素，有效降低血糖。这说明利用诱导重编程技术可以直接获得*一特定组织细胞，而不必先经过诱导多能干细胞这一步。2021年，中国科学家于2021年11月利用iPS细胞培育出小鼠“小小。中国科学院动物研究所周琪研究员和交通大学医学院曾一凡研究员领导的研究组合作完成的工作说明，利用iPS细胞能够得到成活的具有繁殖能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞与胚胎干细胞具有相似的多能性。科学家表示，这一研究成果说明iPS细胞或许同胚胎干细胞一样可以作为治疗各种疾病的潜在来源。iPS细胞是由一些多能遗传基因导入皮肤等细胞中产生。在生成

7、过程中，2006年日本京都大学山中伸弥等，首次报道通过转录因子Oct3/4、So*2、c-Myc和Klf4，在体外直接将小鼠体细胞诱导成胚胎干细胞ESC样细胞，并将命名为诱导性多能干细胞induced pluripotent stem cells，iPSCs。随后，美国研究人员使用了四种遗传基因，同时参加了七种包括可阻滞特定蛋白合成的物质和酶在的化合物，以研究其各自的制造效率。研究结果显示，没有添加化合物时，遗传基因的导入率为0.01%至0.05%，而参加了叫“巴尔普罗酸的蛋白质合成阻滞剂之后，导入率竟升至9.6%至14%。如果从这四种遗传基因中排除导致细胞癌变的遗传基因，只使用三种基因，过去

8、的导入率只有0.001%，甚至更低；而参加“巴尔普罗酸之后，其效率提高了约50倍。研究人员认为，这很可能是因为“巴尔普罗酸可以促进多能遗传基因的活性。今后，研究人员将就添加化合物是否会使遗传基因产生变异展开研究，以在提高制造效率的同时保证平安性。2.诱导性多能干细胞的制备方法到目前为止，iPS技术已相继在小鼠Takahashik等，2006、人Takahashi K等，2007；YuJ等，2007、猕猴Li P等，2021和猪Esteban MA等，2021上取得了成功。目前基因导入技术是制备iPS细胞的主要技术，基因载体的改良推动无遗传修饰iPS细胞的建立。载体主要有整合型载体、非整合型载体

9、及新型载体。早期使用的病毒载体，如反转录病毒载体、慢病毒载体、诱导表达的慢病毒载体、单一慢病毒载体及piggyBac转座因子都属于整合型载体。要想了解诱导性多能干细胞的制备方法，首先需要对干细胞、诱导性多能干细胞的概念有一定的认识。因此这里先介绍干细胞、诱导性多能干细胞及相关其他物质的概念，在主要介绍反转录病毒载体介导的iPS细胞的诱导。2.1干细胞的定义及其根本特性干细胞stem cells是指一类具自我更新和多向分化潜能的细胞，它们具有自我复制能力，并且在一定条件下能分化成各种具有特定功能的体细胞(somatic cells)。自我更新是指细胞分裂之后能够维持其原有特性的能力。具有自我更新

10、能力的细胞经过细胞分裂之后，所产生的子细胞中至少应有一个与母细胞是完全一样的。多向分化潜能是指能够分化形成不同类型组织细胞的能力。同时，这一概念狭义上讲，也包括单能干细胞unipotent stem cells，只具有分化成机体特定的细胞和组织的能力。2.2诱导性多能干细胞的定义诱导性多能干细胞是指由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。具体定义是向皮肤组织等细胞中导入特定基因或是特定基因产物蛋白质，使该体细胞变成具备如同胚胎干细胞般，具有分化成各种细胞之分化能力，并且可以持续增生分裂的细胞。2.3参与维持干细胞特性的主要在调控因子Oct4也称为Oct3/4由Pou5fl

11、基因所编码，是一个POU蛋白构造域转录因子。Oct4特异性表达在小鼠早期胚胎具有全能性的所有细胞、未分化的小鼠ESCs、畸胎瘤细胞和胚胎生殖细胞中，而在胚胎成纤维细胞和ESCs分化得到的细胞中几乎不表达。Oct4是维持干细胞的关键分子之一，它的表达水平决定了干细胞的命运。Oct4基因敲除的小鼠胚胎只能发育到类似囊胚阶段，但是囊胚的细胞全部为滋养外胚层细胞，因此它被认为具有抑制细胞团细胞分化为滋养外胚层和其他细胞器的功能。Oct4在ESCs中的功能主要是通过与其相互作用的蛋白及其调节的下游靶基因基因而实现。Nanog是一个NK-2家族的同源盒homeobo*转录因子，它的细胞团具有全能性的细胞中

