一种基于光学模拟的荧光定量PCR仪校准方法-陈如冰

1、一种基于光学模拟的荧光定量PCR 分析仪校准方法陈如冰 胡涵星 袁伟伟215128)摘 要 ：本文介绍了荧光定量PCR 分析仪的工作原理和结构特点，提出了该仪器的校准项目，以及一种基于光学模拟的校准方法。通过采用可变光强的 PCR 温度校准仪和PCR 荧光校准仪，合理布置温度传感器和LED 光源位置，对荧光定量PCR 分析仪的温度控制性能和定量准确度进行了校准，并对可能影响校准结果的不确定度分量做了说明。关键词 ：聚合酶链式反应( PCR ) ；荧光；定量；温度；校准中图分类号： Q819 文献标识码： A 文章编号 ：New Method of the Calibration for Rea

2、l-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction Analyzer by Optical SimulationChen Rubing Xu Hangqing Yuan Weiwei(Suzhou Institute of Measurement and Testing Technology, Suzhou 215128, China)Abstract: To study the calibration for Real-time Fluorescent Quantitative PCR, which widely used in

3、 the fields of scientific research, clinical diagnosis. The study describes the calibration items and method by optical simulating PCR process base on the specification of Real-time Fluorescent Quantitative PCR. The method of calibration is put forward to calibrate the thermo performance and quantit

4、ative accuracy of PCR analyzer by a test system designed to measure the temperature of reaction block and generate changeable light with temperature sensors and LED elements, and the uncertainty components are introduced.Key words: Polymerase chain reaction (PCR); Fluorescence; Quantitative; Tempera

5、ture; Calibration荧光定量PCR分析仪主要通过仪器内部热循环系统的升降温变化，使得DNA或RNA片段得以复制扩增，仪器光学系统采集伴随DNA或RNA扩增产生的荧光信号，并对荧光信号进行分析转化、数学运算后，得到扩增曲线。其生物片段扩增的理论方程以公式（1）表示5:N = M （1 + E）n（1）式中，N是扩增后数量，N0是起始模板数量，E是扩增效率，n是循环次数。根据公式（1）可以看出，生物片段扩增是呈指数增长方式，所以在反应条件相同的情况下，样本含量是与扩增产物的对数成正比的，因此在一定的条件下荧光强度和样本含量是成正比的。实时荧光定量PCR分析仪就是利用这个原理对荧光信号

6、的增加程度检测来监测整个PCR的扩增过程，以获得实时在线描述PCR过程动力学曲线。公式（1）经过对数变换可以变成以下公式：n = _ log N ）十 10g （N ）一 log 1 E log 1 E在PCR过程中，样品扩增是通过不断重复高温变性、适温延伸、低温退火的温度循环来进行，整 个过程一般经过线性增长期、指数增长期和平台期三个时期，在指数增长期内设定一个样本扩增产物量的标准（即荧光强度阈值），通过计算可以得到扩增产物达到阈值时的扩增循环次数CqO相应的,公式（2）可以转换成以下公式:(3)Cq - -k log Nob公式（3）是一个线性函数，式中 k、b是与扩增效率有关的常数。因此

7、，PCR分析仪通过取得样品的Cq值，与标准样品曲线相比较就可以得到样品的起始模板数量（或浓度），一个典型的理想化 PCR扩增过程曲线如图1所示。120荧光强度%平台期指数增“线性增氏期8152 025324043循环数图1典型的PCR反应曲线图由于一般生物样品在 PCR反应中对实际温度十分敏感，超过一定温度即发生扩增失效，而Cq直接关系定量准确度，因此，对于荧光定量PCR分析仪来说，温度和 Cq值是主要的校准参数。2.2仪器结构通常实际应用中的荧光定量PCR分析仪是由光源、 光探测器、滤光片、光开关阵列、温度控制器、热盖、电控装置和上位机及软件等机构组成。仪器的主要结构如图2所示。TE-P温度

