第八章基因重组和杂交育种

1、凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为个体的方式，称为基因重组基因重组（gene recombination）或或遗传重组遗传重组（genetic recombination），），简称简称重重组组。重重 组组杂交杂交（hybridization）遗传物质遗传物质分子水平分子水平上的杂交上的杂交 细胞水平细胞水平 细胞水平的杂交包含分子水平上的重组。细胞水平的杂交包含分子水平上的重组。 基因重组是杂交育种的理论基础。在方向性基因重组是杂交育种的理论基础。

2、在方向性还是自觉性方面，比诱变育种前进了一大步。且还是自觉性方面，比诱变育种前进了一大步。且可消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的可消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。种手段。 原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。原核生物的基因重组形式很多，机制较原始。特点：特点： 片段性，仅一小段片段性，仅一小段DNADNA序列参与重组；序列参与重组； 单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；向受体基因组）作单方向转移； 转移机制独特

3、而多样，如接合、转化和转导等。转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等。受体菌受体菌（recipient cell，receptor）直接吸收直接吸收供体菌供体菌（donor cell）的的DNA片段而获得后者部分片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。遗传性状的现象，称为转化或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子转化子（transformant）。自然遗传转化自然遗传转化（natural genetic transformation）人工转化人工转化（artificial transformation）原核生物原核生物Streptoc

4、occus pneumoniae（肺炎链球菌）、肺炎链球菌）、Haemophilus（嗜血杆菌属）、嗜血杆菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、芽孢杆菌属）、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、根瘤菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、葡萄球菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、假单胞菌属）、Xanthomonas（黄单胞菌属）等。黄单胞菌属）等。真核微生物真核微生物Saccharomy cescerevisiae（酿酒酵母）、酿酒酵母）、Neu-rosporacrassa（粗糙脉孢菌）、粗糙脉孢菌）、Aspergillu

5、sniger（黑曲霉）等。黑曲霉）等。感受态感受态是指受体细胞最易接受外源是指受体细胞最易接受外源DNADNA片段片段并能实现转化的一种生理状态。并能实现转化的一种生理状态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。 感受态细胞感受态细胞（competent cell）具有摄取外源具有摄取外源DNADNA能力的细胞。能力的细胞。自然感受态自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DN

6、ADNA的能力，的能力，或人为地将或人为地将DNADNA导入细胞内。导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）感受态受遗传控制，但也存在个体差异。感受态受遗传控制，但也存在个体差异。感受态出现的时间不同；感受态出现的时间不同；感受态细胞所占比例和维持时间不同；感受态细胞所占比例和维持时间不同；外界环境因子如腺苷酸（外界环境因子如腺苷酸（cAMP）及及Ca2等对等对感受态也有重要影响。感受态也有重要影响。调节感受态的一类特异蛋白称调节感受态的一类特异蛋白称感受态因子感受态因子。膜相关膜相关DNADNA结合蛋白结合蛋白（membrane-associate

7、d DNA binding protein）细胞壁细胞壁自溶素自溶素（autolysin）几个核酸酶几个核酸酶 转化因子转化因子的本质是离体的的本质是离体的DNADNA片段。一般只有片段。一般只有1515kbkb左右。左右。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。在不同的微生物中，转化因子的形式不同。良好的转化因子有良好的转化因子有dsDNAdsDNA（最宜于细胞表面结合）、最宜于细胞表面结合）、ssDNAssDNA和和质粒质粒DNADNA，通常不能与核染色体组发生重组。通常不能与核染色体组发生重组。转化的频率通常为转化的频率通常为0.10.11.01.0，最高为，最高为2020。能发生转化的最

8、低能发生转化的最低DNADNA浓度极低，为化学方法无法浓度极低，为化学方法无法测出的测出的1 110105 5m mgmL（即即1 110101111gmL ）。）。（1）自然遗传转化（简称自然转化）自然遗传转化（简称自然转化） 1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象，的转化现象，转化过程研究得较深入的就转化过程研究得较深入的就是这种是这种G G细菌。细菌。目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：进行自然转化，需要二方面必要的

9、条件：建立了感受态的受体细胞建立了感受态的受体细胞外源游离外源游离DNA分子分子枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）strR，存在抗链霉素的基因标记存在抗链霉素的基因标记strS，有链霉素敏感型基因标记有链霉素敏感型基因标记自然转化过程的特点：自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）供体菌和受体菌之间的亲源关系；供体菌和受体菌之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；通常情况下质粒的自然转化效率要低得多

10、；b）不需要活的不需要活的DNA给体细胞；给体细胞；提高质粒的自然转化效率的二种方法：提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌重组获救重组获救。（2）人工转化）人工转化用用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基

