核素示踪在细胞动力学中的应用

1、第十五章核素示踪在细胞动力学中的应用第一节细胞周期一、细胞动力学的研究内容细胞增殖是一个极其复杂的问题。近年来，随着新技术的发展与应用，在细胞形态学研究的基础上，对细胞增殖研究已形成一门新学科细胞动力学（cell kinetics）。它是从定量的角度，研究机体内各类细胞的增殖、分化、分布与消亡的规律，以及体内外多种因素对其的影响与调控过程。因此，细胞动力学是生物学中一门研究范围广泛、实用性较强的分支学科。二、细胞周期细胞周期（ cell cycle ）是指从一次分裂结束到下次分裂终止所经历的过程。它包括了细胞生长和分裂周期 ( 图 15-1) 。无增殖力细胞或凋亡细胞死亡G0图 15- 1 细

2、胞周期示意图很久以来，细胞分裂现象就被人们所注意，并对分裂期细胞进行了大量的形态学研究。20 世纪 50 年代初， Howard 对 32P-磷酸盐培养的 RNA酶处理过的蚕豆尖细胞进行研究，借助放射自显影术，首次证明被标记的细胞不是分裂期细胞，而是间期细胞，表明DNA合成是在间期完成的。并发现在开始标记后8 h 才出现标记的分裂核，持续6 h 后开始减少。这种变化每 30 h 出现一次， 因此，便提出细胞周期的概念。20 世纪 50 年代末， Quastler 和 Sherman用 3H-TdR 和放射自显影术对动物的细胞周期进行研究，进一步证明 DNA合成确实是在间期完成的，在细胞周期活动

3、中的确存在着DNA合成期（ DNA-synthetic phase， S）和细胞分裂期（ mitotic phase ， M）。在 S 期和 M期之间以及 S 期之前，各有一个间隙期，分别称为 DNA 合成后期（ gap 2 phase ， G2）和 DNA 合成前期（ gap1 phase ， G1）。进而将连续的细胞周期划分为 4 个互相衔接的时相，即 G1 期、 S 期、 G2 期和 M期。在不同的时相中，增殖细胞经历着不同的生化和形态学变化： G1 期：细胞代谢十分活跃，DNA合成所需要的酶类（如激酶、225聚合酶、合成酶和脱氨酶等）、各种RNA、结构蛋白质都在该期内合成。正常细胞在本

4、期有一个或两个特殊的调节点,叫限制点 (restriction point, R点 ), R点起到了控制细胞增殖周期开和关的”阀门”作用。细胞是否继续增殖或进入静息(G0) 状态 , 由它能否通过R 点来决定的。肿瘤细胞通常失去全部或部分R 点的控制，使其不断分裂。处于R 点的细胞对环境条件特别敏感，当细胞处于不利条件时，细胞代谢速度降低，进入静息期以延长细胞生命。G1 期的时间长短变化最大，不同细胞类型的周期时间的差别，细胞的失同步等都是由G1 期的差异造成的。S 期：完成 DNA的复制及组蛋白和非组蛋白等染色体蛋白的合成，继续合成RNA，并形成有丝分裂需要的细胞器（如中心粒）。 G2 期：

5、继续合成RNA及有丝分裂所必需的特异性蛋白质。主要特征是染色体进行性地凝聚或螺旋化。此期还诱导细胞进入分裂的各种变化，中心粒移向两极，细胞准备进入有丝分裂。M 期：细胞完成有丝分裂，形成两个完全相同的子细胞。新生的子细胞又开始一个新的细胞周期。Go 期细胞在细胞分裂完成之后，一般只有部分细胞进入下一个细胞周期，其他未进入周期的细胞暂时处于休止状态，与处于周期中的细胞不同，但具有进入细胞周期的潜能，这类细胞被称为 G0 期细胞。大部分 G0 期细胞的 DNA含量与 G1 期细胞相同（ 2n）。仅少数 G0 期的淋巴细胞可能与 G2 期细胞相似（ 4n）。在适当刺激下， G0 期细胞能重新进入细胞

6、周期。而且在给予刺激后， G0 期细胞可不必经过 G1 期，可以直接进入 S 期。 G0 期细胞与 G1 期细胞的主要区别是两者在蛋白质合成上有明显差别。前者代谢不活跃，对射线和药物均不敏感。三、常用的术语、指数与参数细胞动力学是从量的角度上研究增殖细胞群体的动态变化。在一个增殖细胞群体中，同时存在着细胞的增殖、输入和输出。要正确地反映出它们之间的关系，必然涉及到能反映这些关系的动力学指数与参数。由于细胞动力学是门新学科，为便于掌握其全部内容，应熟悉其基本术语、指数与参数。（一）细胞群体的有关术语（ 1）细胞群体指形态与功能或空间位置上相似或相关的细胞群体，如造血细胞、 肿瘤细胞、白血病细胞等