8、控制器准直器灌光片电控装置上位机及软件图2荧光定量PCR分析仪的主要结构根据图2可以看出，荧光定量 PCR分析仪主要部件是 PCR反应中的温度控制器和荧光激发和探 测系统。一般通过半导体制冷片来快速加温或制冷，热盖形成上部的恒温区域从而保持反应孔内温度 的稳定，采用冷光源和 CCD或光纤、光电探测器来保证荧光强度测量质量。样品放置的反应孔现有 24孔、48孔、96孔和384孔等多种形式，在 PCR反应过程中，样品一般处于密闭空间。如何准确、代表性的测量其性能，这也给荧光定量PCR分析仪的校准带来了挑战。3 校准项目和方法3.1 校准项目根据荧光定量PCR分析仪的工作原理和结构特点，可以梳理出以

9、下主要校准项目：（1）温度控制性能这主要是通过对温度设定偏差、温度均匀度、温度波动度和温度过冲量四个项目进行校准来表征荧光定量PCR分析仪的温度控制性能。其中，温度设定偏差是温度控制中最重要的项目，实际温度过 高或过低都会影响扩增结果，造成假阳性或假阴性。现今市场上厂商的一般技术指标在土（0.31.0） C之内。温度均匀度表征了各个反应孔之间的温度一致程度，一般技术指标在（0.31.8）C之间。温度波动度表征了一定时间内温度的稳定程度，一般技术指标在 （0.150.5） C/min之间。温度过冲量表征了温度控制能力，一般技术指标在（38）C之间。（2）定量准确度这主要通过定量示值误差来表征荧光

10、定量PCR分析仪的浓度定量准确度，可以通过Cq示值误差或浓度示值误差来体现。现今市场上厂商的浓度示值误差或Cq示值误差一般在土 10%之内。3.2 校准方法目前校准荧光定量 PCR分析仪的方法一般有 2种，一种是采用已知浓度质粒DNA标准物质或核糖核酸标准物质和温度传感器进行扩增的生物扩增法5,另一种是采用温度传感器和LED光源的物理模拟法，还未见文献进行过相关研究。 前者与实际荧光定量 PCR分析仪使用状态一致， 得到的校准 结果可信度较高，但缺点是标准物质的品种较少，制备标准溶液程序复杂。 后者采用LED光源来模拟扩增时荧光强度的变化，可以根据不同仪器或不同被测物来设置程序，得到与实际用户

11、样品“同类” 的校准结果，应用面较广。受限于篇幅，本文主要讨论采用物理模拟法的校准方法。(1) 温度控制性能校准温度控制性能校准通常采用专门的PCR温度校准仪，测量范围(0110) C,测温最大允差土(0.100.3) C,分辨力 0.01 C, 一般以热敏电阻或钳热电阻作为温度传感器，热响应时间快。传感器部分集成在一轻薄的电路板上，通过无线或细线方式传输采集数据，校准时不影响荧光定量 PCR分析仪的正常工作状态。 其温度传感器布置在荧光定量 PCR分析仪的反应孔内或反应管内，根据反应孔的数量多少布置相应数量的温度传感器。步骤1:布置温度传感器。由于荧光定量PCR分析仪的反应孔通常对称均匀分布

12、，温度控制性能校准时，温度传感器位置分布一般也采用对称式布置，在其边缘和中央区域均应布置传感器，温度 传感器数量应占反应孔数量的8%以上，典型的96反应孔的荧光定量 PCR分析仪的温度传感器布置如图3所示。1 23456789 1011 12OOOOOOOO 。OOOOO OOOOOOOO OOOOOOOO O。OO OOOOOOOO OOOOOOOO o o O。O OOOOOOOO OOOOOOOO o。o。 abcdefgh图396孔PCR分析仪温度传感器分布示意图步骤2:设置并运行校准程序。 按照荧光定量PCR分析仪说明书或用户要求设置温度控制程序， 并运行该程序，一个典型的温度校准程

13、序如图4所示。同时启动PCR温度校准仪进行温度数据采集。71003-minO4E121519时间/mln2D1abcdefgh图4 一种典型的温度校准程序步骤3:数据处理分析。将采集到的各温度传感器的温度数据，按照各温度项目的计算公式进行数据处理分析。其中温度设定偏差的计算公式如下：Td =Ts -TC(4)式中： 5 为PCR分析仪工作区域内温度设定偏差，单位为C。Ts为PCR分析仪工作区域内设定温度值，单位为C。T为pcr分析仪温度稳定时所有温度传感器测定值的平均值，单位为C。c(2) 定量准确度校准定量准确度校准通常采用专门的 PCR荧光校准仪，由一定数量的温度传感器和 LED触发光源组

