细胞增殖活性及原位检测课件

1、细胞增殖活性及原位检测细胞增殖活性原位细胞增殖活性原位检测检测(jin c)技术及应用技术及应用重庆重庆(zhn qn)(zhn qn)医科大学病理教研室医科大学病理教研室 叶秀峰叶秀峰第一页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测细胞周期（细胞周期（Cell Cycle) 一、细胞周期概述一、细胞周期概述 概念概念(ginin)(ginin)：细胞周期是指连续分裂的细胞细胞周期是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程完成所经历的整个过程。 主要事件：遗传信息载体主要事件：遗传信息载体DNADNA复制，通过复制，通过有丝分裂将两

2、份拷贝有丝分裂将两份拷贝DNADNA平均分配到两个平均分配到两个子代细胞中子代细胞中第二页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 分期分期(fn q)：分为分为4 4个时期个时期 .即G1 S G2 M期期第三页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测( (一一)G)Gl l期期(Gap phase)(Gap phase) 是指从有丝分裂完成到是指从有丝分裂完成到DNADNA复制之前这一阶段，包复制之前这一阶段，包括括RNAsRNAs及蛋白的合成，所以又称复制前期或合成及蛋白的合成，所以又称复制前期或合成前期。这一时期细胞主要活动是为前期。这一时期细胞主要活动是为DNADNA的复制和蛋的复制和蛋白质

3、合成作准备，主要特点为：白质合成作准备，主要特点为： (1)(1)各种细胞的各种细胞的G G1 1期持续时间变化很大。这可期持续时间变化很大。这可能与细胞在此期增加质量有关。因此，连续能与细胞在此期增加质量有关。因此，连续增殖细胞的增殖率是受增殖细胞的增殖率是受G G1 1期细胞的平均期细胞的平均(pngjn)(pngjn)时间长度控制的，各种细胞群体之间细胞周时间长度控制的，各种细胞群体之间细胞周期的差异取决于期的差异取决于G G1 1期的长短。期的长短。 第四页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 (2)(2)此期发生了与此期发生了与DNADNA合成有关合成有关(yugun)(yugun)

4、的事件，主要是的事件，主要是RNARNA和蛋白质的合成。和蛋白质的合成。 (3)RNA(3)RNA合成发生于合成发生于G G1 1早期，同时早期，同时RNARNA聚合酶水平也迅速聚合酶水平也迅速增高。增高。 (4)G(4)G1 1早期合成结构蛋白和酶蛋白等，早期合成结构蛋白和酶蛋白等， G G1 1后期合成与后期合成与DNADNA复制有关的酶类，如胸苷激酶、脱氧核苷酸激复制有关的酶类，如胸苷激酶、脱氧核苷酸激酶等，其中酶等，其中DNADNA聚合酶活性在聚合酶活性在G G1 1末期至末期至S S初期增高最初期增高最快。快。 (5)(5)蛋白质磷酸化增加。组蛋白磷酸化增加使染色体解蛋白质磷酸化增加

5、。组蛋白磷酸化增加使染色体解旋，以利于旋，以利于DNADNA复制；非组蛋白磷酸化增加可能与基复制；非组蛋白磷酸化增加可能与基因的活化有关。因的活化有关。 (6)(6)染色体状态由凝集转变为解凝集，为染色体状态由凝集转变为解凝集，为DNADNA合成创造条件。合成创造条件。 (7)(7)细胞膜转运功能增强。细胞膜转运功能增强。第五页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测( (二二)S )S期期(synthesis phase)(synthesis phase) 即即DNADNA合成期或复制期，合成期或复制期，S S期主要是期主要是DNADNA合成合成( (自我复制自我复制) )、遗传物质从二倍体、遗

6、传物质从二倍体(2n)(2n)到四倍体到四倍体(4n)(4n)的整个过程。其中的整个过程。其中(qzhng)(qzhng)主要的生物化学改变是遗主要的生物化学改变是遗传物质的复制，即传物质的复制，即DNADNA的复制及组蛋白、非组的复制及组蛋白、非组蛋白等染色体蛋白的合成。蛋白等染色体蛋白的合成。由于每一条染色体复制成两条染色单体，在由于每一条染色体复制成两条染色单体，在S S期末，期末，DNADNA含量增加一倍。含量增加一倍。DNADNA的准确复制保证了分裂后子的准确复制保证了分裂后子细胞遗传物质的平均分配。细胞遗传物质的平均分配。DNADNA合成的同时，形成新的合成的同时，形成新的染色质的

7、另一重要成分组蛋白的合成也同时进行。染色质的另一重要成分组蛋白的合成也同时进行。第六页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 ( (三三)G2)G2期期(Gap 2 phase)(Gap 2 phase) 指指DNADNA复制完成到有丝分裂开始这段时复制完成到有丝分裂开始这段时间，这段时间内细胞有间，这段时间内细胞有2 2套二倍体染色体，套二倍体染色体，所以所以(suy)(suy)又称复制后期或合成后期。又称复制后期或合成后期。DNADNA复制完成后，细胞进入复制完成后，细胞进入G2G2期。处于此期的期。处于此期的细胞细胞DNADNA合成已终止，但仍然进行着合成已终止，但仍然进行着RNARNA和

8、一定的蛋白合成，为细胞有丝分裂作准和一定的蛋白合成，为细胞有丝分裂作准备。备。第七页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 ( (四四)M)M期期(mitosis phase)(mitosis phase) 即有丝分裂期，细胞在即有丝分裂期，细胞在MM期进行分裂。期进行分裂。MM期又分为前期又分为前期、前中期、中期、后期、末期。期、前中期、中期、后期、末期。MM期的末期一结束，期的末期一结束，就形成两个新的子细胞，一次细胞周期即告结束，细胞就形成两个新的子细胞，一次细胞周期即告结束，细胞就进入下一个细胞周期的就进入下一个细胞周期的G G1 1期。期。细胞有丝分裂是一个复杂的过程，必须在细胞有丝分

