细菌的培养及鉴定课件

1、细菌细菌(xjn)培养及鉴定培养及鉴定 第一页，共六十页。标本标本(biobn)采集原则采集原则1.1.及时及时采集微生物标本作病原学检查采集微生物标本作病原学检查(jinch)(jinch)2.2.在抗菌药物在抗菌药物使用前使用前采集标本采集标本3.3.采样时严格执行采样时严格执行无菌操作无菌操作4.4.标本标本容器须无菌容器须无菌，但不得有消毒剂但不得有消毒剂5.5.采样后采样后立即送检立即送检6.6.送检标本应注明送检标本应注明来源来源和检验和检验目的目的第二页，共六十页。咳痰方法咳痰方法(fngf) 病人病人(bngrn)先先漱口，漱口，清洁口腔，清洁口腔，去除表面的菌群去除表面的菌群

2、 病人病人深咳深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液，收集从下呼吸道咳出的痰液 无痰可用无痰可用35NaCl 5ml雾吸约雾吸约5min导痰导痰 以清晨以清晨第二口第二口痰为佳痰为佳 标本采集后放置时间不超过标本采集后放置时间不超过2小时小时 第三页，共六十页。清洁清洁(qngji)中段尿液中段尿液 尽量取早晨尽量取早晨(zo chen)(zo chen)第一次第一次尿液尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人女性病人收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水冲洗尿道口口排出几毫升后，排出几毫升后，不停止不停止尿流，

3、采集尿流，采集中段尿中段尿 男性病人男性病人翻转包皮，清洗尿道口翻转包皮，清洗尿道口排出几毫升后，不停止尿流排出几毫升后，不停止尿流,采集采集中段尿中段尿 采集标本后立即送检！采集标本后立即送检！第四页，共六十页。 哥伦比亚血平板哥伦比亚血平板营养营养(yngyng)要求高的细菌要求高的细菌 巧克力平板巧克力平板含含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎因子，主要培养嗜血杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌用球菌和淋球菌用 中国蓝中国蓝/麦康凯平板麦康凯平板G-杆菌用杆菌用 SS平板平板沙门氏菌和志贺氏菌用沙门氏菌和志贺氏菌用 M-H平板平板细菌药敏用细菌药敏用 TCBS平板平板弧菌科细菌用弧菌科细菌用 沙

4、包氏平板沙包氏平板真菌培养用真菌培养用 真菌显色平板真菌显色平板真菌培养用真菌培养用 罗氏培养基罗氏培养基分枝杆菌用分枝杆菌用常用的培养基种类(zhngli)和用途第五页，共六十页。临床标本临床标本(biobn)培养基选择培养基选择 血血： 血培养瓶血培养瓶 中断尿中断尿：血平板：血平板(pngbn)、mac平板平板(pngbn) 脑脊液脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平：血培养瓶、血平板、巧克力平板板 穿刺液穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平：血培养瓶、血平板、巧克力平板、板、mac平板平板 胆汁胆汁：血平板、巧克力平板、：血平板、巧克力平板、mac平板平板 大便大便:. .麦康凯、麦康凯、

5、SSSS、血、血平板平板第六页，共六十页。细菌细菌(xjn)接种的基本程序接种的基本程序灭菌(mi jn)接种环沾取标本(biobn)接种灭菌接种环第七页，共六十页。细菌细菌(xjn)接种法接种法 平板划线接种法：平板划线接种法： 目的目的(md)：使混合的细菌呈单个分散生长，：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。形成单个菌落，以便获得纯菌。 方法：方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本分区划线法：适用于含菌量较多的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本第八页，共六十页。分区分区(fn q)划线法划线法(3区区)第一(dy)区划线灭菌(m

6、i jn)接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环第九页，共六十页。连续连续(linx)划线法划线法第十页，共六十页。细菌细菌(xjn)培养法培养法 一般培养一般培养（需氧培养）：（需氧培养）：培养温度：培养温度：35（采用恒温培养箱）（采用恒温培养箱）培养时间培养时间(shjin)：1824h 二氧化碳培养法二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养：烛缸法、二氧化碳培养箱箱 厌氧培养法厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等第十一页，共六十页。细菌在固体培养基中的生长细菌在固体培养基中的生长(shngzhng

