RIG-I样受体介导的信号转导

1、RIG-I样受体介导的信号转导1简介固有免疫(innateimmunity)又称非特异性免疫(nonspecificimmunity),是人体抵抗外来生物入侵的第一道防线。与适应性免疫相比，固有免疫具有作用范围广、反应出现快、参与反应的免疫细胞多、相对稳定性和遗传性等特点。近年来，固有免疫在分子水平上的识别及调控机制越来越受到关注。哺乳动物的固有免疫识别及调控主要通过一系列的模式识别受体(patternrecognitionreceptorPRR)识别病原微生物上表达的保守的病原体相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern,PAMP)来实现，这种形式让机

2、体不但可以发现入侵的病原体，而且能够识别其类型，并通过一系列信号途径活化效应分子，识别自我与非我，激活与调控固有免疫应答，并且相互协同或互相调节以形成调控网络，从而控制并消除病原体，在固有免疫中发挥独特的功能。根据天然免疫中的病原模式识别受体的结构特点，PRR可以分为Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)、RIG-I样受体(RIG-Ilikereceptor,RLR)和NOD样受体nucleotideoligomerizationdomain(NOD)-likereceptor,NLR等。TLR家族属于I型跨膜蛋白，主要分布在细胞膜表面或者吞噬囊泡膜上。因此它们只能识别细

3、胞外或者经过吞噬进入细胞的PAMP,而对细胞质中的RNA病毒则无法做出反应。RLR是抗病病毒先天免疫信号通路中重要的病毒受体，可以识别细胞内不同病毒的RNA,包才SRIG-I(retinoicacid-inducedgeneI、MDA5(melanomadifferentiation-associatedgene-5和LGP2(laboratoryofgeneticsandphysiology21,2。2RLR的结构和功能RLR都含有RNA解旋酶(RNAhelicase)活性，同属超家族2(superfamily2,SF2)解旋酶。RIG-I由925个氨基酸残基组成，其N端含有两个级联激活和招

4、募结构域(caspaseactivationandrecruitmentdomainCARD),中间包括RNA解旋酶和ATP结合结构域(ATP-bindingdomain),C端则是RNA结合结构域(RNA-bindingdomain,RBD)和抑制结构域(repressordomainRD)。在无外界刺激的条件下，体外过表达RIG-I的CARD结构域可以持续激活I型干扰素的表达，说明CARD结构域是其效应结构域；而过表达其C端或失去结合ATP活性的突变体(K270A)则能移植病毒诱导的I型干扰素的表达，免疫共沉淀实验表明RIG-I的C端能与其CARD以及RNA解旋酶结构域相互作用，说明RIG

5、-I的激活依赖于其ATP结合活性，而RIG-I的C端对调节其激活起着至关重要的作用3,4。MDA5由1025个氨基酸组成，其N端也含有两个CARD结构域，中间是RNA解旋酶结构域，这两个结构域与RIG-I的CARD和RNA解旋酶结构域分别有23%和35%的相似性。其C端含有一个RD结构域。过表达MDA5或者其CARD结构域能激活I型干扰素的表达5,这与RIG-I的功能类似。LGP2全长678个氨基酸，与RIG-I和MDA5不同的是，LGP2不含有N端的CARD结构域，它由N端的RNA解旋酶结构域和C端的RNA结合结构域组成。其RNA解旋酶结构域与RIG-I和MDA5的解旋酶结构域分别有41%和

6、31%的相似性。体外实验表明，LGP2能抑制RIG-I/MDA5介导的信号转导6。CARDCARDH由iia前DomadfiApresBorDomainRIG-I(HLR-1)：iPCML卜MDA5(RLR-2)：HLGP2(RLR-3)：tJS7&Fig.1.RLRs的一级结构。(摘自MitsutoshiYoneyama&TakashiFujita,2007)3 RLR的激活和对RNA病毒结构的识别在抗病毒天然免疫反应中，RLR对病毒的识别起到了重要调节作用。在细胞静息状态时，细胞内参与RLR识别的信号分子出于非活化状态。具体表现在，RIG-I的CARD结构域，ATPase和