9、裂是一个复杂的过程，必须在DNADNA复制完成复制完成(wn chng)(wn chng)后，细胞才能进行有丝分裂。此期细胞呈球形，不后，细胞才能进行有丝分裂。此期细胞呈球形，不很牢固地附在它生长的基质上。染色体在此期凝聚后分开，很牢固地附在它生长的基质上。染色体在此期凝聚后分开，移向细胞两端，解聚并再形成两个完整的核，最后通过细移向细胞两端，解聚并再形成两个完整的核，最后通过细胞质分裂而结束胞质分裂而结束MM期。期。第八页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测第九页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 有丝分裂是一个核改组的连续过程有丝分裂是一个核改组的连续过程(guchng)，根据，根据形态

10、学特征可分为形态学特征可分为5个阶段：个阶段： 前期前期(prophase) 前中期前中期(early metaphase) 中期中期(metaphase) 后期后期(anphase)末期末期(telophase) 第十页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测1前期前期 这一期主要发生染色体凝集、分裂极的确定、核仁解体及这一期主要发生染色体凝集、分裂极的确定、核仁解体及核膜消失。核膜消失。2. 前中期前中期 主要变化是纺锤体的形成和染色体排列在赤道面上形主要变化是纺锤体的形成和染色体排列在赤道面上形成赤道板。成赤道板。3中期中期 从染色体排列到赤道面上到两条染色单体从染色体排列到赤道面上到两条染

11、色单体(子染色体子染色体)开开始趋向始趋向(qxing)两极，这段时期称为中期。两极，这段时期称为中期。 中期的染色体浓缩成典型形态，在赤道面上形成赤道板。中期的染色体浓缩成典型形态，在赤道面上形成赤道板。 第十一页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测4后期后期 后期是姐妹染色单体分开并移向两极的时期，后期是姐妹染色单体分开并移向两极的时期，当子染色体到达两极时，此期结束。当子染色体到达两极时，此期结束。 染色单体的分开通常由着丝点开始，即两个着染色单体的分开通常由着丝点开始，即两个着丝点先分开，然后两个染色单体的臂逐渐丝点先分开，然后两个染色单体的臂逐渐(zhjin)分分开，完全分开后就向两

12、极移动。开，完全分开后就向两极移动。 5末期末期 从子染色体到达两极后开始到形成两个子细胞这从子染色体到达两极后开始到形成两个子细胞这段时期称为末期，包括子核的形成与胞质分裂两个段时期称为末期，包括子核的形成与胞质分裂两个过程。过程。 第十二页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测二、细胞周期的控制点二、细胞周期的控制点 细胞周期能够顺利地发生、发展和完成，取决于三个重细胞周期能够顺利地发生、发展和完成，取决于三个重要的控制点要的控制点(control point)，即决定，即决定G1期发生的期发生的G1控制点，控制点，决定决定S期发生的期发生的S控制点和决定控制点和决定M期发生的期发生的M控制

13、点。每控制点。每一个控制点控制着细胞周期一定阶段的开始，但只有在一个控制点控制着细胞周期一定阶段的开始，但只有在细胞周期前一个阶段彻底完成以后才能发生。细胞周期前一个阶段彻底完成以后才能发生。 (一一) G1控制点控制点: 在在G1期，哺乳动物细胞的趋向有期，哺乳动物细胞的趋向有3种可能性：一些细胞种可能性：一些细胞进入进入S期，通过期，通过G2期及有丝分裂期，即进入增殖周期；期及有丝分裂期，即进入增殖周期；一些细胞离开细胞周期，处于静止期，又称一些细胞离开细胞周期，处于静止期，又称G0期，它期，它们在一定的条件刺激们在一定的条件刺激(tiojin cj)下可重新进入增殖周期；下可重新进入增殖

14、周期；第十三页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 还有一些细胞向分化方向发展，使细胞的功还有一些细胞向分化方向发展，使细胞的功 能向专一化，而分裂能力趋向减弱。能向专一化，而分裂能力趋向减弱。 在正常情况下多细胞的哺乳动物体内在正常情况下多细胞的哺乳动物体内(t ni)的部分细胞处的部分细胞处于非增殖状态的休止期于非增殖状态的休止期(Go期期)，只在一定条件下才进人，只在一定条件下才进人G1期。在期。在G1期的后期中存在一个类似于酵母周期中起期的后期中存在一个类似于酵母周期中起始点的限制点始点的限制点(restriction point，简称，简称R点点)，它在细，它在细胞的每一次分裂中具有

15、控制作用，故称为胞的每一次分裂中具有控制作用，故称为G1控制点，控制点，只有通过只有通过R点的细胞才能进入点的细胞才能进入S-G2-M期。期。 第十四页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 在通过在通过R点前必须合成点前必须合成(hchng)一种不稳定的蛋白质一种不稳定的蛋白质(p105 RB)，当它积累到一定量时才能通过，当它积累到一定量时才能通过R点而点而启动启动DNA合成合成(hchng)。因为一旦启动。因为一旦启动DNA合成合成(hchng)后就可通过后就可通过G2期而进入期而进入M期，所以期，所以R点是控制细点是控制细胞增殖的关键，由此出发，细胞可能有胞增殖的关键，由此出发，细胞可能

