(整理)基因克隆的质粒载体

1、基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。F质粒又叫F因子或性质粒(sex plasmid )。它们能够使寄主染色体上 的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且 通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的 抗菌素抗性能力。Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成 的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有 Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死 的蛋白质。第一节质粒的一般生物学特性、质

2、粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝 大多数的质粒都是由环形双 DNA组成的复制子(图4-1 )大腾杆箫质粒分子的结构示意图质粒抡细常枭色体外像卷向我堡制的洋形双偿的口A分手指利抗菌京抗性基因的 质敕叫R质粒.大郃分面粒是球以精移的.但也存在著不能够转称的质粒质粒DN的子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又 可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到 后代。环形双链的质粒DN的子具有三种不同的构型：1 .当其两条多核甘酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形 DNA(cccDNA ,这样的DNA!常呈现

3、超螺旋的SC构型；2 .如果两条多核甘酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现 有一至数个缺口时，称之为开环 DNA(ocDNA ,此即OC勾型；3 .若质粒DNAS过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线 性分子(IDNAA ,通称L构型(见图4-2) 0质粒DNA的分子构型U)松胞螳性的L悯松地开环的口Cftl中, (c)超螺旋的SC构型(a)(b)惭粒DM人辕脂幡凝校电泳模式图 由于瑞曲惭中配白盘人型塾以沌化已装.因此. 在浜外或照射下|收汽电泳的用管橘黄色， 道中的SC DNA走在牲旌的Jft苒沿 OC DMA唱位于胜联的题/中 的LDYA是空隈阳内切出都酷切割贯轨

4、上、产生的，它在雅肮中的位置介于(* DNA ftl SC DNA In在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒 DNA尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是 SC DNA其后依次是L DNAF口 OCDN/A(ffl4-3)DN砌子，都必定包括如下凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒三种共同的组成部分，即复制基因(replicator )、选择性记和克隆位点。二、质粒DN胸码的表型质粒DNAR占细胞染色体组的1分3流右，但却编码着一些重要的非染色 体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。三、质粒DNA勺转移(1)质粒的类型 革兰阴性细菌的质

5、粒可以分成接合型和非接合型的两种类 群。接合型的质粒(conjugative plasmid ),又叫自我转移的质粒。它们除了 具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移 的基因。非接合型的质粒(non-conjugative plasmid ),亦叫不能自我转移的质粒。 它们虽然具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配骊和接合转移的基因， 因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。(2) F质粒 又叫F因子，即致育因子(fertility factor )的简称，是在 某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒。F质粒有三种不同的存在方式：(i

6、) F+细胞：以染色体外环形双链质粒 DNAt式存在，其上不带有任何来 自寄主染色体的基因或DNAK段。(ii ) F细胞：以染色体外环形双链质粒 DNAt式存在，同时在其上还携 带着细菌的染色体基因或 DN区段。(iii ) Hfr细胞(高频重组细胞)：以线性DN能式从不同位点整合到寄 主染色体。F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的 F-细胞则 叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须(pilus )的结构，它促进 雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培 养，由于性须的作用，就会形成雌-雄细胞配对。我们称这种过种为细菌的接合作用(

7、conjugation )。配对之后F-受体细胞获得了 F因子，也变成为F+细胞由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞，就可能相发寄主染色体发生高频转 移。这是一种可逆的过程，在一定的条件下， Hfr细胞又可重新变参展F+或F 细胞。质粒的主要类型见 表4-1。几种主要的质粒类型技接合转移功脂分类主要展因按抗性记号分类非接合型成粒日上复制基因.产生大肠杆曲索基因Col质粒自主邱制基因.抗赭素抗性基因R J贵粒(R因子；接合型质粒自丰;发制基因,转程基因，洞菌案色体区段F质镂F国子)自主艮制军因转移基因.大腑杆菌索基因Col面粒a在察制基因.转移茶因.抗阑素抗性基因R质粒tR因:H自主整制基因,转