7、。（ 2）同步化的细胞群体即处于同一细胞周期时相的细胞群体。（ 3）稳定状态的细胞群体是指细胞输入和细胞增殖速率等于细胞输出率，即细胞群体的大小不变、增殖速率保持恒定的细胞群体。（ 4）指数方式生长的细胞群体是指群体中所有的细胞都处于增殖状态，并具有相同的生长速率和细胞周期时间，无细胞丢失的细胞群体。（ 5）细胞丢失（cell loss）细胞增长是否保持平衡，除取决于细胞周期时间的长短和增殖比率的高低外，还决定于细胞的死亡和转移，这往往用 “细胞丢失” 这一概念来表示。（二）指数（ 1）生长分数（ growth fraction ，GF） 也称为增殖比率。这个概念表示在整个细胞群体中 , 进入

8、周期参加增殖的细胞的比例或百分数。226（ 2）有丝分裂指数（ mitotic index ，MI） 该指数表示正进行有丝分裂的细胞占细胞总数的百分率。（ 3）标记指数（ labelling index， LI ） 常指被 3H-TdR 标记的细胞在细胞群体中所占的百分比例。在用流式细胞仪时常用S 期细胞比例（ S phase fraction,SPF）表示，见下式：SPF(%)S100%G0 /G1SM（三）参数细胞周期的动力学参数主要有T 、T、T 、T、T、T 和 T。T 、T、T 、T 分别为 G、G1SG2MCoDG1SG2M1S、 G 和 M期持续时间。 T 、 T 、T 、T 之

9、总和为 T ，即细胞周期时间。2G1SG2MCT为细胞更新时间（ turnover time）, 即更新的细胞数量等于原来整个细胞群体的细胞o数量所需要的时间。TD 为倍增时间（ doubling time ） , 指处于增殖状态的细胞群体中细胞数每增加一倍所需要的时间。上述参数中，T s 和 TC 的测定对了解细胞增殖状况更有实际意义。而在细胞生长的动力学分析中常用两个相似的参数为TC 与 TD。第二节细胞动力学研究方法细胞动力学研究方法可分为两大类：放射性核素标记法和非放射性标记法。随着流式细胞仪地广泛使用，荧光标记方法目前已较普遍。但放射性核素标记法较为经典和可靠。一、放射性核素标记法自

10、从细胞学中引入放射性核素标记和放射自显影技术，便为研究细胞群体的生长和总数的变化提供了重要工具。细胞动力学研究常用的标记化合物，主要是3H-TdR。外源性TdR只能被处于S 期的细胞所利用，没被利用的TdR 在机体内很快分解成不可利用的产物。TdR 与其分解产物都是可溶性的物质，而DNA则是不溶性的，所以，在制备标本过程中很容易将它们分开。静脉或腹腔注射的3H-TdR，在血液中的清除时间很短，组织或细胞利用3H-TdR 进行 DNA合成的有效时间大约为30 60 min 。因此，动物注射一次标记量的3H-TdR 后，细胞利用的效果或标记效果相当于体外与3H-TdR 一起温育30 60 min

11、的效果。然而3H-TdR 在体内外的清除率不同，后者在30 60 min 内其浓度基本上无明显变化。应指出在长期培养条件下，用3H-TdR 作 DNA的标记，可能会产生同位素效应，近年发现胸腺嘧啶核苷可能有池效应（ pool effect）和再被利用现象。因此，已有人采用125I-UdR（ 5-碘 -2- 脱氧尿嘧啶核苷）估算肿瘤细胞的丢失率。放射性核素标记法常采用放射自显影和液体闪烁（液闪）测量两种技术。放射自显影（ ARG）：是研究细胞动力学最常用的方法之一。显微镜自显影是基本实验方227法。在临床医学进行细胞动力学测定时，为缩短曝光时间，常用高速闪烁自显影和金潜影化自显影。后者在显影前将

12、标本浸入新配制的金盐溶液中，活化核乳胶中已形成的潜影，这种处理使曝光时间缩短至6 h 3 d 。金潜影化溶液的配方：将KAuCl4 75.6 mg 和 KSCN 100 mg溶于 20 mL 三蒸水中，冷却至5后，加入KBr 300 mg ，溶解后再加三蒸水至300 mL, 混匀后备用。液体闪烁计数法：在无菌条件下，向处于对数增殖期的细胞培养体系中加入3H-TdR（最终浓度 37 kBq mL），标记 10 min 后，弃上清液，再用 20 mL 7.5 mmol· L 1 的 TdR（ 36.2 mg TdR 20mL）洗涤 l min，立即加入培养液， 37培养，定期制备细胞标本