16、有3种不同的种不同的命运：命运： (1)继续增殖细胞。这些细胞在分裂完成之后，可以继续增殖细胞。这些细胞在分裂完成之后，可以超过超过R点继续向前发展，它们不断离开点继续向前发展，它们不断离开G1期，并通期，并通过细胞增殖周期中的各个不同时期完成细胞分裂。过细胞增殖周期中的各个不同时期完成细胞分裂。如骨髓干细胞，胃、肠上皮中的基底细胞等。如骨髓干细胞，胃、肠上皮中的基底细胞等。第十五页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 (2)暂时不增殖细胞。这类细胞在分裂完成后，暂暂时不增殖细胞。这类细胞在分裂完成后，暂时处于时处于G。期，并在。期，并在R点被阻留很长时间。在正常点被阻留很长时间。在正常情况下

17、，这类细胞不合成情况下，这类细胞不合成(hchng)DNA也不分裂，但也不分裂，但在一定条件下可再进入细胞周期而进行增殖。属在一定条件下可再进入细胞周期而进行增殖。属于这种类型的有肝细胞、哺乳动物的初级卵母细于这种类型的有肝细胞、哺乳动物的初级卵母细胞等。胞等。 (3)不增殖细胞。这类细胞可以由不增殖细胞。这类细胞可以由R点走向分化细胞，点走向分化细胞，并成为执行专门功能的终末分化细胞。如神经细并成为执行专门功能的终末分化细胞。如神经细胞、哺乳动物的成熟红细胞、皮肤上皮的角质细胞、哺乳动物的成熟红细胞、皮肤上皮的角质细胞等。胞等。第十六页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测(二二)S控制点控制

18、点 细胞在细胞在G1期完成后，细胞质中含有期完成后，细胞质中含有DNA复制的激复制的激活因子，叫活因子，叫S期激活因子期激活因子(S phase activator)。S期激期激活因子的量决定活因子的量决定Gl期完成和细胞进入期完成和细胞进入S期的速度。期的速度。 DNA复制完成后，细胞结束复制完成后，细胞结束S期进入期进入G2期，某期，某些细胞可停在些细胞可停在G2期，在适当的条件下进入期，在适当的条件下进入M期重新期重新分裂。分裂。(三三)M期控制点期控制点 细胞开始有丝分裂细胞开始有丝分裂(yu s fn li)时需要时需要M期激酶期激酶(M phase kinase)激活。激活。M期激

19、酶是由期激酶是由2个亚单位个亚单位第十七页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 组成，一个是催化亚单位组成，一个是催化亚单位p34；另一个是调节亚单位，；另一个是调节亚单位，它是一种细胞周期蛋白它是一种细胞周期蛋白(cyclin)，可以是周期蛋白，可以是周期蛋白A或或周期蛋白周期蛋白B，它们是在有丝分裂间期不断合成并积累，它们是在有丝分裂间期不断合成并积累的。的。 p34本身没有活性，当它与调节亚单位结合时，本身没有活性，当它与调节亚单位结合时，通过调节亚单位变构形成通过调节亚单位变构形成p34-cyclinA或或 p34-cyclinB二二聚体。二聚体中的聚体。二聚体中的p34蛋白丝氨酸与苏

20、氨酸残基去磷蛋白丝氨酸与苏氨酸残基去磷酸化，产生激酶活性位点，使细胞进入酸化，产生激酶活性位点，使细胞进入M期。在期。在M期期中，调节亚单位被破坏，使中，调节亚单位被破坏，使M期激酶失活，从而期激酶失活，从而(cng r)使分裂的两个子细胞分开，结束使分裂的两个子细胞分开，结束M期。期。第十八页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 第二节细胞周期的调控第二节细胞周期的调控 目前，人们已揭示了细胞周期的主要生物化学过程，目前，人们已揭示了细胞周期的主要生物化学过程，并获得了自酵母至人类普遍并获得了自酵母至人类普遍(pbin)适用的模式。适用的模式。 一细胞因子与相应的受体一细胞因子与相应的受体

21、细胞因子是一类能与特异的、高亲和性的细胞外基质、细胞因子是一类能与特异的、高亲和性的细胞外基质、可溶性受体及细胞膜上的受体结合，向细胞内传递信号，可溶性受体及细胞膜上的受体结合，向细胞内传递信号，刺激细胞增殖的多肽类物质。生长因子为一类促进细胞刺激细胞增殖的多肽类物质。生长因子为一类促进细胞生长的细胞因子。生长的细胞因子。 根据生长因子的靶细胞的不同，可根据生长因子的靶细胞的不同，可将其将其 第十九页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 分为两类：一类为具有广泛作用分为两类：一类为具有广泛作用(zuyng)的生长因子，如的生长因子，如表皮生长因子表皮生长因子(EGF)、血小板衍化生长因子、血小

22、板衍化生长因子(PDGF)、成、成纤维细胞生长因子纤维细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子、类胰岛素生长因子(IGF)和转和转化生长因子化生长因子(TGF-)等；另一类为细胞特异性生长因等；另一类为细胞特异性生长因子，如白细胞介素子，如白细胞介素2(IL-2)、神经生长因子、神经生长因子(NGF)、粒细、粒细胞集落刺激因子胞集落刺激因子(G-CSF)等。等。 正常情况下，哺乳动物体内的大部分细胞处于非增正常情况下，哺乳动物体内的大部分细胞处于非增殖状态的殖状态的G0期，此期细胞主要表达与细胞生长有关期，此期细胞主要表达与细胞生长有关的基因，但不合成与细胞周期调控体系有关的蛋白的基因，但不合

23、成与细胞周期调控体系有关的蛋白。细胞因子作用于细胞表面的各种相应的受体，受体细胞因子作用于细胞表面的各种相应的受体，受体多是增殖信号的跨膜传递者。这些受体都是糖蛋白，多是增殖信号的跨膜传递者。这些受体都是糖蛋白，和生长因子结和生长因子结第二十页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 合后产生变构，激活了蛋白激酶的活性，可使细胞内靶蛋白的酪氨酸发生磷酸化，进一步触发由细胞质到细胞核的一系列信号传递反应。核内调控蛋白接受从细胞质经一系列反应传来的增殖信号后，才能变构而被激活，与基因组中特定的调控序列发生相互作用，开动一组与细胞增殖调控有关的特定基因的转录，首先刺激fos、jun、myc等早期(zoq