8、移基因、大瞬杆菌素基因Emt质粒)(3)质粒DNA勺接合转移细胞交配对的形成雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会 迅速收缩，把给体细胞与受体细胞拉在一起。 因此，性须在确立配对细胞表面问 的紧密接触方面，起着至关重要的作用。但是，大肠杆菌雄性细胞是不会同其它 的亦带有F质粒的细胞发生配对作用的，因为traS和traT编码的“表面排斥” 蛋白质，使此种细胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只能同不具 F因子的雌性细胞配对的特异性。质粒DNA的转移F质粒DNA勺转移是从转移起点oriT开始的。当细胞交配对建立之后，TraY和TraI蛋白质首先在oriT位点作单链切割，随后缺口 链

9、在其游离的5-端的引导下转移到受体细胞，并作为模板合成互补链，形成 新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为具有F因子的雄性细胞如 图4-4。质粒DNA的越合转移及复制给悻郎胞中的单舞质粒DNA经过孔道进入受悻细胞，井在结体和受体，跑中分别进行口NA的合成. 结果实现T质粒DNA的转博，井增加了质粒的樗贝数(为他明起见.图中便示出部分细胞壁结构)四、质粒DNA勺迁移作用非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自多转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过 程，叫做质粒的迁移作用(

10、mobilization )。ColEI是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。需要质粒自己编码的两种 基因参与。一个是位于 ColEI DNAh的特异位点bom；另一个是ColEI质粒特有 的弥散的基因产物，即 mob基因(mobilization gene )编码的核酸酶。mob基 因和bom基因参与ColEI质粒的迁移作用这个结论，是根据图4-5的实验结果作 出的。(b)(c)(d)mob产物bom不能转移，因为 bom无缺口F因子带动ColEl质粒转移的条件DNA中的乩m位点，当其具有功能活性时以黑方块表示当其发生跳失突变而不具功能活性时, 以长方盒。表示.只有当ColEl质粒合成出活性

11、的wb产物井作用于具功能的bow位点、 而F因子又提供了转移装置的条件下,才能够发生ColEl质粒的转移相容性的两种质粒F和ColEl共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColEl 质粒提供经所缺乏的结合功能，这样使得 ColEl质粒也能够发生转移作用。图 4-5 (a)表示位于F-细胞中的ColEl质粒的状，它的mob因进行了转录，其 产物使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是 ColEl DNA便从超盘旋的的结 构转变成为缺口环状的构型。但ColEl质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DN她就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构

12、型转变过程，就有可能被回复，所以就出现这两种构型之间的平衡状态。图 4-5 (b)中的细胞同时含有F和ColEl两种 质粒。F因子能够导致性须的合成，为其 DNA专移提供了转移装置，因此ColEl 可以被转移。而在F质粒提供的这种转移装置被分离掉的情况下，ColEl的mob-突变体便不能够转移。遗传分析证明，mob-突变是隐性的，mobS因编码一种蛋白质。而且当这种突变体质粒被分离出来时，并不是以松弛复合物的形式存在。图4-5 (c)所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行车$移，其中F性须和转移装 置虽已形成，但ColEI DNA并没有发生缺口。图4-5 (d)表示另一种具 mob+ft 型并

13、带有一个顺式显性突变的 ColEI突变体，它缺失了 bom位点。在这样的寄主 细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不能发生缺口，因此仍然不能够转移。五、质粒DNA勺复制类型根据寄主细胞所含的拷贝数的多少， 可将质粒分成两种不同的复制型：一种 是低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅含有13份的拷贝，我们称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid );另一类是高拷贝数的质粒， 每个寄主细胞中可高达1060份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的 质粒(relaxed plasmid )。质粒拷贝数，是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质 粒DN吩子的

14、数目。表4-3列举了若干种通用的质粒复制基因的特性。表4-2 列举了若干种通用质粒复制基因的特性。若干种通用的质粒复制基因的特性.复制基因原型烟粒原理质粒大小fhp)原微质粒的选择表型pMBlPBUS224 363Am.pr /Terrft25ColEIpMKlS7 500KjinTctr高pl5APACYC384-4 QOQinTctr高75pSClOlpLG S3B1 300Kan.2此一6FpDFU7 2Trp+低5-2R6KPRK3537】100Trp +低V15RKRldnl 17)pBKU5010 oooAmpTetrMT.低拷贝|35匚以上，跖拷贝， JRK2pRK2 5017】