14、 成，传感器部分集成在一轻薄的电路板上， 校准时不影响荧光定量 PCR分析仪的正常工作状态。 温度 计量特性与上面 PCR温度校准仪基本一致，LED触发光源光谱响应范围是(380780) nm,光辐射强 度是(102104) W/sr,具有较好的温漂特性和线性度。步骤1 :布置温度传感器和 LED触发光源。温度传感器和 LED触发光源位置分布一般也采用对 称式布置，在其边缘和中央区域均应布置传感器，温度传感器数量应占反应孔数量的3%以上，LED触发光源数量应至少 6个以上。典型的96孔的荧光定量PCR分析仪的LED光源布置如图5所示。 O。O O O O。 OOOOOOOOOOOO OOOOO

15、OOOOOOO ooooooooooo OOOOOOOOOOOO OOOOOOOOOOOO OOOOOOOOOOOO ©ooooo©oooo图5 96孔PCR分析仪LED光源分布示意图步骤2:设置并运行校准程序。按照荧光定量PCR分析仪用户要求或说明书设置扩增程序，并运行该程序。同时启动 PCR荧光校准仪进行温度、光学数据采集。步骤3:数据处理分析。将采集到的各传感器的温度数据和光学数据，按照定量Cq示值误差的计算公式进行数据处理分析，其公式如下：2 =cqd -除q qqw式中：ACq为PCR分析仪的Cq示值误差；Cd为PCR分析仪测得的Cq平均值；CI为PCR荧光 qq

16、c校准仪测得的Cq平均值。3.3校准结果的不确定度通过上述校准方法及计算公式，可以列出温度设定误差和定量示值误差的数学模型，找出影响测量的不确定度分量，主要有PCR温度校准仪温度测量准确度引入的不确定度分量，温度传感器响应时间引入的不确定度分量，温度测量重复性引入的不确定度分量，热损失引入的不确定度分量，PCR荧光校准仪温度测量准确度引入的不确定度分量，光辐射强度测量准确度引入的不确定度分量，LED光源光谱响应特性引入的不确定度分量，LED光源温漂特性引入的不确定度分量，以及浓度测量重复性引入的不确定度分量。经过不确定度评定可以得到温度校准结果和定量校准结果的扩展不确定度。 4 结束语通过对荧

17、光定量 PCR分析仪的工作原理和仪器结构进行分析，本文提出了荧光定量 PCR分析仪的校准项目和校准方法。校准项目主要有温度设定误差、温度均匀度、温度波动度和温度过冲量等四个 温度控制性能校准项目和定量示值误差一个定量准确度校准项目。校准方法着重对新出现的物理模拟法进行了探讨，该方法采用PCR温度校准仪和PCR荧光校准仪进行校准， 通过温度传感器和 LED触 发光源的合理布置，可方便、可靠的实现对荧光定量 PCR分析仪的温度控制性能和定量准确度的准确 校准，经过对校准结果的不确定度分析，介绍了可能影响校准结果的不确定度分量，可为荧光定量PCR分析仪的校准提供参考。参考文献：1 高运华、李海峰、李

18、建新等. 荧光标记 DNA 高分辨电感耦合等离子体质谱定量分析J. 高等学校化学学报 . 2010, vol31, No.12:236023652 吴坚、曹文祺. 聚合酶链式反应PCR 荧光检测研究J. 计量学报， 2002, vol23, No.2:1511563 朱晨彬、朱毅晨等. 浅谈 PCR 仪温度校准的必要性及方法J. 工业计量， 2013, vol23, No.1: 1114 郭沈辉、武佳、王林虎等. PCR 仪温度校准的讨论J. 计量学报， 2012, vol33, No.6: 1011045王伟平.96孔实时荧光定量PCR检测系统的开发S.硕士学位论文，2011: 23作 者： 陈如冰 胡涵星 袁伟伟单 位：苏州市计量测试研究所邮 编：215128详细地址：江苏省苏州市吴中区文曲路69 号电 话子邮件： chenrb1 引言PCR 分析仪又称聚合酶链反应分析仪， 是一种基于聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction ) ， 模拟 DNA 或 RNA 复制过程，在模版、引物、聚合酶等存在条件下，对特定DNA 或 RNA 片段进行快速扩增和检测分析的仪器设