24、)反应基因的表达，并在这些转录因子的作用下，激活周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶激活周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶 第二十一页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 的基因表达，合成与细胞周期调控体系有关的蛋白，的基因表达，合成与细胞周期调控体系有关的蛋白，调控细胞周期的进行。调控细胞周期的进行。 下面介绍几种主要的生长因子及受体下面介绍几种主要的生长因子及受体: (一一)表皮生长因子表皮生长因子 EGF是一种含有是一种含有53个氨基酸残基的多肽。个氨基酸残基的多肽。 EGF分子内有对维持其生物活性必需的分子内有对维持其生物活性必需的3个二硫键，个二硫键，当用巯基乙醇或尿素还原二硫键后，当用巯基乙醇或

25、尿素还原二硫键后，EGF活性就活性就会丧失。会丧失。EGF主要分布于人的尿液、乳汁和血浆主要分布于人的尿液、乳汁和血浆(xujing)中。作为一种作用很强的促细中。作为一种作用很强的促细 胞分裂因子，胞分裂因子，EGF能刺激多种组织细胞在体内和体能刺激多种组织细胞在体内和体外的分裂和增殖。外的分裂和增殖。EGF是通过位于细胞膜上的受体是通过位于细胞膜上的受体而发挥其生物学效应的。而发挥其生物学效应的。EGF受体受体 第二十二页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 (EGFR)是具有内在的酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，是具有内在的酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，EGFR的分布较广泛，来源于内、中、外三

26、个胚层的细的分布较广泛，来源于内、中、外三个胚层的细胞均有胞均有EGFR表达。表达。EGF与与EGFR结合后形成复合物，结合后形成复合物，通过细胞内吞进入细胞，在细胞内通过细胞内吞进入细胞，在细胞内EGF最终被溶酶体最终被溶酶体降解降解(jin ji)，EGFR在与在与EGF解离后被送回质膜表面重解离后被送回质膜表面重新利用新利用。 (二二)血小板衍化生长因子血小板衍化生长因子 血小板衍化生长因子血小板衍化生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)来源于血小板，由含二硫键的二聚体组成，来源于血小板，由含二硫键的二聚体组成，PDGF也是一种较也是一种较强的促

27、有丝分裂因子。强的促有丝分裂因子。 第二十三页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 PDGF以启动性生长因子的身份，刺激静止细以启动性生长因子的身份，刺激静止细胞进入对推进因子敏感的状态，离开胞进入对推进因子敏感的状态，离开G0期进入生期进入生长周期。反转录病毒的转化基因长周期。反转录病毒的转化基因v-sis的产物的产物P28V-sis蛋白质氨基酸的顺序蛋白质氨基酸的顺序(shnx)与与PDGF的的链同源，这链同源，这说明癌基因可能通过编码生长因子参与细胞增殖调控。说明癌基因可能通过编码生长因子参与细胞增殖调控。 PDGF也是通过与细胞表面的特异性受体结合发挥作也是通过与细胞表面的特异性受体结

28、合发挥作用的。用的。PDGF受体受体(PDGFR)是具有酪氨酸激酶活性的是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，通过与跨膜糖蛋白，通过与PDGF结合被活化，发挥多种生结合被活化，发挥多种生理活性。理活性。第二十四页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测(三三)转化转化(zhunhu)生长因子生长因子转化生长因子转化生长因子(transforming growth factor，FGF)是一组是一组诱导非瘤细胞表达转化表型的多肽类物质。诱导非瘤细胞表达转化表型的多肽类物质。FGF中最中最主要的有主要的有TGF-和和TGF-两大类。两大类。 TGF-在结构上与在结构上与EGF相关，生物学特性非常相似。相关

29、，生物学特性非常相似。TGF- 和和EGF都能与都能与EGFR结合，结合后均可活化结合，结合后均可活化EGFR的蛋白激酶活性并的蛋白激酶活性并诱导受体对信号传导链下游的调节作用。诱导受体对信号传导链下游的调节作用。TGF-不与不与EGFR结合，其受体是含二硫键的糖基化复结合，其受体是含二硫键的糖基化复合物。合物。 TGF-的转化活性需的转化活性需EGF或或TGF- 的协同。的协同。 TGF-对于各种肿瘤细胞。对于各种肿瘤细胞。第二十五页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 如上皮细胞、胚胎成纤维细胞及大鼠的原代培养如上皮细胞、胚胎成纤维细胞及大鼠的原代培养均为一种抑制增殖作用。因此，均为一种抑

30、制增殖作用。因此，TGF- 可能主要可能主要是参与抑制细胞增殖。对细胞生长起负调节作用。是参与抑制细胞增殖。对细胞生长起负调节作用。 (四四)抑抑 素素 抑素抑素(chalone)是与生长因子是与生长因子(ynz)作用相反的、具有作用相反的、具有组织特异性的内源性、生理性生长抑制因子组织特异性的内源性、生理性生长抑制因子(ynz)，其，其作用有组织或细胞特异性，而无种属特异性。对细胞作用有组织或细胞特异性，而无种属特异性。对细胞无毒性，仅使细胞增殖阻滞于细胞周期某一时相，作无毒性，仅使细胞增殖阻滞于细胞周期某一时相，作用消失后，细胞增殖可被逆转。用消失后，细胞增殖可被逆转。第二十六页，共七十四