15、100KanrlTctr低-4加IvAdvEal(2)&】+一注r (1)温度敏惠性X。未知；凡mp凝节青毒常抗性=黑霉隶抗性10店产皿=大版杆菌嶷E史段 性小之环=卡那毒素抗性门，仃=四环素抗性心川+=合成华扎糖；丁峰+ -含成色氨酸.六、质粒的不亲和性(1)质粒的不亲和性现象所谓质粒的不亲和性(plasmid incompatibility ),有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同 质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒（图4-6）。质粒不亲和性现象图解在具有

16、两种质粒的大肠杆黄陶株中，由于复制控制体系之间的相互抑制作用*而导致质粒的分离， 形成只具一种质粒的细胞系.（a）在同一个细胞中含有两种不相容的质粒 6）蝎着细胞的分裂 质粒分配到两个于细胞中去；3）在下一次细胞分裂之前，质粒拷贝数加倍 3）两种不相容 质粒的拷员数比例发生变化,最终产生出H含有一种类型质粒的子细胞不亲和群（incompatibilitygroup）,指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。（2）质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质， 其浓度是与质粒的 拷贝数成正比的。阻

17、遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒 DNAT制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环( negative feedback loop )。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制法动便被抑制了；而当质粒处于低拷贝和低浓度遏蛋白质的条条件下，它的复制反应便会继续进行。由于每一种质粒的复制速率拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。第二节质粒DNA勺复制与拷贝数的控制一、质粒DN醺制的多样性不同质粒DNA勺复制在如下几个方面存多样性：（i

18、）对寄生酶的依赖性（ii ） DNA5合酶的利用 （iii ）复制的方向性 （iv）复制的终止（v）复制型 二.ColEI质粒DN侬制的启动ColEI质粒DNA勺复制，是从一个特定的复制起点（ori ）开始，并沿着环 DN吩子单向性地进行。控制此种质粒 DNAfi制启动的两种关键因素 RNAI和 RNAI两种RN的子，都是由ColEI DNA转录产生的。其中RNAI也叫做复制引 物。RNAI分子在转录起点附近同互补的模板 DNA成一种杂交分子，被 RnaseH 酶所切割，从而释放出3 -OH末端，作为供DNA5合酶I合成DNA勺引物。RNA 可以通过同RNAI结合，以阻止其与模板 DNAS生杂

19、交作用。因此，从本质上讲，ColEI质粒的复制启动显然是受一种负反馈机理控制的。 根据这种模型，细胞中RNA分子的浓度是随着质粒拷贝数的多寡而增减的。例 如，若细胞中质粒拷贝数下降到正常数值以下的水平，RNA的浓度也就相应降低，于是质粒的复制也就受到较少的抑制，结果导致其拷贝数的上升。三、质粒复制控制的分子模型目前公认的用于阐释质粒DNAS制控制机理的分子模型有两种：其一是自体 阻遏蛋白质模型（autorepressor model ）,其二是抑制蛋白质稀释模型（inhibitor dilution model）。前者的核心内容是，阻遏蛋白质的合成受负反 馈（negative feedback

20、）机理调节，而且其浓度是恒定的。后者的关键论点是， 阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。（1）抑制蛋白质稀释模型抑制蛋白质稀释模型如 图4-7所示。它认为质粒DNA勺复制，是受一种由质 粒DNAS码的抑制蛋白质Cop调控的。细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的 拷贝数成正比，它抑制质粒DNAM制活性的作用方式有两种途径：一种是通过同 质粒DNA勺复制起点（oir ）结合，直接地抑制质粒 DNA勺复制；另一种是通过 阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒 DNA勺合成。质粒DMA SE制控制的抑制蛋白质稀释模型（G质粒基因编码合成的抑制蚩内质壮如）,逋过对禺制起点的结合作用

21、,直接地抑制质粒分子的复制. （b）抑制蛋白质（C叩）通过阻止一种必观的起始蛋白庾的口）的合成，而间接地抑制质粒分子的豆制（2）自体阻遏蛋白质模型在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后，L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外一种解释质粒DN收制机理的自体阻遏蛋白质模型 （图4-8）。(b)质粒口NA复制控制的自体阻遏蛋白质模型POn启动子-操飘基因区（pEmatr-opemtor哨的,）1白ri =复制起点 方tr自体吼遇蚩白质基因jmp*起始蛋白期基因这个模型对质粒DNA制控制机理有两种解释：1 .质粒DNA勺复制是由一种叫做起始蛋白质 Rep引发的。Rep蛋白质编码基 因rep和