7、RNA解旋酶结构域被其C端的抑制结构与所掩盖，RIG-I处于非活化状态。病毒在感染复制的过程中会产生5'pppssRNAE者dsRNA,RIG-I的C端RNA结合结构域识别并结合这些RNA后，构象发生改变，导致其ATPase结构域暴露出来，具有ATPase活性。ATPase吉构域结合并水解ATP,使得RIG-I与病毒RNA的能力加强，从而使RIG-I的CARD结构域活化，同时ATPase的活化可诱导RIG-I二聚化或寡聚化，使得RIG-I能与下游的接头蛋白相互作用并将信号向下游传递1,5。病毒通过胞吞或者膜融合作用将其核酸物质释放进入细胞质内，病毒核酸在细胞内复制的过程中，会产生RNA

8、中间产物，如5'端磷酸双链RNA(double-strandRNA,dsRNA)以及5'端三磷酸单链RNA5'triphosphatesing-strandRNA(ssRNA),pppssRNA。RIG-I和MDA5可以识别这些RNA中间产物，并被激活，从而将信号传至下游，诱导I型干扰素的表达。2006年，Kato等发现RIG-I基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(RIG-I-/-MEF)与野生型细胞相比，被新城疫病毒(newcastlediseasevirusNDV)、仙台病毒(sendaivirus,SeV)、水泡性口炎病毒(vesiclestomatitisvirus,

9、VSV)、流感病毒A(influenzaAvirus)以及日本脑炎病毒(JapaneseencephalitisviruS感染后，产生I型干扰素的能力大大下降，而MDA5/MEF被这些病毒感染后产生的I型干扰素并没有受到影响。相反，在MDA5-/-MEF细胞中，被小RNA病毒科感染后，如脑心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus,EMCV)、泰勒病毒(Theiler'sviruS口门戈病毒(Mengovirus),几乎不再产生I型干扰素，而RIG-I-/-MEF被这些病毒感染后产生I型干扰素的能力没有受到很大的影响。相应的，RIG-I-/-以及MDA5-/-小鼠分

10、别对VSV和EMCV易感，这说明，RIG-I和MDA5在抵抗不同的RNA病毒感染过程中发挥着非常重要的作用：即RIG-I负责识别绝大多数的单链RNA病毒，包括正链和负链RNA病毒，而MDA5主要负责识别微核酸病毒家族的某些成员，例如EMCV、小鼠诺如病毒(murinenorovirus)、冠状病毒科的小鼠肝炎病毒(murinehapititisvirus)。RIG-I和MDA5对于双链RNA病毒呼吸孤病毒科病毒的识别依赖于其基因组dsRNA片段的长度；对于黄病毒科家族成员的识别则依赖于病毒本身，如RIG-I特异识别JEV和HCV,RIG-I和MDA5共同识别西尼罗河病毒(WestNilevir

11、us)和登革病毒(Denguevirus)4,7。4 RLR介导的信号转导RLR受外界刺激激活后，通过招募下游的接头蛋白，触发一系列的信号级联反应，最终激活转录因子NF-kB(nuclearfactor)和干扰素调节因子(interferonregulatoryfactor,IRF),从而诱导I型干扰素的产生。2005年，四个不同的研究团队几乎同时报道了RLR下游的一个接头蛋白VISA(virus-inducedsignalingadapt。也被称为MAVS(mitochondrialantiviralsignaling)>IPS-1(interferon-Bpromotorstimul

12、ator1和Cardif(CARDadaptorinducingIFNB)8-11。VISA的N端还有一个与RIG-I和MDA5类似的CARD结构域。过表达VISA可以激活IFNB和NF-kB的启动子，从而诱导I型干扰素的分泌。2008年，两个独立的研究团队报道了VISA下游的接头蛋白，分别命名为STING(stimulatorofinterferongene)和MITA(mediatorofIRF3activation)12,13。STING的N端含有4个跨膜结构域，其中第三个跨膜结构域负责将MITA定位在线粒体上，C端是其效应结构域，含有一系列的磷酸化位点，具358位丝氨酸的磷酸化对其介导