13、进行液闪测量。根据细胞标本的放射性计数（ cpm）和相对应的间隔时间作图，计算细胞周期时相参数。该方法优点是简单、准确、快速。在实际工作中，根据对细胞中DNA标记时间、次数及标记后采样次数，又将放射性核素标记方法具体地分为：（一）脉冲标记脉冲标记（ pulse labelling）采用比细胞周期中DNA合成期短的标记时间。该标记方法比较实用。非同步细胞群体暴露于3H-TdR 10 30 min ，只能标记正在通过S 期的细胞。在标记后不同的时间间隔内制备自显影标本，可进行3 种分析：标记百分率、颗粒计数减半和标记的有丝分裂细胞数，并依据3 种分析，对细胞周期及各时相的相应时间进行测定。脉冲标记

14、实验根据取材方法不同，又分为一次取材和多次取材法两种研究方法。这两种方法都可进行整体和离体实验。1. 一次取材法整体实验，在静脉或腹腔注射3H-TdR 后 30 60 min 内，处死动物取材；离体实验在细胞悬液与3H-TdR 一起孵育 15 30 min 后，用不含3H-TdR 的培养液洗涤细胞，制备放射自显影标本。镜检与计数标记细胞，计算标记指数。公式：LINS（15.1 ）NC式中， N s 为标记细胞数； N c 为处于周期中的细胞数。在稳定的细胞群体中，处于某一时相中的细胞数量与该时相的长短成正比，因此TS(15.2)LITC若已知 T s，便可求得T c 和 T o。当 GF l

15、时， T c To。而按指数方式生长的细胞群体的Tc 则为：TCTS log e2(15.3)LI2. 多次取材动物注射一次标记量的3H-TdR，或在体外细胞与3H-TdR 作短期（ 10 30 min ）温育，然后多次取材，用自显影法，追踪观察标记细胞或标记分裂细胞的动力学变化，这种研究方法称为脉冲追踪法 （ pulse chase method ）。在其标记的细胞分裂指数曲线（ fraction labelledmitosis curve， FLM）图中，曲线的形状或所测定的细胞周期各时相的持续时间都受标记时228间的影响。一般体外实验，标记时间控制在30 min 之内。多次取材测定细胞周

16、期常用两种方法。(l) 标记有丝分裂百分率（ percentage labelling mitosis， PLM）其原理是：当机体内或培养体系中引入3H-TdR，处于 S 期的细胞全部被标记，这些细胞进入M期，表现为染色质被标记。于不同时期制备自显影标本，计数有丝分裂细胞中的被标记细胞，求出PLM。公式 :标记有丝分裂细胞数100%PLM(15.4)有丝分裂细胞总数根据 PLM与其对应的时间，绘制曲线，可求出细胞周期及各时相的持续时间( 图 15-2) 。图 15-2 实际可能出现的 PLM曲线及其细胞周期各时相的求法图 15-2 是一个理论模型，是细胞个体间没有差异情况下的动力学过程，脉冲标

17、记结束，原处于 S 期的细胞均被标记。标记细胞进入M期之后，便出现标记的M期细胞。从S 期到 M期，应经过G2 期。开始的一段时间内PLM为零。所以从脉冲标记开始到出现标记M期这段时间间隔为 G2 期。随着原标记的S期细胞陆续进入M期，PLM逐渐上升，并达到最高点 （ 100）。从出现标记M期细胞到PLM达到最高点，这段时间间隔即TM期。当被标记的S 期细胞全部进入 M期，而且标记时处于G1 期的非标记细胞也开始进入M期，使 PLM开始下降。从标记的M期细胞出现到PLM开始下降，标志着所有的原S 期细胞已全部通过M期，所以，这个时间间隔应是 Ts 期。此后， PLM逐渐下降至零，直至原S 期细

18、胞再次进入M期， PLM再从零开始上升。从 PLM第 1 次由零上升到第2 次由零上升，便是一个细胞周期。这个间隔时间，即细胞周期时间。那么，T G1 TC - （ TG2+Ts +TM）(15.5 )实际上，被标记细胞的同步程度和取材时间间隔常常是不相同的，各个细胞周期中的各时相又存在统计涨落，所以测得的PLM曲线与 PLM理论曲线是不完全相同的。有时曲线的第2292 个波峰也不能达到100。因此，计算细胞各参数时， 多采用曲线上的 50截点，见图 15-2 。这样一来， T 期为从标记开始到标记的M 期细胞达 50的时间，实际上是T +1/2T 。由于G2G2MT 期较短，误差不大。T 期