7、)现象现象 菌落菌落定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状菌落特征：大小、形状(xngzhun)、边缘、颜色、表面、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性透明度、湿润度、黏度、溶血性菌落类型：光滑型（菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（）、粗糙型（R）、黏液型（）、黏液型（M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。第十二页，共六十页。菌菌 落落第十三页，共六十页。菌落菌落(jnlu)与菌苔与菌苔第十四页，共六十页。菌落菌落

8、(jnlu)的三个类型：的三个类型：1.1.光滑光滑(gung hu)(gung hu)型菌落（型菌落（Smooth type ColonySmooth type Colony） ：又称：又称S S型型2.2.粗糙型菌落（粗糙型菌落（Rough type ColonyRough type Colony）：又称）：又称R R型型3.3.粘液型菌落（粘液型菌落（Mucoid type ColonyMucoid type Colony）又称）又称M M型型第十五页，共六十页。2022-4-1716 S型菌落型菌落(jnlu) 第十六页，共六十页。R型菌落(jnlu)第十七页，共六十页。第十八页，共六

9、十页。革兰染色革兰染色(rns) 原理原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其合物牢牢留在壁内，使

10、其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量细胞壁薄、外膜层类脂含量(hnling)高、肽聚糖层薄且交联高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就通过乙醇脱色后仍呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。使革兰氏阴性菌呈红色。第十九页，共六十页。 革兰染色革兰染色(rns)步骤步骤 涂片(t pin)包括涂片(t pin)、干燥、固定三步。 涂片

11、 干燥 固定第二十页，共六十页。固定固定(gdng)的目的：的目的： 使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热(ji r)固定可杀死细菌，比较安全。 第二十一页，共六十页。 结晶(jijng)紫 1 碘液 1 95%乙醇 30” 复红1 冲洗 滤纸干燥 油镜观察冲洗(chngx)冲洗(chngx)冲洗革兰染色程序初染媒染脱色复染第二十二页，共六十页。紫色（G）革兰氏染色(rns)步骤示意图革兰染色(rns)甲菌乙菌初染结晶(jijng)紫媒染碘液脱色乙醇复染稀释复红紫色（G）红色（G-）革兰染色步骤示意图第二十三页，共六十页。【结果结果(ji gu)】 细菌

12、(xjn)被染成紫色者，称为革兰阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；阳性菌紫色（G+b) 阴性菌红色(hngs)（G-b)第二十四页，共六十页。G+ 球菌(qijn)第二十五页，共六十页。显微镜下的杆菌(gnjn)G-杆菌(gnjn)Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells第二十六页，共六十页。痰标本痰标本(biobn)涂片染色低倍镜下分类涂片染色低倍镜下分类 分级分级 白细胞白细胞（个）（个） 上皮细胞上皮细胞（个）（个） A 25 25 25 C 25A、B两种情况的痰适合做培养两种情况的痰适合做培养(piyng)，C不合格，应重新

13、留标本不合格，应重新留标本第二十七页，共六十页。革兰染色革兰染色(rns)注意事项注意事项 标本标本涂片涂片不宜不宜太厚太厚 固定固定不宜不宜过热过热(u r) 脱色脱色不宜不宜过度过度 选用培养选用培养18-24小时小时菌龄的细菌为宜菌龄的细菌为宜第二十八页，共六十页。抗酸染色抗酸染色(rns) 原理原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中其中主要成分为分枝菌酸主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性此物具有抗酸性,染染色时与石炭酸复红结合色时与石炭酸复红结合(jih)牢固牢固,能抵抗酸能抵抗酸性乙醇的脱色作用性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复因此抗酸菌能保持复红的颜色红的