11、础上发展和建立的一项细菌基因重在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源于一种可以摄取外源DNA的的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；质粒的转化效率高；指用提纯的病毒核酸（指用提纯的病毒核酸（DNADNA或或RNARNA）去感染其去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。后代的现象。噬菌体噬

12、菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒现在把现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体提纯的噬菌体DNADNA以转化的（而非感染）途径以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：特点：转染转染转化转化把重组噬菌体或重组病把重组噬菌体或重组病毒毒DNADNA引入受体细胞引入受体细胞 以质粒为载体的重组以质粒为载体的重组DNADNA分子引入受体细胞分子引入受体细胞 通过通过缺陷噬菌体缺陷噬菌体（defective phage）的媒介，的媒介，把供体细胞的小

13、片段把供体细胞的小片段DNADNA携带到受体细胞中，通过携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为象，称为转导转导。获得新遗传性状的受体细胞，就。获得新遗传性状的受体细胞，就称称转导子转导子（transductant）。）。由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的一个细胞的DNADNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中 能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为带

14、到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体转导噬菌体。细菌转导的二种类型：细菌转导的二种类型：普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导流产普遍转导流产普遍转导完全普遍转导完全普遍转导通过极少数通过极少数完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体对对供体菌供体菌任何小任何小片段片段DNADNA进行进行“误包误包”，而将其遗传性状传递给，而将其遗传性状传递给受体受体菌菌的现象，称为的现象，称为普遍转导普遍转导。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介。 简称简称普遍转导普遍转导或或完全转导完全转导（complete transduction）。经转导嗜菌体的媒介而获得了供。经转导嗜菌体的媒

15、介而获得了供体菌体菌DNADNA片段的受体菌，外源片段的受体菌，外源DNADNA在其内进行在其内进行交换、交换、整合和复制整合和复制，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，使其成为一个遗传性状稳定的重组体，称作称作普遍转导子普遍转导子，这种现象就称普遍转导。，这种现象就称普遍转导。Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）鼠伤寒沙门氏菌）的野生菌株的野生菌株Salmonella typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）鼠伤寒沙门氏菌）的营养缺陷型突变株的营养缺陷型突变株P22P22嗜菌体嗜菌体供体菌供体菌受体菌受体菌转导模型供体菌供体菌受体菌受体菌转导媒介转导媒介嗜菌体嗜菌体误

16、包误包转导颗粒转导颗粒普遍转导子普遍转导子双双交交换换同源配对同源配对1010-6-61010-8-8S.typhimurium的的P22P22噬菌体噬菌体、E.coli的的P1P1噬菌体噬菌体、Bacillus subtilis的的PBS1PBS1和和SP10SP10等噬菌体等噬菌体都能进行都能进行完全普遍转导完全普遍转导。供体菌供体菌转导媒介转导媒介嗜菌体嗜菌体受体菌受体菌 简称简称流产转导流产转导（abortive transduction）。经转经转导嗜菌体的媒介而获得了供体菌导嗜菌体的媒介而获得了供体菌DNADNA片段的受体菌，外片段的受体菌，外源源DNADNA在其内既在其内既不进行

17、交换、整合和复制不进行交换、整合和复制，也不迅速消，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。流产转导。受体菌受体菌外源外源DNADNA细胞分裂细胞分裂外源基因经转录、转译而外源基因经转录、转译而形成的少量酶形成的少量酶获得外源获得外源DNADNA获得少量酶获得少量酶不不断断稀稀释释特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。普遍

18、性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：进入受体的外源进入受体的外源DNA通过通过与细胞染色体的重组交换与细胞染色体的重组交换而形成稳定的而形成稳定的转导子转导子。流产转导流产转导（abortive transduction）转导转导DNA不能进行重组和复制，但其不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源外源DNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。

19、而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。 指通过指通过部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把把供体菌供体菌的少的少数数特定基因特定基因携带到携带到受体菌受体菌中，并与后者的基因组整中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。合、重组，形成转导子的现象。 最初于最初于19541954年在年在E. coliK12中发现。中发现。特点：特点： 只只局限于传递供体菌核染色体上的局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因；一般为噬菌体整合位点两侧的基因； 该特定基因由该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体携带；携带； 缺陷噬菌体的形成