31、页。细胞增殖活性及原位检测 抑素是肽类、蛋白质或与糖结合的复合体，水溶抑素是肽类、蛋白质或与糖结合的复合体，水溶性，存在于组织细胞和血清内。性，存在于组织细胞和血清内。 目前确定的抑素有表皮细胞抑素、肝细胞抑素、红细胞目前确定的抑素有表皮细胞抑素、肝细胞抑素、红细胞抑素、中性粒细胞抑素、淋巴细抑素、中性粒细胞抑素、淋巴细 胞抑素等。各种抑素的分子量和理化性质不同，胞抑素等。各种抑素的分子量和理化性质不同，其分子水平的作用尚不清楚。目前认为其分子水平的作用尚不清楚。目前认为 抑素主要作用于抑素主要作用于G1S期，阻止细胞进入期，阻止细胞进入S期的称为期的称为(chn wi)G1抑素或抑素或S因子

32、，阻止细胞进入因子，阻止细胞进入M期的称为期的称为G2抑抑素或素或M因子。因子。第二十七页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测二、周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶对二、周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶对细胞周期的调控细胞周期的调控(一一)周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶 过去人们一直认为细胞周期受核的控制，细胞过去人们一直认为细胞周期受核的控制，细胞质的活动是被动的。但研究发现，细胞质中存在质的活动是被动的。但研究发现，细胞质中存在有调节细胞周期的因子，其活动不完全受细胞核有调节细胞周期的因子，其活动不完全受细胞核的控制，这种因子被称为有丝分裂促进的控制，这种因子被称为有丝分裂

33、促进(cjn)因子因子(mitosis promoting factor，MPF)。 MPF由两种蛋白分子组成，一种是由两种蛋白分子组成，一种是“周期蛋周期蛋白白”(cyclin)，另一组分是具有蛋白激酶活性的，另一组分是具有蛋白激酶活性的 催化亚单位，催化亚单位，由于此激酶的活性依赖于和周期由于此激酶的活性依赖于和周期 第二十八页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 蛋白结合，又称为周期蛋白依赖性蛋白激酶蛋白结合，又称为周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependent kinase，CDK)。 已发现的周期蛋白有已发现的周期蛋白有10多种，如酵母细胞中的多种，如酵母细胞中的Clnl、C

34、ln2、Cln3及哺乳动物细胞中的及哺乳动物细胞中的Cyclin A、B、C、D、E、F、H等。依据它们在细胞周期等。依据它们在细胞周期中调控阶段的不同中调控阶段的不同(b tn)分别归人分别归人G1期周期素和期周期素和M期周期蛋白。期周期蛋白。在周期蛋白分子中都含有一段高度在周期蛋白分子中都含有一段高度保守的氨基酸序列，它是与保守的氨基酸序列，它是与CDK互相结合的关键区，互相结合的关键区，称称“ “周期蛋白盒周期蛋白盒” ”(cyclin box)。周期蛋白周期性地合成、。周期蛋白周期性地合成、与与CDK结合、降解，起到了对细胞周期的调节作用。结合、降解，起到了对细胞周期的调节作用。 第二

35、十九页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测CDK是具有蛋白激酶活性的催化亚单位。目前已发现6种CDK。CDK与细胞分裂周期(cell division cycle，cdc)基因(jyn)cdc2编码产物p34cdc具有同源性。与周期蛋白结合的p34cdc的活性还受其他某些特异性的激酶和磷酸酶的调控。包括Cdc2(CDKl)、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5和CDK6，它们分别对细胞G1-S期和G2-M期的过渡进行调控。第三十页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 当细胞进入当细胞进入G2期后，期后，M期期cyclin逐渐增加，并与逐渐增加，并与CDK形成无活性形成无活性MPF复合物，在其

36、他激酶和磷复合物，在其他激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用下，转变为酸酶的磷酸化和去磷酸化作用下，转变为MPF。通过通过MPF对这两类酶的正反馈调节作用，不断加对这两类酶的正反馈调节作用，不断加速速MPF的产生。当的产生。当MPF增加到相当高的浓度时就增加到相当高的浓度时就引发一系列变化。引发一系列变化。 (二二)细胞周期蛋白细胞周期蛋白(dnbi)对细胞周期的调控对细胞周期的调控1.G1期周期蛋白期周期蛋白 正常情况下，哺乳动物体内细胞的正常情况下，哺乳动物体内细胞的G1期后期期后期具有一个控制样的限制点，称为具有一个控制样的限制点，称为G1控制点。控制点。 人类细胞在人类细胞在G-期表达期

37、表达3种周期蛋白：种周期蛋白： 第三十一页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 Cyclin C、D和和E。处于。处于Go期的细胞受生长因子刺激期的细胞受生长因子刺激后，首先表达后，首先表达C、D型周期蛋白，再表达型周期蛋白，再表达E型周期蛋型周期蛋白，然后进入白，然后进入DNA合成期。合成期。 Cyclin C的水平在的水平在G0期稍有增加期稍有增加(zngji)，在细胞周，在细胞周期的其他时期内波动很小。期的其他时期内波动很小。 Cyclin D在不断增殖的细胞中的水平波动不明在不断增殖的细胞中的水平波动不明显。显。 Cyclin D的表达对生长因子有明显的依赖性。的表达对生长因子有明显的

38、依赖性。在在G0早期，早期，D型周期素开始表达，并与型周期素开始表达，并与CDK4为主为主的数种激酶结合，在细胞由的数种激酶结合，在细胞由Go期进入期进入Gl的过程中起的过程中起重要作用。如果抑制重要作用。如果抑制Cyclin D在在G0期的表达，细胞将不能进入期的表达，细胞将不能进入s期。期。 第三十二页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 Cyclin E的表达时间比的表达时间比Cyclin D晚，在细胞内呈周期性晚，在细胞内呈周期性表达，峰值在表达，峰值在G1-S过渡点，在控制过渡点，在控制(kngzh)细胞由细胞由G1期进人期进人S期起限速作用。当人类期起限速作用。当人类Cyclin