14、颜色,达到染色目的。达到染色目的。第二十九页，共六十页。 抗酸染色抗酸染色(rns)步骤步骤 1、涂片包括(boku)涂片、干燥、固定三步。 涂片 干燥 固定第三十页，共六十页。抗酸染色抗酸染色(rns)步骤步骤2、染色包括、染色包括(boku)初染、脱色、复染三步。初染、脱色、复染三步。 石炭酸复红维持 3-5 3%盐酸酒精(jijng)30 1 美蓝复染1 冲洗 干燥 油镜观察冲洗冲洗初染脱色复染第三十一页，共六十页。抗酸染色抗酸染色(rns)结果结果抗酸菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝(fn zh)状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。第三十二页，共六十页。抗酸杆菌抗酸杆菌(gnjn

15、)报告报告 300个视野个视野(shy)仅见到仅见到18条抗酸杆菌填条抗酸杆菌填写条数写条数 1+：镜检查见：镜检查见3-9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/100高倍镜高倍镜视野视野 2+：镜检查见：镜检查见19条抗酸杆菌条抗酸杆菌/10高倍镜高倍镜视野视野 3+：镜检查见：镜检查见1-9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/高倍镜视高倍镜视野野 4+:镜检查见镜检查见9条抗酸杆菌条抗酸杆菌/高倍镜视野高倍镜视野第三十三页，共六十页。抗酸染色抗酸染色(rns)注意事项注意事项 染色染色充分充分 脱色时间脱色时间宁长勿短宁长勿短 在涂抹痰标本时在涂抹痰标本时严禁严禁(ynjn)对载玻片进行对载玻片进行加加热热第三十四页，

16、共六十页。临床标本临床标本(biobn)培养基选择培养基选择 生殖道标本生殖道标本(biobn)根据临床医生所写的检验根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作项目接种相应的平板及操作： 淋球菌培养接种淋球菌平板淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接种念珠菌培养接种沙保罗培养基；支原体培养则按支原体培养的沙保罗培养基；支原体培养则按支原体培养的操作规程操作；作普通培养则接种血平板和巧操作规程操作；作普通培养则接种血平板和巧克力平板克力平板 第三十五页，共六十页。观察细菌在平板观察细菌在平板(pngbn)上的生长现上的生长现象象 血平板血平板：大小、形状、边缘：大小、形状、边缘(binyun

17、)、颜色、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 mac平板平板：大小、形状、颜色、透明度、：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度湿润度、黏度 巧克力平板巧克力平板：大小、形状、颜色、透明：大小、形状、颜色、透明度、湿润度、黏度度、湿润度、黏度第三十六页，共六十页。2022-4-1737 革兰阴性菌革兰阴性菌 葡萄球菌葡萄球菌(p to qi jn)第三十七页，共六十页。细菌细菌(xjn)的初步分类的初步分类 细菌的分离与纯化细菌的分离与纯化：自血平板挑出待检菌株自血平板挑出待检菌株的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应该的单菌落进行初步的鉴定。如果混有

18、杂菌，应该重新转种分纯。重新转种分纯。 染色与镜检染色与镜检： 首先通过革兰氏染色确定基本首先通过革兰氏染色确定基本(jbn)的分类：（的分类：（1）G+球菌（球菌（2）G-球菌（球菌（3）G-杆杆菌（菌（4）G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可能是真菌。第三十八页，共六十页。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(p to qi jn) 最重要最重要的致病葡萄球菌的致病葡萄球菌 血平板上菌落有明显血平板上菌落有明显溶血环溶血环，颜色呈金，颜色呈金黄色、灰白色或柠檬色黄色、灰白色或柠檬色

19、 分解分解葡萄糖葡萄糖、麦芽糖麦芽糖、蔗糖蔗糖和和甘露醇甘露醇 血浆血浆(xujing)凝固酶和凝固酶和DNA酶酶阳性阳性 第三十九页，共六十页。第四十页，共六十页。2022-4-1741葡萄球菌葡萄球菌(p to qi jn)第四十一页，共六十页。第四十二页，共六十页。第四十三页，共六十页。念珠菌显色念珠菌显色(xin s)培养基培养基 绿色绿色白色念珠菌白色念珠菌 蓝色蓝色热带念珠菌热带念珠菌 白色白色其他，细菌其他，细菌(xjn)被抑制被抑制 紫色紫色光滑光滑 粉色粉色克柔假丝酵母克柔假丝酵母菌菌第四十四页，共六十页。第四十五页，共六十页。第四十六页，共六十页。嗜血杆菌嗜血杆菌(gnjn