22、自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一 个mRN给子。自体阻遏蛋白质通过同启劝子-操纵基因区（P/O）的结合作用， 调节质粒DNA勺转录作用，以维持细胞中Arr和Rep蛋白质处于恒定的水平。而 后，由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori ）的结合， 来引发质粒DNA勺复制图4-8 （a）。2 . Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。它既具有自体阻遏蛋白质的 功能，可同P/O区结合而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能，能对复 制起点（ori ）发生作用，引发质粒DNAa行复制图4-8 （b）则由于其分子量较小、结构紧密，因此应用CsC

23、l-El母密度槿度圈心技术 纯化PBR3E2质粒DNA分子 照片是在紫外光下拍报的，染色体DNA带中.同样 也含有一定数量的线性的质粒口因A分子工质粒 DNA带则是teeDNA，由于实验中使用了氯毒素 扩埔技术因此质粒口NA含感显著地增加第三节质粒dnA勺分离与纯化应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是要获得批量的纯化的 质粒DNA子。我们通常是加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS来促使大肠杆 菌细胞裂解的，绝大部分的染色体DN盼子都将以高分子量的形式释放出来， 这 样便可以应用高速离心的方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去， 得到了比较清亮 的裂解液。目前已发展出了许多种方法，可用来从清

24、亮裂解液中纯化质粒DNA一、氯化葩密度梯度离心法在细胞裂解及DNA分离的过程上，大分子量的细菌染色体 DNA容易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒 DNA仍能保持完整的状态。氯化葩-EtBr密度梯度离心法，就 是根据这一差别建立的纯化质粒 DNA 的经典技术。当将含有澳化乙锭（EtBr） 的氯化葩（CsCl）溶液加到清亮的大肠 杆菌裂解液中时，EtBr扁平分子便会 通过在碱基对之间的嵌入作用而结合 成DN吩子链上，并因此导致双螺旋结 构发生解旋反应。线性的或开环的DNA 分子，例如大肠杆菌染色体 DNAt段， 可结合相当大量的EtBr分子。而像质 粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA分子

25、，EtBr分子的结合数 量相对较少。在 DNA-EtBr复合物中， 结合的EtBr分子数量越多，其密度也 就越低。通过氯化葩密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒DNA勺目 的（图4-9） o图4-10表明了分离纯化质粒DNA勺程序arc下震荡犷增增 养a小时后，转接于由 甑$tmL培舞基中搜取单曲落舞肿在 5mL含埴的素的培 等基中暖藩晤 养过夜接肿31nL日程增离心而淀的悻加入溶前肺，去再剂及高让溶液网心敝集*康他DNA的I-清液激烈渠精使细胞篁新拙浮.书 范下裁置ip分钟使制相裂解二电堀和碎片夙染色件DNA饵淀上揩彼（音萌粒DNA）击白喙染色体DN

26、A及开环的盾粒DMA超度靛的造粒DMARNA在上稍液中加入CsO和白凯染料, 】59！苣速阳心至平衡arc下缝鲤震苗噜养.静DmaOE时，加入篦的 素，再培蟀的旧小时，林丽 初川八广增收割箱叁旋的质粒DM X士SElBr并造折盐分离纯化质苞DNA的程序二、碱变性法这种方法是根据共价闭合环状质粒 DNAW线性染色体DNAt段之间，在拓扑 学上的差异而发展出来的。通过加热，尤其是在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，连接 DNA 互补链之间的氢键会被断裂，但由于cccDNA的双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补的两条链仍然会紧密地结合在一起。通过致冷或恢复中性pH 值更会迅速地复性，复性迅速