19、为第 1 次峰上行 50处到下行50处之间的时间。 T 期则为第 1MSC波峰上行 50处到第2 峰上行 50之间的时间。第 1 波峰下行50到第2 个峰上行 50之间的时间为 T +T 。此种方法不能求出T 。若能精确地测出T ，便由 T +1/2TM计算出 T。G1G2MG2G2MPLM法不适用于增殖能力低的细胞与组织。（ 2）银粒计数减半法（ grain count halving method）具体方法是：在3H-TdR 脉冲标记后，于不同的时间间隔内多次取材制备自显影标本，分批计数标本上的银颗粒，平均银颗粒数降低到原计数的一半时所需要的时间，即是细胞周期时间。此法虽然也用于细胞动力学

20、研究，但要求细胞群体具有相当的同步化程度。所以，目前其应用不及PLM广泛。( 二)两次标记对待测的细胞可用同种核素或不同核素进行两次脉冲标记，每次标记时间为15 min ，两次标记时间间隔应小于TG2期（一般间隔l h ）。这种方法可采用不同浓度3H-TdR 进行两次标记，或用3H-TdR 和 14 C-TdR 进行两次脉冲标记。后者应用较广。两次脉冲标记仍采用放射自显影方法进行检查。原则上双标记与单标记的自显影技术相同。14C 发射 - 粒子能量较强，实验中常用双层乳胶。因3H 和 14C 所发射的 -粒子具有不同的能量，一个细胞同时掺参入的3H-TdR 和 14C-TdR 形成的感光颗粒所

21、分布的位置不同， 3H-TdR 感光颗粒主要集中在胞核上；14C-TdR 感光颗粒同时分散在胞核和胞浆中，甚至分布在细胞浆之外，依此，可区别不同的标记细胞。第 1 次引入 3H-TdR 后，细胞群体中处于 S 期的细胞被标记。 处于 S 期末阶段的标记细胞，在两次标记间隔时间内进入 G2 期，第 2 次引入 14C-TdR，再不被标记， 而此期后阶段的细胞仍可被标记。在两次标记间隔中进入S 期的细胞也可以被标记。因此，用镜检分析放射自显影标本时可发现 3 类细胞： 3H-TdR 标记的 G2 期细胞、 3H-TdR 和 14C-TdR 标记的 S 期细胞、 14C-TdR标记的 S期细胞。后两

22、者之和则为14C标记的全部 S 期细胞。实验发现 3H标记的细胞数（ N 3 H）与两次标记的时间间隔（ Ta）成正比。 14C 标记细胞数（ N14）则正比于 S 期， Ta 可用下列C公式求出：TSN 14CTa(15.6)N 3 H根据 14C 标记细胞的百分率，可求出：TCTS(15.7)LI如果采用不同浓度的3H-TdR 进行两次脉冲标记，必须保持两次标记时间相同。此外，尚可根据胞核上银颗粒的多少，判别标记时间。总之，两次标记法操作简单，只需一次取材，故常用于体外细胞动力学实验。（三）连续标记法连续标记法适用于体外培养条件下，测定细胞周期动力学参数。但是，原则上也适用于整体测定。本方

23、法可采用3H-TdR 为标记物，连续标记或反复地对组织或细胞进行标记。反复标记时， 两次标记时间间隔应小于待测细胞的S 期。全部标记时间应大于G2+M+G1的时间。 其230结果使细胞群体中处于细胞周期内的细胞均可被标记。因此，通过对标记分裂细胞指数、标记指数及标记细胞中的平均标记颗粒数的动力学分析，便可求得细胞周期中的全部动力学参数。如向人皮肤细胞培养体系中加入31H-TdR，当时处于 S 期的细胞便会被标记，以后G 期的细胞又不断地进入 S 期，标记指数或细胞标记率则不断地增高，当 LI 达到最高值并维持不变时， LI GF。这方法也可用来测定T 和 T +T +T 。连续标记也可以用液闪

24、计数器计数法测定sG1MG2某些细胞的动力学参数，如Cos。 但应指出连续标记法尚存在着某些缺点，3H-TdR 连T 、T、T续掺入会造成组织与细胞放射性损伤，有时可产生TdR 的再利用。同时本方法不适于某些增殖速度慢、生长周期长的干细胞的研究。除上述的放射性核素标记方法外还有DNA聚合酶测定法，利用G1 期细胞核内所含的DNA3聚合酶，将H-TTP 和 dCTP、 dATP、 dGTP与待测样品的单细胞悬液混匀一起孵育，而后制备自显影标本，检查标记细胞所占比例，即代表GF。二、非放射性标记法（一）有丝分裂阻断法正常情况下有丝分裂持续时间短，M 期细胞极少。常采用有丝分裂阻断剂，如秋水仙碱及其

