生物制药试验讲义

1、目录实验一芦丁的提取精制与鉴定实验二精制芦丁的含量测定实验三发酵法生产丝氨酸实验四青霉素抑菌圈的观察时间安排：星期一下午：配置丝氨酸产生菌培养基及接种、金黄色葡萄球菌所需培养基及倒板星期二上午：青霉素涂布（如周一下午时间充裕可改到周一下午）星期三上午：丝氨酸产生菌离心，兼做抑菌圈观察星期三下午：建立丝氨酸产生菌静息培养系统星期四整天：芦丁提取星期五上午：绘制芦丁标准曲线，及自己提取芦丁含量测定星期五下午：丝氨酸显色反应实验一芦丁的提取精制与鉴定产丁（Rutin）亦称芸香甘（Rutinoside）,在植物界广泛存在，其中以槐米、养麦叶、蒲公英和烟叶中含量较多，可作为提取产丁的原料。槐花米系豆科植

2、物Sophorajaponica的未开放花蕾，具有调节毛细血管渗透性之作用，临床用作毛细血管止血药，如复方产丁，也作为高血压的辅助治疗药物。除此之外，还可作为制药原料，用于制造能皮素（Quercetin）、竣乙基能皮素、竣乙基产丁、二竣丙基产丁、代乙基吗啡产丁、6-而乙基氨基产丁等。槐花米中产丁的含量高达12%16%另含少量皂甘。产丁水解后得到奥皮素，皂甘水解后可得到白桦酯醇（Betulin）及槐花二醇（Sophoradiol）。产丁为淡黄色细小针状结晶，含三个结晶水，熔点177178C。；产丁溶于热水（1:200）,难容于冷水（1:8000）;溶于热甲醇（1:7）,冷甲醇（1:100）;热乙

3、醇（1:30）,冷乙醇（1:300）,难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、三氯甲烷、乙醴及石油醴等溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。其结构如下图：H0OH一、实验目的1、通过产丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。2、通过产丁的结构检识，了解甘类结构研究的一般程序和方法二、实验原理产丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水。溶解度：冷水1:10000;热水1:200;冷乙醇1:650;热乙醇1:60;冷叱噬1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醛、氯仿、石油酸，溶于碱而呈黄色产丁为黄酮甘，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质

4、进行提取分离。利用产丁易溶于热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。三、实验器材研钵，500mL烧杯，广泛试纸，四层纱布，滤纸，漏斗，10mL试管，5mL移液管，波棒，洗耳球，温控烘箱石灰乳，浓盐酸，镁粉，10%e蔡酚乙醇溶液，浓硫酸，乙醇，2%二氯氧结甲醇溶液，2%柠檬酸甲醇溶液四、实验流程槐米粗粉（10g）置250ml烧杯中，加入一定饱和石灰水，加热，并维持pH89煮?20分钟,趁热滤过滤液药渣用一定量饱和石灰水煮沸10分钟，维持pH89趁热滤过滤液药渣（x）.并|在60c70c下用浓HCl调pH至45静置，抽滤沉淀低温（60C）干燥，称重。按1：200的比例加水，

5、加热使溶解，趁热滤过V滤液静置，抽滤，减压干燥，计算收率1r芦丁精制品五、实验内容1、产丁的提取精制称取槐花米10g,置于干燥的研钵中用研钵挤压成粗粉。称取0.5-1g的石灰粉。置于干净的小研钵中，加入5mL水后研成乳液备用。将槐花米粗粉置于250mL烧杯，加蒸储水100-150mL,煮沸，在搅拌下加入石灰乳至pH8-9,在此条件下微沸20-30min,过滤。在60-70C下，用浓盐酸调滤液至pH4-5,搅匀，静置1-2h,过滤。沉淀用蒸储水洗2-3次至中性，抽干,60c干燥得产丁粗品。称定产丁粗品重量，按1:200的比例悬浮与蒸储水中，煮沸10-15min,趁热过滤，冷却滤液，充分静置结晶。

6、抽滤，60-70C干燥得精制产丁。称重，计算得率。2、产丁的鉴定取产丁适量，加乙醇使溶解，分成三份供下述试验用：(1)盐酸镁粉试验：取样品液适量，加2滴浓HCl、再酌加少许镁粉，即产生剧烈的反应，并逐渐出现红色至深红色。(2)结-枸试验：取样品液适量，然后加2%ZrOCl2的甲醇溶液，注意观察颜色变化，再加入2%枸椽酸的甲醇溶液，并详细记录颜色变化。(3)a-茶酚-浓硫酸反应：取样品液适量，加等体积的l0%e蔡酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁缓加浓硫酸，注意观察两液界面的颜色。六、注意事项1 .用石灰水调节产丁提取溶液的pH,既可以达到碱提取产丁的目的，还可以除去槐米中含有的大量粘液质。但钙离子浓度及