20、)的鉴定途径的鉴定途径 只能只能在营养条件高的在营养条件高的巧克力巧克力平板上生长，平板上生长，菌落为中等菌落为中等(zhngdng)大小、圆形大小、圆形、灰白色、灰白色、透明透明 革兰染色：革兰染色：G-小杆菌小杆菌 卫星实验卫星实验就可以帮助初步鉴定就可以帮助初步鉴定第四十七页，共六十页。2022-4-1748嗜血嗜血(sh xu)杆菌杆菌第四十八页，共六十页。奈瑟氏菌属鉴定奈瑟氏菌属鉴定(jindng) 在血平板和巧克力平板上生长，在血平板和巧克力平板上生长，mac上上不生长不生长 血平板形成血平板形成灰色、湿润、透明或半透明、灰色、湿润、透明或半透明、不溶血的菌落不溶血的菌落 巧克力平

21、板上形成巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露圆形、灰蓝色的似露滴状菌落滴状菌落 革兰染色：革兰染色： G-双球菌，呈肾形或咖啡豆双球菌，呈肾形或咖啡豆形，凹面相对形，凹面相对(xingdu) 氧化酶和触酶都均为氧化酶和触酶都均为阳性阳性第四十九页，共六十页。 奈瑟氏菌属有奈瑟氏菌属有11个种，临床个种，临床(ln chun)就就淋淋病奈病奈 菌菌和和脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌 最为重要最为重要第五十页，共六十页。奈瑟氏菌属鉴定奈瑟氏菌属鉴定(jindng)流程流程 菌落观察菌落观察：灰色：灰色(hus)、湿润、透明或半透明、不溶血、湿润、透明或半透明、不溶血 涂片染色涂片染色：G-双球菌，呈肾形或

22、咖啡豆状双球菌，呈肾形或咖啡豆状 氧化酶试验氧化酶试验+ 触酶触酶+ + 麦芽糖麦芽糖 - 脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌第五十一页，共六十页。细菌细菌(xjn)的鉴定与药敏的鉴定与药敏第五十二页，共六十页。卫生部重点卫生部重点(zhngdin)监控的监控的6种种MDRO MASA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌判断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁判断标准：对苯唑西林耐药或头孢西丁诱导实验阳性诱导实验阳性(yngxng)CRAB：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌：耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌判断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药判断标准：对亚胺培南或美罗培南耐药 VER：耐万古霉素

23、肠球菌：耐万古霉素肠球菌判断标准：对万古霉素耐药判断标准：对万古霉素耐药第五十三页，共六十页。 ESBLs：产超广谱：产超广谱内酰胺酶细菌。包括：内酰胺酶细菌。包括：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌等菌等 判断判断(pndun)标准：对第标准：对第3代和第代和第4代头孢菌代头孢菌素和氨曲南耐药素和氨曲南耐药 CRE:耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌 判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药药 MDR/XDROA:多重耐药多重耐药/泛耐药铜绿假单泛耐药铜绿假单胞菌胞菌 判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐判断标准：对亚胺培南等碳青霉烯类耐药药第五十四页，共六十页。临床临床(ln chun)常见问题常见问题 痰涂片与痰培养结果不一致？痰涂片与痰培养结果不一致？ 培养和涂片选择的痰液不同；标本采培养和涂片选择的痰液不同；标本采集时间过长，部分苛养菌死亡；集时间过长，部分苛养菌死亡； 选择药敏结果敏感选择药敏结果敏感(mngn)的药物，临床治疗的药物，临床治疗无效？无效？ 体外药敏试验只能预测体内治疗效果，体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药