39、E在人包皮成纤维细胞中在人包皮成纤维细胞中稳定地过渡表达时，可以缩短被转染细胞的稳定地过渡表达时，可以缩短被转染细胞的G1间期，细间期，细胞在较小的状态通过胞在较小的状态通过G1-S期过渡点，并可减少由期过渡点，并可减少由G1向向S期过渡时血清的需要量，而期过渡时血清的需要量，而Cyclin E在周期中产生的在周期中产生的时间并未改变；但是，由于细胞提前进入时间并未改变；但是，由于细胞提前进入S期，影响了期，影响了为复制为复制DNA所需要的因子的积累，缩短的所需要的因子的积累，缩短的G1期的时间期的时间由延长由延长s期和期和G2期得以补差平衡。由此可见，期得以补差平衡。由此可见，Cyclin

40、E的合成程度是细胞的合成程度是细胞G1-S过渡的限制因素。过渡的限制因素。第三十三页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测2S期和期和M期的周期蛋白期的周期蛋白 (1)Cyclin A和和Cyclin B。Cyclin A的合成的合成(hchng)早早于于Cyclin B，它的合成，它的合成(hchng)起始接近于起始接近于Gl-S期过期过渡点，并在间期就进入细胞核内。破坏渡点，并在间期就进入细胞核内。破坏Cyclin A的功能将抑制染色体的复制。的功能将抑制染色体的复制。CyclinB的合成的合成(hchng)起始于起始于S期，在期，在G2-M期过渡中逐渐增加，直至有丝分期过渡中逐渐增加，直至

41、有丝分裂中期和后期之间发生骤然降解。裂中期和后期之间发生骤然降解。而且，而且，Cyclin B在核在核膜破裂前才进入细胞核内。膜破裂前才进入细胞核内。Cyclin A和和Cyclin B分别与分别与CDK2和和CDKl相结合，使细胞从相结合，使细胞从G2期进入期进入M期。期。 第三十四页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 (2)Cyclin H。Cyclin H与一种与与一种与CDK相关的激酶相关的激酶M01 5相结合，相结合，M015-Cyclin H复合物能增强复合物能增强CDK2-Cyclin A的激酶活性。因此，与其他已知的的激酶活性。因此，与其他已知的CDKCyclin复复合物不同

42、，合物不同，MOl5一一Cyclin H复合物不是细胞周期次级复合物不是细胞周期次级反应中的有关成分，而是中心调控体系本身，提示细反应中的有关成分，而是中心调控体系本身，提示细胞周期中心调控机制胞周期中心调控机制(jzh)中存在中存在CyclinCDK的级联的级联反应。反应。第三十五页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测第三十六页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测第三十七页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测第三十八页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 第三节第三节 细胞增殖与肿瘤细胞增殖与肿瘤 人类肿瘤的发生与癌基因激活和抑癌基人类肿瘤的发生与癌基因激活和抑癌基因失活有关。目前发现，癌基

43、因和抑癌基因因失活有关。目前发现，癌基因和抑癌基因作用的归结点在于对细胞周期的调控。作用的归结点在于对细胞周期的调控。 肿瘤细胞周期的调控多表现为起正调控肿瘤细胞周期的调控多表现为起正调控作用的作用的CyclinCyclin过度表达，而发挥过度表达，而发挥(fhu)(fhu)负调控负调控作用的抑制因子作用的抑制因子CKICKI却常常失活。如在多数恶却常常失活。如在多数恶性肿瘤中都有性肿瘤中都有Cyclin D Cyclin D 的过度表达或的过度表达或/ /和和P21P21、P27P27低表达。低表达。 细胞周期的监测点异常也可能导致细胞周期细胞周期的监测点异常也可能导致细胞周期紊乱而癌变。特

44、别是约半数以上恶性肿瘤中紊乱而癌变。特别是约半数以上恶性肿瘤中有分子警察有分子警察P53P53的突变。的突变。 第三十九页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 第四节第四节 细胞增殖常用的检查方法细胞增殖常用的检查方法 1.1.细胞核分裂计数细胞核分裂计数 核分裂象是细胞周期中惟一可以用形态学方法识别的时核分裂象是细胞周期中惟一可以用形态学方法识别的时期期(shq)，在普通光学显微镜下即能够进行。，在普通光学显微镜下即能够进行。Baak提出核提出核分裂的识别标准的为：核膜消失；在核分裂中央缺乏透分裂的识别标准的为：核膜消失；在核分裂中央缺乏透明区；核分裂象两侧或外周可见毛发样突起；胞浆嗜碱明区

45、；核分裂象两侧或外周可见毛发样突起；胞浆嗜碱性。性。核分裂计数有高倍视野法核分裂计数有高倍视野法(high power fields，HPF)和核分和核分裂指数法裂指数法(mitotic index，MI)。 第四十页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 高倍视野法高倍视野法 在高倍在高倍(400)下，随机选下，随机选择多个视野择多个视野(10)，分别观察并计数其中，分别观察并计数其中(qzhng)的核分裂象，然后计算出每个的核分裂象，然后计算出每个HPF中中核分裂象的平均值。由于不同型号的显微核分裂象的平均值。由于不同型号的显微镜镜HPF的面积太小可能存在一定差异，且的面积太小可能存在一定差