27、而准确。线性的染色体DN的子，在此过程中彼此已经分离开来的互补链之间的复性 作用就不会那么迅速而准确。 它们聚集形成的网状结构， 通过离心分离便会与变性的蛋白质及RN道沉淀下来。仍然滞留在上清液中的质粒 cccDNA则可用酒 精沉淀法收集。三、微量碱变性法微量碱变性法具有简单快速、 经济实惠的优点， 是当前分子生物学及基因工程研究工作中最常用的一种分离纯化质粒 DNA勺方法，现将其操作程序及其原理 简述如下 ：第一步， 取 1.5 毫升含有质粒的大肠杆菌过夜培养物加在微量离心管中， 离 心收集细胞沉淀，并用 100 微升冰冷的溶液I50mM 葡萄糖， 25Mm Tris-HCl(Ph8.0)

28、, 10Mm EDTA45mg溶菌酶/mL重新悬浮。将反应混合物在室温下 静置 5 分钟，让溶菌酶充分发挥效力，促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。溶菌酶对反应液的 pH 值有很大的依赖关系， TrisHCl 缓冲体系和适量的葡萄糖而有利于pH的调节。乙二胺四乙酸(EDTA ,可抑制酸酶的活性，从而保护质 粒DN颂被降解。第二步，加入200微升冰冷的溶液H 0.2N NaOH, 1.0%SDS,缓缓混匀后， 置室温下5分钟。SDS的作用在于使细胞裂解，以释放质粒及染色体的DNA在高pH值(12.012.5)的反应体系中，则会使线性缺口的质粒 DNAW及线性的 染色体DNAt段被选择性地变性，而

29、共价闭合环状的质粒DNAU不会受影响。第三步，加入150微升冰冷的pH4.8的3M醋酸钠，缓缓震荡10秒钟后，放 置在冰浴中5分钟。PH4.8的醋酸钠溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而使线性的质粒及染色体 DNAS性，并聚集成不可溶的网络状聚合物。 同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子发生沉 淀。通过离心处理，便可把网络状的DN咪合物同变性的蛋白质-DNA及RNA亨以复合物形式沉淀出来，从而使质粒 DNA马到纯化。第四步，将上述离心所得的主要是含有质粒cccDNA上的清液，用苯酚抽提数次除去蛋白质污染物，最后按酒精沉淀法收集质粒DNA。按照这种方

30、法制备的质粒DNA其纯度完全可以满足常规的基因克隆实验要 求。如有必要亦可用凝胶过滤法作进一步的纯化。四、影响质粒DNA产量的因素（1）寄主菌株的遗传背景大肠杆菌寄主菌株的正确选择，是获得高产量质粒DNA勺重要条件之下。为 此一般建议使用endA基因发生突变的（endAI）大肠杆菌寄主菌株，例如DH5x、 JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合 成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DN的子的稳 定性。所以从这类寄主细月fi中制备的质粒 DNA仅在质量上有所改进，同时在产 量上也得到了提高。（2）质粒的拷贝数及分子大小细菌培养物

31、中质粒DN0理论产量，可以根据公布的质粒的拷贝数和分子量 大小（bp）及每毫升培养物中的大肠杆菌细胞总数三者相乘得出（表4-3） o质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其 DNAT量的重要因素之一。若干常用质粒口气八的理怆产量质粒名就分子大小30拷贝数YA 产量2 700bP3007001. A4JpUC2 700bp5007002.1pBR5224 4gbp250, 23ColEl4 5 gbp1S0.15pACYC4 OOObp约10约 CL 09pSClO)g ooobp灼6约 0. 12第四节 质粒载体的构建及类型一、天然质粒用作隆载体的局限性天然质粒一般是指那些没有经过以基因克隆

32、为目标的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有CO1E1RSF212杂口 pSC101等。鉴于于然质粒用作基因克隆载体存在着不同程度的局限性，科学工作者便在其基础上进行了修饰改造，首先发展出了一批低分子量、高拷贝、多选择记号的 质粒载体。二、质粒载体必须具备的基本条件现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。 一般说 来，一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件 ：（i）具有复 制起点；（ii）具有抗菌素抗生基因；（iii ）具若干限制酶单一识别位点；（iv） 具有较小的分子量和较高的拷贝数。三.质粒载体的选择记号在基因克隆中采用的