20、方式是由于它在脱离宿主染色体过缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主染色体过程中，发生低频率（程中，发生低频率（1010-5-5）“误切误切”（不正常切离，（不正常切离，abnormal excesion）或由于双重溶源菌的或由于双重溶源菌的裂解裂解而形成；而形成； 局限转导噬菌体的产生要通过局限转导噬菌体的产生要通过UVUV等因素对溶源菌的等因素对溶源菌的诱导诱导并引起裂解后才产生。并引起裂解后才产生。局局限限转转导导低频转导低频转导高频转导高频转导根据转导子出现频率的高低分类根据转导子出现频率的高低分类温和噬菌体感染温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上整合到细菌染色体的特定位点上宿主

21、细胞发生溶源化宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体连在噬菌体DNA上上部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNADNA分子一样进行分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒转导颗粒。但没有正常噬菌体的但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力溶源性和增殖能力，感

22、染受体细胞，感染受体细胞后，通过后，通过DNADNA整合进宿主染色体而形成稳定的整合进宿主染色体而形成稳定的转导子转导子。E. coli的的嗜菌体嗜菌体和和8080嗜菌体嗜菌体具有局限转导的能力。具有局限转导的能力。 正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主核基因时，因噬菌体的基因整合到宿主核基因组上，而使宿主获得了除免异性外的组上，而使宿主获得了除免异性外的新遗传性新遗传性状状的现象，称溶源转变。的现象，称溶源转变。一个与转导相似又不同的现象一个与转导相似又不同的现象溶源转变与转导的不同？溶源转变与转导的不同？a）这是一

23、种不携带任何外源基因的正常时菌体；这是一种不携带任何外源基因的正常时菌体；b）是嗜菌体的基因内而不是供体菌的基因提供了是嗜菌体的基因内而不是供体菌的基因提供了宿主的信性状；宿主的信性状；c）新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子；传重组形成的稳定转导子；d）获得的性状可随嗜菌体的消失而同时消失；获得的性状可随嗜菌体的消失而同时消失； 供体菌供体菌（“雄性雄性”）通过通过性菌毛性菌毛与与受体菌受体菌（“雌雌性性”）直接接触，把）直接接触，把F F质粒质粒或其携带的不同长度的或其携带的不同长度的核基因核基因组片段组片段传递给后者，

24、使后者获得若干新遗传性状的现象，传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为称为接合接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是是接合子接合子（conjugant）。）。1946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验细菌的多重营养缺陷型杂交实验通过细胞与细胞的直接接触而产生的通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程遗传信息的转移和重组过程中间平板上长出的中间平板上长出的原养型菌落是两菌原养型菌落是两菌株之间发生了遗传株之间发生了遗传交换和重组所致！交换和重组所致！大肠

25、杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导因子的质粒介导F因子的分子量通常为因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的及控制接合过程进行的20多个基因。多个基因。含有含有F因子的细胞：因子的细胞：“雄性雄性”菌株（菌株（F+），），其细胞表面有性菌毛其细胞表面有性菌毛不含不含F因子的细胞：因子的细胞：“雌性雌性”菌株（菌株（F-），），细胞表面没有性菌毛细胞表面没有性菌毛F因子为附加体质粒因子为附加体质粒可脱离染色体在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上可脱离染色体

26、在细胞内独立存在，可插入（整合）到染色体上F F因子的四种细胞形式因子的四种细胞形式a）F F- -菌株菌株， 不含不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收作用接收F因子而变成雄性菌株（因子而变成雄性菌株（F+）；）；b）F F+ +菌株菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）HfrHfr菌株菌株，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上上，细胞表面有性菌毛。，细胞表面有性菌毛。d）FF菌株菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割而脱离染因子因不正常切割而脱离染色体时，色体时， 形成游离的但携带一小段

27、染色体基因的形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，因子，特称为特称为F因子。因子。 细胞表面同样有性菌毛。细胞表面同样有性菌毛。通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为状的稳定的重组子的过程，称为原生质体融合原生质体融合。由此法获得的重组子，成为由此法获得的重组子，成为融合子融合子（fusant）。）。选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本脱壁酶脱壁酶细菌或放线菌可用细菌或放线菌可用溶菌酶溶菌酶或或青霉素青霉素处理，处理，真菌可用真菌可用蜗牛酶蜗牛酶或其他相应的或其他相应的脱壁酶脱壁酶等等离心聚集离心聚集在高渗溶液中稀释在高渗溶液中稀释加入促融合剂或电脉冲加入促融合剂或电脉冲各种选择性培养基各种选择性培养基原生质体融合的主要步骤是：原生质体融合的主要步骤是：原生质体融合的重组频率已大于原生质体融合的重组频率已大于1010-1-1（而诱变育种一（而诱变育种一般仅为般仅为1010-6-6）；）；同种的不同同种的不同菌株间菌株间或或种间种间进行融合，进行融合，属间、科间属间、科间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间甚至更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合