12、广泛表达，也可以在未分化的ESCs、原始生殖细胞和EGCs中被检测到。Nanog的功能是维持胚胎的原始外胚层细胞，而抑制原始皮层的形成。它通过转录抑制促进分化发生的基因来调节ESCs的分化。对于Nanog在胚胎发育过程中和ESCs分化过程中的详细调控机制，还需要更多的实验数据来说明。2.4细胞重编程的机制细胞重编程是指由体细胞向全能细胞的转变。细胞的重编程是一个极其复杂的过程，其机制的研究对诱导性多能干细胞细胞的制备、制备效率的提高、平安性的评估、临床应用都有着非常重要的作用。目前关于重编程的机制普遍认为，体细胞通过导入外源性的转录因子可以激活源性的 Oct4 与 So*2 的表达，一旦源性的

13、 Oct4 与 So*2 得以表达后，便会迅速在细胞形成一个自我调节的网络用以维持诱导性多能干细胞的多能性，此后即不再需要外源性基因的诱导与维持20。对于在重编程中每种转录因子的具体作用、不同转录因子的组合是否通过相似的机制等问题人们还知之甚少，还有待于进一步的研究。2.5诱导性全能干细胞的制备方法iPS 细胞系的建立主要包括以下几个步骤：重组因子的选择。目的细胞的选择。重组因子的导入。重组因子在目的细胞的表达。iPS 细胞的产生。重组细胞的鉴定。以下本文将重点介绍人的iPS细胞的诱导步骤。主要实验仪器设备：移液器10l、200l、1000l、常温离心机、高速冷冻离心机、电泳仪及电泳槽、梯度P

14、CR仪、超净工作台、紫外凝胶成像系统、架盘天平、生化培养箱、注水式恒温培养箱、恒温水浴锅、电热鼓风枯燥箱、电热恒温水槽、旋涡混合器、超低温冰箱、荧光倒置显微镜主要实验试剂配制：DMEM根底培养液：将DMEM粉溶于超纯水中，参加3.7g碳酸氢钠，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，0.22m滤膜过滤后分装于培养瓶中，4备用。PBS缓冲液pH7.4：称取PBS粉剂9.55g，溶于1L超纯水中，高压灭菌，通过0.22m滤膜后分装于灭过菌的培养瓶中，4备用。0.1mmolL-巯基乙醇：-巯基乙醇原液70l溶于10ml灭菌超纯水，0.22m滤膜过滤后无菌分装，-20冰箱保存。0.1%明胶溶液：将0.2g明胶粉剂溶

15、于200mlPBS溶液中，高压灭菌，0.22m滤膜过滤后无菌分装，-20冰箱保存。0.25ml胰酶：将0.25g胰酶和0.04gEDTA溶于100mlPBS溶液中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，0.22m滤膜过滤后无菌分装，-20冰箱保存。1mgml 型胶原酶：将100mg胶原酶粉溶于100ml根底培养基中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，0.22m滤膜过滤后无菌分装，-20冰箱保存。成体细胞培养液：DMEM根底液中参加10%FBS，0.22m滤膜过滤后分装于培养瓶中，4保存。iPS细胞培养液：KO-DMEM中参加10%ES血清VV,10%胎牛血清VV，2molL谷氨酰胺，0.1mol/L非必需氨基酸，

16、0.1mol/L-巯基乙醇，10ng/mlbFGF，10ng/mlLIF，50mg/青霉素和链霉素。2 先用凝胶预包被一个T25瓶，包被时间约为10分钟。接种皮肤成纤维细胞并培养，待细胞生长良好时，用0.25%胰蛋白酶消化，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，之后取出用于感染实验所需的细胞量，比方1×105个。假设感染1×105个细胞，以感染比例101计算出所需的病毒量，将所需的各个病毒量参加一个15ml离心管中，混匀后，用0.45m过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质，以免对后续实验产生影响。然后将1×105个细胞参加已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积