33、质粒载体的选择记号，包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多种。但绝大多灵敏的质粒载体都是使用 抗菌素抗性记号。基因克隆实验中常用的几种抗菌素的作用方式及其抗性机理列 于表4-4。四、不同类型的质粒载体（1）高拷贝数的质粒载体适于分离大量的高纯度的克隆基因的 DNAt段。如ColEI、pMB做它们的派 生质粒。它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条 件下仍能继续复制。因此，若在处于对数生长晚期的含有 ColEI 一类质粒的大肠 杆菌培养物中，加入适量的蛋白质合成抑制剂讲如氯霉素或壮观霉素处理之后， 每个细胞中的质粒拷贝数则可扩增到 1000300

34、0个之多。如果加入高浓度的尿 核音，质粒DNAA可进一步扩增23倍。若干抗菌素的作用方式及其抗性机理抗荫素名称作用方式抗性机理题节育霉素(Amp)这是一种青霉素的衍生物它通过于 扰细菌胞壁合成之末端反应，而杀 死生氏的细胞霞草青蕉素抗性基因tbh或amp，).焉码的一种用 康脚.即殳内酰胺前,可持异地切割鼠卡青霉素 的斤内酰胺环，从而使之失去录前的效力氯常廉(CmJ)这是一冲抑菌剂.它通过同核糖体 50S虹基的结合作用，干扰细胞蛋 白质的合成，并阻止肢域的形成氟蜡素抗性基因feat或cm”编码的乙酰熨移旃.它特异地使疑零赛乙酰化而失活卡那德素f Kan)这是一种晟曲剂，它通过同70S旗糖 体的

35、结合作用,导致mRNA发生 借读( mi 当 reading)卡那班素的抗性基因CLn或kHiV)编码的氨基糖 昔璘酸转移SI.可时卡那毒素进行修饰从而阻 止其同将精体之间发生相互作用链毒素fSm)这是一种杀螭剂,它通过同极铺体的 30S亚第的结合作用.导数eRNA 发生错译链毒素抗性基因3或st序编码的-种特埠性情. 可对越将素进行修饰,从而抑制其同核一糖体加号 亚基的结合四环素(Tei)这是一种抑菌剂.它通过同核相体 3第电基之间的给合作用.阻止细 菌蛋白质的含成四环案抗牲茶因Ub或编码的一珅特异性的 蛋白质,可对细萌的膜结构进行修怖，从而阻止 四环素通过细胞膜从培养基中转运到细胞内(2)

36、低拷贝数的质粒载体适合于克隆含量过高又t寄主代谢有害的 DNA例如，pLG338 pLG339及 pHSG415这类质粒载体的一个普遍性问题是，由于它们体积小、拷贝数低，与 此相应的基因剂量也就较少，因此要制备大量的克隆DNAB很困难。(3)失控的质粒载体失控的质粒载体(runaway plasmid vectors )：是一些低拷贝的质粒，其 复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。B.E.Uhlin等人( 1979)首先发展了失控的质粒载体 pBEU侪口 Pbeu2。这种 质粒载体在30c下，每个寄主细胞中只含有适量的拷贝数，而当培养温度超过 35c时，质粒的

37、复制便失去了控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。 在这种高 温环境下，细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续23小时。这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了抑制，并失去了存活的能力，但在这个阶段质粒 DNAM累积至IJ占细胞总DNA勺50%(4)插入失活型的质粒载体选用插入失活型质粒，将外源DNAt段插入在会导致选择记号基因(如tetr、ampr、cmlr等)失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。除了 pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆 位点，因此都属于插入失活型的质粒载体。(5)正选择的质粒载体正选择质粒载

38、体(direct selection vectors )：这种质粒载体具有具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便 可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的 敏感性。(6)表达型的质粒载体使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的 转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质 的克隆载体特称为表达载体(expression vectors )。它分为表达一种典型的大胸杆菌投送型质粒段体的建怵囱年朝后盗于ipl 和寰M基因型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。一种典型的大肠杆菌