46、异，且所测细胞的大小不同，单位面积内的细胞所测细胞的大小不同，单位面积内的细胞数亦不相同，该方法存在结果可比性和重数亦不相同，该方法存在结果可比性和重复性较差的问题。复性较差的问题。第四十一页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 核分裂指数法核分裂指数法:在目镜上加一单线状标尺，在目镜上加一单线状标尺，计数高倍计数高倍(400)视野下与标尺相交的细胞数视野下与标尺相交的细胞数(n)，该视野内细胞总数，该视野内细胞总数A=(n2)2。计数。计数10个高倍视野，其中个高倍视野，其中(qzhng)第第1、5、10视野按上述视野按上述公式计算，公式计算，3个视野细胞数之和除以个视野细胞数之和除以3，乘

47、以，乘以10，则为，则为10个视野的细胞总数。以个视野的细胞总数。以10个高倍个高倍视野的核分裂象数除以细胞总数，求得视野的核分裂象数除以细胞总数，求得MI值。值。 第四十二页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测第四十三页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测第四十四页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测第四十五页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测在不同肿瘤中，核分裂数多少的意义在不同肿瘤中，核分裂数多少的意义(yy)是不一样的。如：是不一样的。如：胃肠道平滑肌肿瘤：胃肠道平滑肌肿瘤： 5/10HPF5/10HPF；良性或潜在恶性；良性或潜在恶性 5/10HPF5/10HPF：恶性：恶性 子宫

48、平滑肌肿瘤：子宫平滑肌肿瘤：10/10HPF+10/10HPF+异型性异型性+ +肿瘤性坏死：恶性肿瘤性坏死：恶性 10/10HPF10/10HPF、无异型性、无坏死：潜在恶性、无异型性、无坏死：潜在恶性 胃肠道间质瘤：胃肠道间质瘤： 5/50HPF+5/50HPF+肿瘤肿瘤5cm5cm：恶性：恶性第四十六页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 2.DNA2.DNA合成情况的检测合成情况的检测(jin c)(jin c) 直接反映处于直接反映处于S S期细胞的多少。期细胞的多少。 可通过测定标记的可通过测定标记的DNADNA前体物质，如前体物质，如3 3H-H-去去氧胸腺嘧啶核苷，或核苷酸类似

49、物质氧胸腺嘧啶核苷，或核苷酸类似物质5-5-溴溴-2-2脱氧尿苷（脱氧尿苷（Bromodeoxyoridine,BrdU),Bromodeoxyoridine,BrdU),应用放射自显影、免疫组化或闪烁测定仪、应用放射自显影、免疫组化或闪烁测定仪、流式细胞仪定性或定量测定标记的细胞术。流式细胞仪定性或定量测定标记的细胞术。第四十七页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 3H标记胸腺嘧啶标记胸腺嘧啶(m dn)脱氧核苷掺人标记技术脱氧核苷掺人标记技术 3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺人标记技术标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺人标记技术(thymidine labeling, 3H -TdR)由由Johnson等

50、于等于1961年首次建立，是显示年首次建立，是显示s期细胞的经典方法。用活细胞期细胞的经典方法。用活细胞或新鲜组织与或新鲜组织与3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷孵育标记胸腺嘧啶脱氧核苷孵育12h，有，有DNA合成能力的合成能力的s期细胞将摄人期细胞将摄人3HTdR合成新的合成新的DNA，通过放射自显影显示，可在显微镜下直接辨认通过放射自显影显示，可在显微镜下直接辨认s期细胞，期细胞，计数全部细胞中计数全部细胞中s期细胞的百分率作为胸腺嘧啶脱氧核苷期细胞的百分率作为胸腺嘧啶脱氧核苷标记指数标记指数(thymidine labeling index，TLI)表示增殖活性。表示增殖活性。第四十八页，共七十四

51、页。细胞增殖活性及原位检测 操作步骤操作步骤 a.剪碎的无菌新鲜组织或体外培养细胞加入培养基和剪碎的无菌新鲜组织或体外培养细胞加入培养基和3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷，在标记胸腺嘧啶脱氧核苷，在 37的的CO2培养箱中培养培养箱中培养2h； b集组织和细胞，集组织和细胞，PBS清洗后，清洗后，10福尔马林固定，福尔马林固定，常规石蜡包埋切片；常规石蜡包埋切片； c.室内将脱蜡水化后的切片浸人感光乳胶室内将脱蜡水化后的切片浸人感光乳胶(rjio)，然后在，然后在4的暗盒内曝光的暗盒内曝光3天；天； d.在暗室内放射自显影的切片在显影液中显影，在暗室内放射自显影的切片在显影液中显影，然后在定影液中定影

52、；然后在定影液中定影； e.切片经苏木素伊红染色；切片经苏木素伊红染色； f.计数计数20005000个细胞，计算阳性细胞的百分率，个细胞，计算阳性细胞的百分率，求得求得TLI。第四十九页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 应用应用: 3H -TdR标记技术自建立以来，已得到广标记技术自建立以来，已得到广泛应用。泛应用。Iinden研究证实高研究证实高TLI与乳腺癌与乳腺癌术后早期复发、病理术后早期复发、病理(bngl)分型及临床亚型分型及临床亚型有关，与其他预后指标相比，有关，与其他预后指标相比，TLI是最有是最有价值的。价值的。 存在的问题存在的问题: TLI只显示只显示s期细胞数量，而

53、未显示期细胞数量，而未显示s期长期长短，因而可能出现细胞增殖速度慢而短，因而可能出现细胞增殖速度慢而TLI增高的情况增高的情况 第五十页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 由于肿瘤生长的异质性，对肿瘤组织取材由于肿瘤生长的异质性，对肿瘤组织取材的代表性不够亦会造成结果偏差；观察者的代表性不够亦会造成结果偏差；观察者的经验、计数细胞的多少、组织的新鲜程的经验、计数细胞的多少、组织的新鲜程度以及放射性同位素的活性均可影响结果度以及放射性同位素的活性均可影响结果的可靠性；需要新鲜组织及放射性同位素的可靠性；需要新鲜组织及放射性同位素是是TLI应用受限的主要应用受限的主要(zhyo)原因。原因。第五