17、最后足至5ml，最后参加5l助转剂凝聚胺，使用浓度为10g/ml，将整个体系混匀后转移到已经包被好的T25瓶中，摇匀后放入37培养箱中过夜。病毒感染24h后，第一天将昨日感染的细胞消化下来，铺到事先准备好的MEF上。按T75瓶每瓶铺5×104个细胞铺2个T75瓶即可。第二天将DMEM培养液换成hESC培养液继续培养，以后2d换液一次。逐日观察，待细胞长至第5至7天时，可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变成圆形，生长聚集在一起。直至第12天，由于MEF使用时间过长，故培养基换成CM9(条件培养基)+HES(hESC正常培养基)的11混合液，以给细胞提供充足的营养。待细

18、胞长至第20天左右，可以挑克隆，将ES样克隆挑至新的MEF上，按hESC培养方法继续扩增。iPS克隆与正常的人类胚胎干细胞在形态上根本无异。iPS细胞的鉴定。iPS细胞的鉴定主要包括以下几种：碱性磷酸酶活性检测，干细胞外表标记物的免疫染色检测，干性因子的去甲基化分析，干细胞源基因的表达分析，端粒酶活性检测，核型检测，拟胚体形成，畸形瘤形成实验。3.诱导性多能干细胞的生物学特性诱导性多能干细胞的出现，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域及生物医学研究领域都引起了强烈的反响，这不仅是因为它在根底研究方面的重要性，更是因为它为人们带来了光明的应用前景。这都要得益于诱导性多能干细胞的生物学特性。以下将

19、对诱导性多能干细胞的生物学特性进展阐述。由于诱导性多能干细胞的生物学特性与胚胎干细胞极为相似，故先引出胚胎干细胞的概念与特性。3.1胚胎干细胞及其生物学特性embryonic stem cells胚胎干细胞来源于早期胚胎囊胚的细胞团inner cell mass，ICM，具有发育的全能性，能够分化成胚胎本身中外三个胚层细胞包括生殖细胞，是生物体多种体细胞的祖细胞。从胚胎中别离出来之后，ESCs可以在体外特定的培养条件中长期维持稳定的生长状态。小鼠ESCs系是1981年首次别离得到的，现已成为研究得最清楚的多能性干细胞类型。人类ESCs系则是1998年才得以别离鉴定。目前已建系的其他物种的ESC

20、s系包括鸡、恒河猴、大鼠等。总体而言，ESCs的根本生物学特性通常包括以下几个方面：碱性磷酸酶alkaline phosphate，AP染色强阳性。高表达多能性相关基因，包括Oct4、Nanog、So*2和Re*1等转录因子，小鼠ESCs还表达细胞外表分子SSEA1，人ESCs则表达SSEA3、SSEA4，但不表达SSEA1。体外多向分化能力。ESCs在体外培养的过程中，去掉维持自我更新的细胞因子且在悬浮培养的条件下，ESCs形成球状的三维构造，称为拟胚体，最终可以分化成体不同胚层来源的细胞类型。畸胎瘤形成能力。将一定量的ESCs注入免疫缺陷小鼠的皮下、肌肉或睾丸组织时，能够形成包被完整的畸胎

21、瘤组织，组织含有ESCs分化形成的三胚层细胞类型，常见的包括神经管外胚层、软骨和肌肉组织中胚层，以及呼吸道或肠道腺体组织等胚层等。嵌合体形成能力。嵌合体chimera是指一个个体含有两种以上基因型的机体。通过显微注射或聚合aggregation的方式将ESCs注射到同一或不同品系的胚胎囊胚或桑葚胚，再将胚胎移植回代孕母鼠体，可以得到生殖系嵌合体。4倍体补偿能力tetraploid plementation正常小鼠的胚胎均为2倍体细胞，在胚胎发育到2细胞阶段时，用电或化学融合的方法使两个细胞融合成一个细胞，所得到的细胞为4倍体细胞，4倍体胚胎不能发育出正常的个体，仅能形成胚盘。此时如果将一种多能