13、I型干扰素的激活非常重要。免疫共沉淀实验表明STING的N端与VISA的C端相互作用，是的STING通过VISA与RLRs相互作用，实现信号的向下游传导13。4.1 RLR介导的NF-冗B的激活VISA对NF-kB的激活是通过月中瘤坏死因子受体相关因子(tumornecrosisfactorreceptorassociatedfactorTRAF)来实现的。近年来，有报道表明TRAF2、TRAF3和TRAF6都参与了病毒诱导的RLR介导的NF-kB的激活。其中VISA可以与TRAF2和TRAF6相互作用而激活NF-kB。VISA含有两个保守的TRAF6的结合位点和一个TRAF2结合位点,并通过

14、这些保守位点分别与TRAF6和TRAF2发生相互作用。在TRAF6-7-MEF中，VISA不能有效激活NF-kB,这说明VISA对NF-kB的激活是通过TRAF6和TRAF2来实现的11。TRAF6对下游NF-kB的激活是通过自身的泛素化来实现的。TRAF6首先与两个TRIKA(TRAF6-regulatedIKKactivator,TRIKA1和TRIKA2)复合物相互作用，从而使得TRAF6自身发生K63-连接的泛素化，进而招募IKK复合物(IKKa/Mr,催化IKK丫发生K63-连接的泛素化被激活，进一步磷酸化屋履白，磷酸化的IkB被泛素连接酶复合物识别，促进其以蛋白酶体依赖的降解途径发

15、生降解，NF-kB被释放出来，发生二聚化入核，启动下游基因的表达14。除了TRAF6和TRAF2,VISA还可以招募一类具有死亡结构域的蛋白TRADD(TNFR-associatedDD)、FADD(Fas-associatedDD和RIP(receptorinteractingprotein)。2008年，Tschopp领导的小组发现TNFR的接头蛋白TRADD能够激活IFN0,VISA在TRADD-/-MEF中不能激活IFN&同时TRADD-/-MEF对VSV易感，这说明TRADD在VISA的下游起作用。止匕外，在FADD-/-MEF或RIP-/-MEF中VISA对NF-kB的激活

16、受到了抑制，而对IRF的激活没有受到影响，同时，研究表明，VISA能与TRADD、FADD和RIPA发生相互作用，这说明VISA可以通过TRADD/FADD/RIP向下游传递信号，从而激活NF-kB信号通路15。RLRXtNF-kB信号通路的激活除了以上两种经典的方式以外，还可以通过非经典途径激活NF-kB,在细胞不受刺激时，TRAF2与NIK(NF-kB-inducingkinase)相互彳用，TRAF3与两个凋亡抑制蛋白cIAP1(cellularinhibitorofapoptosisproteinD和cIAP2相互作用，TRAF2和TRAF3通过二聚化使得NIK和cIAP1/2的空间距

17、离缩短，从而泛素化NIK,使其被降解。NIK是IKKa的直接激酶，NIK的降解导致IKKa无法活化，信号处于静息状态。当细胞受到刺激时，TRAF2催化cIAP1/2发生泛素化被激活，cIAP1/2泛素化TRAF3,促使TRAF3被降解，这样cIAP1/2与NIK解离，NIK在细胞中积累，从而磷酸化IKKa,IKKa被激活后泛素化p100,p100被剪接成p52,p52与RelB形成二聚体，入核激活下游基因表达14,16,17。4.2 RLR介导的IRF的激活IRF是一个分布极广的转录因子家族，按照发现的顺序依次被命名为IRF1-9。其中，IRF3和IRF7高度同源，是RLR介导的信号转导引起的

18、I型干扰素表达的关键调节因子。在RLR激活的IRF信号通路中，TBK1和IKKe是参与激活IRF的重要激酶。TBK1-/-和IKK的细胞中，病毒诱导的NF-kB的激活并没有受到影响，而IRF3的激活受到了抑制，这说明TBK1和IKKe仅仅参与了RLR激活IRF的信号通路。TBK1几乎在所有的细胞中都持续表达，IKKe仅仅在T细胞、骨髓来源的巨噬细胞和外周血细胞中表达，在其他细胞中，只有受到某些因子的刺激时才表达18,19。在TBK1-/-MEF中过表达VISA并不能激活INF0,说明TBK1在VISA的下游起作用。研究人员发现，TRAF3能与VISA和TBK1相互作用，并能促进TBK1和IKK