54、十一页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术 溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术溴脱氧尿嘧啶核苷标记技术(5-bromodeoyuridine，Brdu)由于由于3H -TdR标记技标记技术需要同位素，推广受限。术需要同位素，推广受限。5一溴脱氧尿嘧啶一溴脱氧尿嘧啶核苷核苷(5一一bromodeoyuridine，Brdu)是胸腺嘧啶是胸腺嘧啶核苷的相似物，像胸腺嘧啶脱氧核苷一样可掺核苷的相似物，像胸腺嘧啶脱氧核苷一样可掺人到细胞人到细胞(xbo)合成的合成的DNA中，掺人到细胞中，掺人到细胞(xbo)DNA的的Brdu可通过抗可通过抗5一一Brdu单克隆

55、抗体单克隆抗体在组织切片和细胞在组织切片和细胞(xbo)爬片上显示或通过爬片上显示或通过FCM检测检测s期细胞期细胞(xbo)。第五十二页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测操作步骤操作步骤 a.剪成剪成0 .5mm3大小的无菌新鲜组织或体外培养细胞加入含大小的无菌新鲜组织或体外培养细胞加入含Brdu的的培养基，在培养基，在37的的CO2培养箱中培养培养箱中培养2h； 2.集组织和细胞，用集组织和细胞，用PBS清洗后，清洗后，70乙醇固定，常规石蜡包埋乙醇固定，常规石蜡包埋切片；切片； c.切片脱蜡水化，切片脱蜡水化，3H202阻断内源性过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶20min，蒸馏水，蒸馏水

56、洗；洗； d.0. 1N NaCl于于4处理处理5min，再用，再用90的甲酰胺水溶液的甲酰胺水溶液58孵育孵育30min，以变性，以变性DNA； e. 4预冷的预冷的PBS清洗清洗2min，以停止，以停止DNA变性；变性； f.利用抗利用抗Brdu抗体，按免疫组织化学方法染色；抗体，按免疫组织化学方法染色； g.苏木素衬染；苏木素衬染； h.计数计数20005000个细胞，计算阳性细胞的百分率，求得标记个细胞，计算阳性细胞的百分率，求得标记(bioj)指数指数LI。第五十三页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 应用应用 1982年，年，Gratzner等首先利用抗等首先利用抗5-Brdu和

57、抗和抗5一碘一碘脱氧尿啼啶核苷单克隆抗体显示脱氧尿啼啶核苷单克隆抗体显示DNA复制，与用复制，与用3H -TdR标记法所获结果一致。随后该方法得到广泛应标记法所获结果一致。随后该方法得到广泛应用，获得满意结果，认为此法能对细胞周期进行迅用，获得满意结果，认为此法能对细胞周期进行迅速而稳定的测量。速而稳定的测量。 存在的问题存在的问题 Brdu标记技术虽然不用标记技术虽然不用(byng)放射性同位素，但仍放射性同位素，但仍需要新鲜组织；组织或细胞的离体时间、需要新鲜组织；组织或细胞的离体时间、Brdu浓度浓度是影响结果的重要参数。离体时间超过是影响结果的重要参数。离体时间超过15min将严将严重

58、影响结果的可靠性。重影响结果的可靠性。第五十四页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 3.3.细胞核仁组成区嗜银相关蛋白（细胞核仁组成区嗜银相关蛋白（AgNOR)AgNOR) 概述：概述： 核仁组成区核仁组成区（Nucleolus organizer region,NORs)Nucleolus organizer region,NORs)位于核位于核仁仁rDNArDNA袢，由袢，由rDNArDNA、rRNArRNA组蛋白、非组蛋白等组成。参与蛋组蛋白、非组蛋白等组成。参与蛋白质、核糖体合成及核仁组成。白质、核糖体合成及核仁组成。NORsNORs的酸性非组蛋白又称为的酸性非组蛋白又称为核仁组成区

59、相关蛋白，能与核仁组成区相关蛋白，能与AgAg结合结合(jih)(jih)并被还原为氧化银并被还原为氧化银沉淀，故称为核仁组成区嗜银相关蛋白（沉淀，故称为核仁组成区嗜银相关蛋白（AgNOR)AgNOR)。常用明胶液和硝酸银等作为染色剂。可用在石蜡切片或细胞涂常用明胶液和硝酸银等作为染色剂。可用在石蜡切片或细胞涂片中，应用广泛。是常用的检测细胞增殖活性方法。片中，应用广泛。是常用的检测细胞增殖活性方法。第五十五页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测 细胞核内细胞核内AgNORAgNOR数目反映：数目反映： 核仁内核仁内rDNArDNA的转录活性水平；在染色体组中的转录活性水平；在染色体组中NOR

60、NOR染色体染色体的数目，及细胞分裂周期中所处的阶段。的数目，及细胞分裂周期中所处的阶段。 组织切片中组织切片中AgNORAgNOR平均计数平均计数(j sh)(j sh)增加的原因：增加的原因： （1 1）细胞增殖活跃，以致细胞核内核仁分解，）细胞增殖活跃，以致细胞核内核仁分解， AgNORAgNOR分散于细胞核中分散于细胞核中 （2 2）核仁融合缺陷，使）核仁融合缺陷，使AgNORAgNOR分散分散 （3 3）细胞的染色体倍体数增加）细胞的染色体倍体数增加 （4 4） rDNArDNA转录活性增加转录活性增加第五十六页，共七十四页。细胞增殖活性及原位检测染色方法染色方法 NORs的染色方法