22、干细胞注入4倍体囊胚，可以获得一个完整的动物个体。3.2诱导性多能干细胞的生物学特性诱导性多潜能干细胞经过筛选后，需要进展生物学特性鉴定，目前，研究人员主要通过形态学标准、标志分子的表达、表观遗传状态、基因表达模式和发育潜能等方面对诱导性多潜能干细胞其进展鉴定。主要通过以下几个方面进展：细胞形态学观察与AP染色：生长在饲养层上的人诱导性多潜能干细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰；克隆细胞排列严密，细胞体积小、核大、细胞核/质比高，AP染色呈阳性。利用免疫荧光检测胚胎干细胞标志性抗原的表达：包括TRA-1-81，TRA-1-60，SSEA4，Nanog和 SSEA3等。提取诱导

23、性多潜能干细胞总RNA， qRT-PCR检测胚胎干细胞源性多功能基因及转基因表达情况：源性多功能基因包括Oct4，So*2，Nanog， Lin28，Sall4， Nodal，Dppa2，TERT，TDGF1，DPPA4 等。诱导性多潜能干细胞染色体核型分析。悬浮培养观察拟胚体形成及体外分化情况。诱导性多潜能干细胞接种至SCID小鼠皮下，观察畸胎瘤形成及体分化情况。诱导性多潜能干细胞与胚胎干细胞有着相似的特性，其中一个最重要的特性就是具有强大的自我更新能力以及向分化潜能且具备全能性。诱导性多潜能干细胞具有与胚胎干细胞类似的形态和生长特性，同时也表达胚胎干细胞的特异性标记；实验证实将细胞移植入裸

24、鼠皮下，可以生长出3种不同胚层来源的畸胎瘤，这说明诱导多潜能干细胞具有多分化潜能；研究者通过亚硫酸盐基因组测序法、萤光素酶报告基因实验、染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecitation，CHIP)技术，发现了诱导性多潜能干细胞与胚胎干细胞具有相似的DNA 甲基化模式和组蛋白修饰情况。4.诱导性多能干细胞与ESC细胞相比具有的优势iPS细胞的出现，在干细胞领域、表观遗传学领域及生物医学研究领域都引起了强烈的反响，这不仅是因为它在根底研究方面的重要性，更是因为它为人们带来了光明的应用前景。为什么诱导性多能干细胞可以成为生物相关领域的一颗璀璨的明星.为什么诱导性多能干细胞能

25、够取代胚胎干细胞在学者眼中传统的地位.为什么诱导性多能干细胞备受青睐.与胚胎干细胞相比，诱导性多能干细胞终究有怎样的优势.下面本文将从两个角度对诱导性多能干细胞的优势予以阐述。从实际应用方面，虽然胚胎干细胞具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，因此其在再生医学、组织工程和药物发现与评价等领域极具应用价值，但是胚胎干细胞在细胞来源、免疫排斥、伦理、和法律等方面存在诸多限制。诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS 细胞)技术的出现使人们从上述争论中解脱出来，因其在形态学、干细胞标志物表达、表观遗传学、基因表达谱以及细胞类型特异的分化潜能

26、方面与胚胎干细胞极其相似，并且个体特异来源的 iPS 细胞不涉及免疫排斥问题，所以 iPS 细胞成为细胞治疗以及组织器官再生最有前景的种子细胞。具体而言，iPS细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎。这在技术和伦理上都比其他方法更有优势，iPS细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离，iPS细胞在细胞替代性治疗以及发病机制、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。此外，iPS细胞在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现，iPS细胞在体外已成功被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。在临床疾病治疗中具有巨大的应用价值。从伦理学角度，与经典的胚胎干细胞

27、技术不同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此无伦理学的问题。利用iPS细胞技术可以用患者自己的体细胞制备专有的诱导性多能干细胞，从这一层面讲，iPS技术同样不会产生伦理问题，理论上讲也不会产生免疫排斥问题。5.诱导性多能干细胞的应用前景和面临的问题5.1诱导性多能干细胞的应用前景由于诱导性多潜能干细胞与胚胎干细胞的生物学特性非常相似，且不涉及伦理道德问题，因此具有较高的应用价值。诱导性多潜能干细胞可用于分化和移植，还可以建立疾病模型、研究疾病的发病机制、新药物的筛选以及开发出新的治疗方法。诱导性多潜能干细胞用于建立疾病模型：疾病模型是人们研究疾病发生机制和病理过程的重要根底，但一些人类疾病