19、e激?SI型干扰素的表达；TRAF3”的细胞中，病毒诱导的I型干扰素的表达大大下降，TRAF3-/-小鼠在病毒感染后死亡率大大增加。这说明TRAF3有可能通过将TBK1招募到VISA,在RLR介导的信号通路中起作用4。2008年，有团队发现线粒体定位的蛋白MITA能作为重要的接头蛋白，并在VISA下游发挥作用，免疫共沉淀实验表明，MITA可以与VISA相互作用，并且可以将TBK1和IRF3招募到VISA,形成一个复合物。同时，MITA的第358位丝氨酸被TBK1磷酸化后被激活，从而促进IRF3的磷酸化并将其激活。激活后的IRF3发生二聚化，进入细胞核，起始下游基因的转录13。5 RLR介导的信

20、号转导的调节病毒感染计入细胞后，机体会迅速做出反应，激活RLR介导的信号转导，大量诱导I型干扰素等细胞因子的表达。这些细胞因子又会通过一系列的信号级联放大反应，将病毒感染的信号进一步放大，从而抑制病毒的复制和消除病毒感染的损伤细胞。但是过度的免疫反应同样会对机体造成伤害，从而引发自身免疫疾病，例如系统性红斑狼疮。因此，为了避免过度免疫，机体进化出了一系列的调节信号对RLR介导的信号通路进行负反馈调节。例如前文提到的LGP2作为RLR的第三个成员，能够抑制I型干扰素的表达，有研究表明，LGP2是通过其RNA结合结构域竞争性结合病毒的RNA,阻止RLR对病毒RNA的结合，从而阻止RLR的激活，对R

21、LR介导的信号通路造成负反馈调节；此外，还有研究发现，LGP2能与RIG-I相互作用，抑制其二聚化或多聚化，从而抑制RIG-I的激活20-23。此外，机体还可以通过降解下游的信号分子来负调节RIG-I信号通路。例如E3泛素连接酶RBCK1(RBCCproteininteractingwithPKC1)可以通过其N端的类泛素(ubiquitin-like,UBL)结构域与TAB2C端的ZNF结构域相互作用，泛素化TAB2/3,使其被蛋白酶体识别并降解，从而抑制TNF诱导的NF-kB的激活。前文提到RLR激活NF-kB同样依赖于TAB2/3,因此，随着病毒刺激RBCK1表达量增强，同样会抑制RLR

22、介导的NF-kB的激活。此外，也有研究表明，随着病毒刺激，RBCK1表达量提高，也会通过其N端与IRF3相互作用并促使IRF3泛素化降解，抑制RLR介导的IRF3的激活24,256结语近年来，随着生命科学的迅速崛起，关于抗病毒天然免疫反应中RLR的研究报道较多，但仍有许多精密机制尚未阐释。如RIG-I不仅能识别RNA病毒，还能识别DNA病毒，那么在识别DNA病毒时，RIG-I自身结构是否发生变化，在信号传递方面是否存在其他传导途径等，这些问题仍有待解决。同时，越来越多的研究数据表明，在RLR信号通路上关键分子的泛素化、ISG化及去泛素化作用，在整个抗病毒天然免疫反应中发挥着重要调节作用。首先，

23、泛素化能够诱发和扩大免疫反应，促进IFN表达，增强机体抗病毒能力。其次，机体内的DUB在特定条件下，特异性地切除免疫反应中关键蛋白的多聚泛素链，阻止信号向下游分子传递和IFN的表达，从而实现机体的负调节，防止由于IFN的过度表达而引起自身免疫损伤。这也使得泛素化的研究成为免疫研究的热点领域之一。到目前为止，关于RLR对整个免疫反应的调节作用及其机制还存在着许多迷点，有待进一步研究。参考文献1. Chattopadhyay,S.andG.C.Sen,RIG-I-likereceptor-inducedIRF3mediatedpathwayofapoptosis(RIPA):anewantivir

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