25、衍生物、长春花碱、长春新碱等，将细胞阻断在M中期，从而使分裂指数测量更方便、更准确， 并可以计算单位时间内进入分裂期的细胞的百分率以及更新时间To 和细胞周期时间Tc。但该方法需借助光学显微镜观察，误差亦较大。（二）细胞光度测量法因处于不同时相的细胞内DNA含量不同，经Feulgen 染色后，可进行显微分光光度计测量。根据DNA含量在细胞周期中的变化，可计算出处于细胞周期不同时相G0/G1 、S、 G2/M 期细胞群体的比例，并以此推算细胞周期各时相的时间。流式细胞仪能自动地、精确地、高效地分析单个细胞或细胞核的DNA含量、蛋白质含量及细胞体积。从而能测得G1、S、M各期细胞的百分率，但不能区

26、别G1、 G0 期细胞与死细胞及非整倍体细胞。此外，该测量方法需用酶制备单细胞悬液，易破坏分裂相。因此，使用时应慎重。第三节细胞动力学研究方法在医学中的应用一、细胞动力学在肿瘤治疗与监测中的应用（一）同步治疗肿瘤细胞与正常细胞的细胞周期差别不大，如采用放疗或化疗，对正常细胞，特别是更新较快的骨髓细胞和肠粘膜上皮细胞有一定的杀伤作用。因此，在给予放疗或化疗之前，必须调整细胞周期时间，如采用某些化疗药物如氨甲喋呤、5-FU 和羧基脲，它们具有使细胞群体停止在S 期初期的化学效应，即使细胞同步化。这一作用特点特别有用，因为这一时相是放疗敏感性最高的时期之一。如国外治疗急性粒细胞白血病时，使骨髓细胞进

27、入S期，当实现同步化后， 用阿糖胞苷杀死处于S 期的同步细胞。 国内在治疗急性非淋巴细胞性白血病时，231用长春新碱、阿糖胞苷和高三尖杉酯碱联合杀伤同步化细胞，疗效较好。此外，对 G0 期细胞占比例较大的实体肿瘤，先使G0 期细胞进入周期，待同步化后再用化疗和放射性外照射或放射性核素内照射杀伤之。如用环磷酸胺使晚期肺癌细胞同步化，再用氨甲喋呤杀伤同步化细胞；又如化疗和放射治疗的联合疗法，一方面可以提高疗效，另一方面又可以减少用药或照射剂量，大大减少毒副作用。目前，临床使用了多种联合治疗的方法，同时，在设计新药或复合药物时，也可遵循这一原则。（二）肿瘤监测在肿瘤的疗效预测和预后估计方面，可采用标

28、记指数（LI ）作为判断的指标。曾发现不少肿瘤（黑色素瘤、乳腺癌、鳞癌、腺癌）化疗或放疗后，LI 降低者疗效良好，LI 不变者疗效不明显， LI 升高者恶化。该指标也能用于血液系统肿瘤预后的判断，如多发性骨髓瘤患者治疗前 LI 低于 1者存活率高，而高于3者预后差。放疗或化疗后，细胞周期发生变化，LI 或 SPF增加，或 G2、 M期细胞增加，都说明肿瘤细胞对放、化疗敏感。如果没有出现上述变化，则要考虑改变治疗药物或方法与剂量。应该指出在肿瘤细胞动力学研究过程中，需注意研究方法、取材部位、肿瘤类型及同一肿瘤内细胞增殖状态的一致性等，方能保证研究结果的正确性和可比性。二、细胞动力学在上皮增生性病变中的应用正常情况下粘膜上皮与皮肤表皮，所以能够保持组织结构的稳定，是因其基底层中存在着干细胞系统，使新生的细胞与丢失的细胞处于平衡的状态之中。放射自显影术证明，正常人胃粘膜上皮细胞LI 为 8.8 14， Ts 期为 7 11 h,T c 为 14 48 h 。但这些动力学参数又受神经内分泌、精神及饮食等因素的影响。现已借助细胞动力学研究，阐明了胃粘膜上皮细胞化生的病理变化，如标记细胞分布不规则，则提示有恶变的倾向。国内研究发现某些口腔膜增生性病，可能在出现上皮非典型增生之前，就有细胞动力学的改变。三、在血液学研究中的应用近年来，干细胞的研究和细胞克隆技