28、并不能完全找到细胞或者实验动物模型，诱导性多潜能干细胞的建立可弥补这一缺陷。而体外疾病模型的建立有利于从细胞水平研究疾病的发病机制，进一步也可用于测试新药的毒性和疗效的观察。2021年，哈弗大学George Daley实验室利用诱导细胞重编程技术把采自10种不同遗传病患者皮肤细胞转变为诱导性多潜能干细胞。Thomson等将脊髓性肌萎缩症患者皮肤细胞诱导成的诱导性多潜能干细胞具有脊髓性肌萎缩症特有的基因型，这项研究首次证实了诱导性多潜能干细胞可用于建立疾病模型用于发病机制的研究和治疗药物筛选。Studer等首次在体外重现用患者神经细胞诱导成的诱导性多潜能干细胞从发育到死亡的整个过程。2021年，

29、Peng研究者在?国际生物医学研究?杂志上发表，诱导性多潜能干细胞可以在体外分化为男性生殖细胞，这一项研究为治疗不孕不育症提供了一个很好的研究受精卵发育分子机制的模型。此外，研究者们还用诱导性多潜能干细胞建立了其他疾病模型，如地中海贫血症以及家族性自主神经功能障碍症等。总体来看，相比于诱导性多潜能干细胞用于临床治疗的不确定性，在建立疾病模型、研究发病机制和新药筛选方面可能具有更好的优势。诱导性多潜能干细胞研究飞速开展，虽然现阶段诱导性多潜能干细胞还不能完全取代传统干细胞研究，技术也存在一些有待解决的问题，但是今后诱导性多潜能干细胞的研究会成为生命科学领域的一个重要方向，随着研究的不断深入，在提

30、高转化效率和平安性后，诱导性多潜能干细胞将有望应用于临床治疗。5.2诱导性多能干细胞在当前阶段面临的问题目前iPS细胞的研究还存在较多问题。平安性：因为iPS细胞建立的过程中导入了致瘤细胞c-myc，使得iPS细胞具有致瘤风险，从而在iPS移植部位或远离部位形成畸胎瘤或其他肿瘤，另外由于所用的病毒载体能随机永久整合到基因组，可能引起基因突变，这也为iPS细胞应用于临床治疗带来风险。转化效率低：iPS细胞生成效率非常低，而用于移植时所需要足够的细胞方可。因而需要研究更加提高效率的方法。免疫排斥反响：虽然iPS细胞可以由病人体细胞转化而来，但是在细胞重编程的过程中，其免疫原性是否会发生变化，目前尚

31、不清楚。源细胞的差异：各种细胞都可以重编程为iPS细胞，则在临床应用的时候到底用哪种组织来源的细胞最好呢.青年人与老年人来源的iPS细胞一样吗.老年人的体细胞已经有了各种各样的突变，则由此转化而来的iPS细胞会带来这些突变吗.各个不同组织的iPS细胞特征一样吗.这些问题目前仍不清楚。迄今为止各个实验室建立iPS的方案不一，需要形成一种成熟稳定快速的可以获得纯的iPS细胞的共识。6.神经系统疾病的诱导性多能干细胞治疗诱导性多能干细胞具有自我更新和多向分化的生物学特性，在生理或病理情况下能维持组织器官环境的稳定等特点，近年被广泛用于再生医学的研究。研究说明通过各种方式移植不同来源和种类的诱导性多能

32、干细胞进入不同疾病宿主体，均取得了许多可喜的成果。但是，仍存在许多亟待解决的问题，诸如诱导性多能干细胞治疗作用机制、诱导性多能干细胞移植的途径、诱导性多能干细胞治疗的平安性等。以下本文将在通过文献综述从理论上提出应用诱导性多能干细胞对神经系统疾病的治疗方案，仅以治疗帕金森病为例。首先对帕金森病的发病机制和国际上其他学者的研究进展进展介绍。6.1国际上学者对神经系统疾病的研究进展Tatsuy Yoshikawa等研究者报道，系统性应用丙戊酸和唑尼沙胺可以促进诱导性多潜能干细胞分化为多巴胺能神经元细胞，此项研究可以应用于治疗帕金森疾病的黑质纹状体多巴胺能神经元的缺失，为一些神经系统功能性损伤及缺失