39、表达型质粒载体(图4-11)的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。（图4-12）的一个重要目标是缩小基因组PBR322质粒载体的梅建过程Amp-匚靴节青毒素忧性n辄毒素提拄行，二星耨索抗性r 号小工械脆抗性rK罩n卡郡5S京杭恨T田 园环常抗性第五节重要的大肠杆菌质粒载体、pBR322质粒载体pBR322质粒是目前在基因克隆中广泛使用的一种大肠杆菌质粒载体（1） pBR322质粒载体的构建在pBR322质粒载体的构建过程中 的体积，移去一些对基因克隆载体无 关紧要的DN*段，限制酶识别位点， 同时还要设法使质粒同存在

40、任何易位 子统统失去功能。易位子的转移（即 易位）有可能导致选择记号的丧失， 甚至也有可能使克隆的DNAt段丧失 或重排。构建pBR322粒的还必须通过 体内易位或体外重组加入可选择的抗 药性记号。图4-13表示了质粒载体的 形体结构。（2） pBR322质粒载体的优点pBR322质粒是由三个不同来源的 部分组成的：第一部分来源于pBR322 质粒易位子Tn3的氨苇青霉素抗性基 因（ampr）;第二部分来源于pSC101 质粒的四环素抗性基因（tetr ）;第 三部分则来源于ColEI的派生质粒Pmb1 的 DNAfi制起点（ori ）（图 4-14）P印小杷麻粒觥体的结构来窗复制起始位点质粒

41、pBR322的结构PBR322W粒载体优点主要表现在以下几个方面：第一，具有较小的分子量。pBR322W粒DN砌子为4 363bp。第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322 DN的子内具有多个限制酶识别位点，外源DNA勺插入某些位点会导致抗菌素抗性基因 失活，利用质粒DNAS码的抗菌素抗性基因的插入失活效应（图4-15）,可以有效的检测重组体质粒。Cal外微口 NApBR322质粒Tct，基因的插入失活效应外源DNA BamHI片段插入在pER322质粒基因的BamHl位点上，间断了痰甚 因的编码序列，插入形成的重组质粒仍具有Ampr活性,但失去了 Tetr活性+因此根

42、据Amp， Tet表型特征,可以标选出在BaniHT位点带疗外竦插入片段的嗔罪体pBR整2质粒.第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积 10003000个拷贝。这就为重组DNA勺制备提供了极大的方便。二、pUC质粒载体pUC载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5-端带有一段 多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系 列。（1） pUC质粒载体的结构 一种典型的pUC系列的质粒载体，包括如下四个 组成部分：（i ）来自pBR322质粒的复制起点（ori ） ; （ii ）氨苇青霉素抗性 基因（ampr）,但它的DNAR甘酸序列

43、已经发生了变化，不再含有原来的核酸内 切限制酶的单识别位点；（iii ）大肠杆菌B-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子 及其编码a-肽链的DNAF列，此结构特称为lacZ 基因；（iv ）位于lacZ 基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS区段，但它并不破坏该基因的功能（图4-16）塞克席位点 pUCl$ThrATG ACfMetATG1MeATTpUClQThr*TG AUX3H4ATTThrATCiLAAT TCQ 离GT TCG GTa IXCS T B6 即用 E LCii GGC G*T lXmaID Leu CTAAHGCCpUClB及pUC19质粒载体的形体图这是一种小分子最高

44、格贝的大胸杆解质粒栽体。多克隆位点MCS序列中含有Ec口阳、8配葭犬3】、SmMXml,Xb,Sdh AUincIIgiLSph】等单一设别位点.puc18与pucig相比.两者,的差别仅仅在于后克隆位点的持入方向彼此相反.在puci8中，EcoRi位点曦挨于P3匚下游，在PUC19中,印鼠】口检点紧挨于 包下游（2） pUC质粒载体的优点第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数如pUC8为2 750bP, pUC18为2686bP。pUC8质粒平均每个细胞即可达 500700个拷贝。第二，适用于组织化学方法检测重组体 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌 lac操纵子的:acZ基因，所编码的a-肽链可参与a-互补作用。因此，在应用pUC8质粒为载体的重组实验中，可用Xgal显色的组织化学方法一步实现对重 组体转化子克隆的鉴定。第三，具有多克隆位点MCSE段pUC8质粒载体具有与M13mp碌菌体载体 相同的多克隆位点MC也段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。 因此， 克隆在MCS!中的外源DNi片段，可以方便