7、pH值均不宜过高，否则多余的钙能与产丁形成螯合物沉淀，同时黄酮母核在强碱性条件下易被破坏。2 .用HCl调pH时，应注意pH不要过低，因为pH过低(pH2以下)会使产丁形成车羊盐而使已形成的沉淀重新溶解，同时黄酮母核也会在强碱性条件下被破坏，导致收率下降。3 .注意观察柳皮素制备过程中的实验现象。七、实验报告记录实验主要步骤与实验现象，并计算产丁的收率。判断卢丁的鉴定结果。八、思考题除了本实验方法外，你能否根据卢丁的性质设计自槐花米中提取产丁的另一种方法，并说明实验原理。实验二精制芦丁的含量测定药物在通过鉴别无误、杂质检查合格的基础上进行含量测定。原料药含量测定方法着眼于方法的准确性与精密度，

8、制剂含量测定方法重视方法专属性，准确性可稍差。含量表示方法为有效成分的量占总量的百分数。准确测定产丁原料药含量，目的是为产丁制剂工艺提供可靠数据。一、实验目的1、熟悉可见分光光度计的构造和使用操作2、掌握标准曲线法测定原料药含量的方法二、实验原理多数黄酮类化合物有较明显的紫外吸收，在甲醇溶液中由两个主要吸收带组成。带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统引起，主要反应B环取代情况。带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统引起，主要反应A环取代情况。产丁在甲醇中的紫外吸收光谱图如下图，可以选择360nm或276nm作为可见光分光光度计法测定产丁含量的测定波长。象甲商技曲第（It-桂

9、皮就墓峰樽U.之20-2旦。皿】黄制斡（峰带300-400ntlO三、仪器与材料可见光分光光度计，电子天平，精制产丁，产丁对照品，盐酸，比色皿,容量瓶，移液管，甲醇。四、实验内容1、标准曲线的绘制：精密称取产丁5.00mg,置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，精密吸取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇为空白对照，于360nm处测定吸光度，并绘出标准曲线。2、精制产丁的含量测定：精密称取产丁原料药5.00mg,置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，精密平行吸取3.0两份分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得供试液

10、。去供试液于360nm处测定吸光度。由标准曲线计算出供试液中产丁含量。3、计算公式：百分含量=测得量/供试量X100%五、注意事项1、石英比色皿的正确使用和吸收度校正。2、吸收度读数三次，取平均值计算含量。3、读书后及时关闭光闸以保护光电管。六、实验报告记录绘制标准曲线并计算精制产丁含量。七、思考题黄铜类药物的紫外光谱试验中为什么选择甲醇作为测定溶剂？实验三发醉法生产丝氨酸及鉴定丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用

11、。因此，它在化工、制药、化妆品及食品等工业及科学研究中有着广泛的用途。目前，L-丝氨酸的生产方法有四种，即提取法、化学合成法、发酵法和酶法。本实验采取发酵法生产丝氨酸，并用层析法进行鉴定。一、实验目的1、学习丝氨酸的制备方法2、掌握丝氨酸鉴定的方法二、实验原理一般直接发酵法生产丝氨酸的是细菌，由于丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，直接发酵法得到丝氨酸的产量较低。工业生产中一般采用前体发酵法等，本实验主要是验证性实验。纸上（薄板）层析法通过选用合适的层析剂，在一定的时间内，把不同种的氨基酸分离开来，然后根据Rf值以及不同氨基酸同呷咪酿显色后的颜色差别来对氨基酸进行定性测定。如果用甫三酮作显色剂，通

12、过剪纸比色法，也可对氨基酸进行定量测定。它的原理与分配柱层析相同，所不同的是以滤纸作为支持剂。纸上层析以滤纸上的结合水作为固定相，以与水不相混溶的溶剂作为流动相。展开时，溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相中不断进行分配，即发生一系列连续不断的抽提作用。由于各物质在两相中的分配系数不同，因此它们的移动速度也就不相同，从而达到分离的目的。三、仪器与材料L-丝氨酸，正丁醇，丙酮，二乙胺，甫三酮，无水乙醇，微量进样器，离心机，721分光光度计，电子天平，层析薄板，层析缸层析溶剂正丁醇：冰醋酸：水：（V/V）=12:3:5西三酮配制方法：1.5g西三酮+100mL正丁醇+3.0mL醋酸四、实验内容1、