33、的疾病带来希望。Michel 等最近报道了来源于自体神经前体细胞的诱导性多能干细胞移植治疗帕金森病患者，对于该种治疗方法的长期平安性以及治疗效果是个有益的尝试。6.2帕金森疾病的发病机制帕金森病Parkinsons disease，PD是第二个常见的神经变性疾病，其主要特征是静止性震颤，肌肉强直，运动*缓以及平衡和协调功能的受损。其他的病症包括自主神经功能失调，肌肉痉挛以及痴呆等。典型的病理改变为黑质多巴胺神经元的缺失以及路氏小体的出现。老年人中多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。在我国，65岁以上的老年人PD患病率大约为1.7%，患者多见为散发病例，其中只有不

34、到10%的具有家族病史。帕金森病确实切病因至今未明，遗传因素、环境因素、氧化应激、年龄老化等均有可能参与PD多巴胺神经细胞的变性死亡过程。6,3应用诱导性多能干细胞治疗帕金森病的理论方案帕金森病目前的治疗策略是应用产生多巴胺的细胞来替代变性的多巴胺神经元。对特发性帕金森病患者的体细胞通过重编程技术而获得患者特异性的诱导性多能干细胞，其能够保持多向分化潜能而且与人胚胎干细胞特性很接近。可以取患者的体细胞如人成纤维细胞，通过逆转录病毒将Oct3/4、So*2、c-Myc和Klf4这四种基因导入人成纤维细胞并通过筛选最终获得一些具有胚胎干细胞特性的细胞，即诱导性多能干细胞。将产生的诱导性多能干细胞在

35、体外培养、扩增可建立稳定的疾病特异性诱导性多能干细胞系，其保存了患者身上特有的基因组学特征。获得患者对疾病特异性的专有诱导性多能干细胞后，将诱导性多能干细胞悬浮培养形成拟胚体，通过无血清培养基筛选得到神经上皮样细胞。预计此时得到的神经上皮样细胞可以具有神经前体细胞的典型形态，还均匀表达神经干细胞的外表标志物nestin、So*2和Brn2等。将筛选得到的诱导性多能性干细胞注入患者的病变组织，手术完毕后观察。预计治疗效果：可见诱导性多能干细胞广泛迁移到大脑各个区域，分化多巴胺能样神经元和各型神经细胞，可以与周围的神经细胞发生广泛的突触联系，并检测到自发的动作电位。并且能够检测到多巴胺分泌水平的正

36、常化或趋向于正常化。患者的侧向运动功能障碍明显得到改善，但未见运动功能彻底恢复，这与诱导性多能干细胞筛选的纯洁程度有密切的关联。诱导性多能干细胞移植治疗通过替代损失的多巴胺神经元以恢复神经传递，不仅能补充多巴胺神经元在脑的含量，而且能保护残留的多巴胺DA能神经元。7.总结与展望综上，当前iPS领域的研究方向包括：(1)优化、高效、平安的iPS细胞制备技术，最终得到可用于临床的iPS细胞；(2)研究重编程的分子机制，指导建立和完善定向诱导iPS细胞神经分化的方法；(3) 将病人的体细胞重编程为iPS细胞，用来研究疾病的发生机制和筛选药物；探索疾病特异性iPS细胞衍生的神经细胞移植后在稳定生长和增

37、殖的方法及临床评估体系。诱导性多潜能干细胞在建立疾病模型、研究疾病发病机制以及新药物的筛选和新治疗方法的建立方面有着巨大的应用前景，且诱导性多能干细胞也有较高的临床应用价值，但是，在诱导性多潜能干细胞应用于临床这条道路的探索过程中，还有许多亟待解决和深入探究的问题。诱导性多潜能干细胞的平安性：利用反转录病毒和慢病毒转染的方法对细胞进展重编程，有很大的致瘤风险，如何抑制基因转染带来的风险还需要进一步探讨研究。诱导性多潜能干细胞的重编程效率：重编程的效率低是诱导性多潜能干细胞重编程技术的一个障碍，如何寻找一种高效率且平安性高的重编程方法也是亟待解决的一个问题。重编程的分子调控机制目前还不是很清楚，人们对诱导性多潜能干细胞重编程的机制认识仍处在一个初级阶段，尚不存在一个公认的重编程机制的理论模式。寻找更优化的诱导体系来提高诱导性多潜能干细胞的诱导效率及质量、解决诱导性多潜能干细胞