293T细胞转染201709271600291

1、细胞转染实验1.实验目的学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法一脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。2.实验原理RlbMOHtl上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度

2、较大；病毒法的前期准备较复杂、广州息行虎生化医药有限公司广州息行虎生化医药公司成立于2017年8月21日,公司成立的缘由是发起人察觉到社会经济的发展浪潮和人民生活的更新期待需要有一个敢于挑战风险、善于克服困难、勇于探索前进、勤于变革创新、肯于传播正义的社会团体站出来承担责任,公司的宗旨是改变每个人的生活记忆，让人类生活更加生态环保和更加智能安康.公司的营业范畴涵盖：生命科学研究生态智能化实晚室创建、化工制造生态智能化车间创建、医疗检测和治疗生态智能化临床创建、药品内外用生态智能化健康创建。公司联系手机来电一般情况能接听，特殊情况下未接的当天回电，不需回电的请发短信注明

3、。现阶段公司自主研发的部分产品目录:产品编号产品名称产品规格产品价格Xxh1RealTimePCR2x预混液1ml50-70元5ml200-230元Xxh2总RNA提取液20ml70-90元50ml150-180元100ml270-300元Xxh3总DNA提取液100ml100-200元Xxh4总protein提取液强50ml60-70元100ml中50ml50-60元100ml90410元弱50ml40-50元100ml|70-90元Xxh5TaqDNApolymerasePCR试剂盒TaqM200U20-25元Taq酶1000U80-90元Taq®5000U350-380元Xxh

4、6CDNA第一链合成试剂盒20次250-280元50次550-600元100次1000-1100元Xxh7总糖提取和检测试剂盒500ml100-200元Xxh8黄酮类化合物的提取、分离纯化和含量测定试剂盒500ml100-200元Xxh9紫外流胶照胶仪30cm*30cm*30cm,260nm700-1000元Xxh10慢病毒包装服务电议Xxh11腺病毒包装服务Xxh12细胞培养服务Xxh13植物组织培养服务Xxh14CRISPR-Cas9敲靶点服务Xxh15细菌突变体构建服务Xxh16感受态DH5Q1支12-15元10支100-130元50支400.450元BL21(

5、DE3)：1支12-15元10支100-130元50支400-450元Stbl33支3040元10支250-300元50支1100-1200元ToplO工支13-15元10支110430元50支480-530元EHA105二支20-23元10支180-220元50支850-950元Xxh17便隐血检测家用试纸10片20元50片90元100片170元Xxh18质粒构建服务电议Xxh19观赏荧光植物40cm*40cm*50cm500元而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体

6、与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。CHg。o上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。3 .实验材料与器材1）材料293T名田胞MyoD表达质粒和EGFP表达质粒DMEM培养基链霉素/青霉素（双抗）FCS（小牛血清）PBS（磷酸盐缓冲溶液）胰酶/EDTA消化液转染试剂(TransFast)2)器材20ul/200u

7、l/1ml微量移液器和Tip头酒精灯废液缸血球计数板涡旋振荡器恒温水浴箱台式离心机35mm培养皿转染管15ml离心管观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD4 .实验步骤细胞传代(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37°C,5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。(6)将

8、培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。细胞转染1)转染试剂的准备A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。B.震荡后将试剂放在20摄氏度保存，使用前还需震荡，。2)选择合适的¥M合比例(1:11:2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。5)将混合液在室温放置10-15分钟。6)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。7)加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养2448小时。第二次细胞传代1)在转