13、发酵过程:发酵培养基：MMI培养基（1000mL,作为甲基营养型细菌的基本培养基）成分I（NH4）2HPO43gK2HPO42gNaCl1g微量元素micofinicacid（烟酸）20仙gVB110griboflavin（VB2核黄素）20仙gCalciumpantothenate化酸钙）20仙gPyridoxineHCl（盐酸叱哆醇）20仙gBiothin（生物素）10gP-aminobenzoicacid的氨基苯甲酸）10ng成分HMgSO4-7H2O0.2gFeSQ7H2O10/MnSO44-6H2O5mgpH7.0将成分i中微量元素及成分n各成分先配成合适浓度的母液，成分I和R单独称

14、取或量取，分别加入到400ml水中，完全溶解后，I和II混合，加水到950ml后，调节pH=7.0,力口水至1000ml,固体培养基加入1.1%的琼脂粉，于15MPa压力下湿热灭菌20分钟。使用前加入1.2%的甲醇作为碳源（灭菌冷却后在超菌台内加入甲醇）。2、静息细胞反应体系（1）先接种一甲基营养型细菌单菌落到10mL甲基营养型细菌培养基中并于32c摇床培养2-3天，然后转接1mL培养物到100mL新鲜的培养基中，继续摇床培养到OD600约0.8-1.0,8000rpm4c离心10分钟以收集细胞，倒去培养液并尽可能吸去所有培养液，用生理盐水洗细胞3次，4c离心10分钟收集细胞，按以下次序，将各

15、成分在universal瓶内混合。50mM50mg50mgTris-HCl甘氨酸甲醇菌体30mg终体积1ml(2) universal瓶置于32c摇床培养48hr。(3) 13000rpm离心10分钟，取上清液于-20C保存。3、丝氨酸鉴定(1)点样：将滤纸裁成适当大小，宽度大约为1525cm,长度根据样品的个数来决定。用铅笔在距底边23cm的地方划一道直线(称为原线)，线上每隔11.5cm标上一个点，然后用微量进量器取L-丝氨酸发酵液(离心后)上清液1.0-3.0NL,轻轻点在纸上的所点位置。所测样品点完后，取标准L-丝氨酸样品，以合适的浓度点样，作标准样对照。点样时应保持滤纸洁净。(2)展

16、开：展开操作时，将溶剂加入到放平的层析缸内。将滤纸放入缸内，但勿使它接触层析剂溶剂，然后密闭容器进行平衡。平衡的时间是1h。平衡结束后，将滤纸一端缓缓放入层析剂溶剂中，这时注意要使纸的底部平稳地一齐浸入液体。此时开始展开。当溶剂前沿到达离滤纸另一端11.5cm时，取出滤纸。立即放入电热鼓风箱中烘干。(3)显色：滤纸展开后，从电热鼓风箱中拿出已烘干的滤纸，均匀地喷上西三酮显色剂后，于100c加热5min,取出。然后对照标准L-丝氨酸层析的Rf值定性判断发酵液是否含有L-丝氨酸。五、注意事项1、培养基配置：成分一和成分二分别配置后再混合，防止发生沉淀。2、点样：点样均匀，不可过大。3、显色：显色剂

17、喷雾均匀。六、实验报告观察样品与丝氨酸标品，判断有无丝氨酸产生。七、思考题查阅丝氨酸其他的生产合成方法。实验四青霉素抑菌圈的观察青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是，内酰胺类中一大类抗生素的总称。青霉素（Benzylpenicillin/Penicillin）又被称为青霉素G、peillinG、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苇青霉素钠、青霉素钾、苇青霉素钾。青霉素G有钾盐、钠盐之分，钾盐不仅不能直接静注，静脉滴注时，也要仔细计算钾离子量，以免注入人体形成

18、高血钾而抑制心脏功能，造成死亡。青霉素适用于A组及B组溶血性链球菌、肺炎链球菌、对青霉素敏感金葡菌等革兰阳性球菌所致的各种感染，如败血症、肺炎、脑膜炎、扁桃体炎、中耳炎、猩红热、丹毒、产褥热等。也用于治疗草绿色链球菌和肠球菌心内膜炎（与氨基糖甘类联合”梭状芽胞杆菌所致的破伤风、气性坏疽、炭疽、白喉、流行性脑脊髓膜炎、李斯特菌病、鼠咬热、梅毒、淋病、雅司、回归热、钩端螺旋体病、奋森咽峡炎、放线菌病等。在风湿性心脏病或先天性心脏病病人进行口腔手术或牙科操作，胃肠道和生殖泌尿道手术或某些操作时，青霉素也可用于心内膜炎的预防。一、实验目的1、了解青霉素的作用机制2、掌握平板鉴别青霉素的方法二、实验原理青霉素类抗生素是任内酰胺类中一大类抗生素的总称，由于伊内酰胺类作用于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的过敏反应外，在一般用量下，其毒性不甚明显，但它不能耐受耐药菌株（如耐药金葡）所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。三、试剂和仪器青霉素钾盐、金黄色葡萄球菌种子培养