第五章-紫外可见分光光度法

1、电位分析法原理和特点：灵敏度高（10-4-10-8）mol/L,10-10-10-12mol/L极谱法和伏安法 半电池表示为：MMn+Nernst方程的书写2 指示电极和参比电极指示电极：电极电位随着溶液中待测组分活度的改变而改变。（电极和离子选择性电极）参比电极：电极电位不受溶液组成的影响而保持恒定。(甘电极和银-氯化银电极）4 直接电位法 ：标准曲线法和标准加入法5 电位滴定法：以电位法指示滴定终点的滴定分析法。6 磺胺类的非水溶液滴定 溶剂、滴定剂（亚硝酸钠滴定法）2005版、2010版药典典型：磺胺嘧啶钠注射液、磺胺嘧啶银乳膏等第五章紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and

2、 Visible Spectrophotometry, UV-Vis)5.1 光谱分析概论5.2 紫外-可见吸收光谱5.3 光吸收定律5.4 紫外-可见分光光度计5.5 紫外-可见分光光度分析的实验条件5.6 紫外-可见分光光度分析的应用5.7 荧光光谱分析法简介5.1光谱分析概论5.1.1 电磁波谱和物质的能级跃迁1.光的本质: 电磁辐射，具有波动及粒子的双重属性。Ø 波动性：表现为光在中的折射、衍射、等现象。Ø 粒子性：表现为光压效应和光电效应等。2.光能量与光频率(波长)的关系-普朗克（Planck）定律:E = hn = h clE-光能量(J或eV, 1J=6.2

3、41×1018eV)-光频率（Hz）, -光波长（m）c-光速(真空中为2.998×108 m·s-1 )h-普朗克常数（6.626×10-34 J·s）。3.电磁波谱ØØ按波长或频率大小顺序排列的电磁辐射称为电磁波谱。物质与电磁辐射相互作用发生核能级、电子能级、级、电子和核自旋能级等多种类型的能级跃迁。振动和转动能Ø仪器分析中应用最多的是光学光谱区（紫外光区、可见光区、红外光区）。电磁辐射波长能量/eV能级跃迁类型射线区< 0.005 nm> 2.5×105核能级X射线区0.00510 nm

4、2.5×1051.2×102内层电子远紫外光区10200 nm1.2×1026.2内层电子近紫外光区200400 nm6.23.1外层电子可见光区400750 nm3.11.6外层电子近红外光区0.752.5 m1.60.50振动中红外光区2.550 m0.502.5×10-2振动远红外光区501000 m2.5×10-21.2×10-3转动微波区1300 mm1.2×10-34.1×10-6转动无线电波区> 300 mm< 4.1×10-6电子和核自旋5.1.2物质光谱的分类1. 按光辐射与

5、物质相互作用Ø 吸收光谱（absorption spectrum）光辐射与物质作用，光辐射能量恰好等于物质粒子运动两个量子化能级间能量差，物质选择性吸收光辐射而产生吸收光谱。Ø 发射光谱（emission spectrum）物质被热、光、化学能等能量激发跃迁成为不稳定的激发态原子或，再由激发态能级跃迁到低能级，多余能量以光辐射的形式而产生发射光谱。Ø散射光谱光辐射到物质上会发生光散射，散射光中除含有与入射光波长相同的成分，还有不同于入射光波长的新波长成分。包括：u 瑞利散射光谱（Rayleigh scattering spectrum）由与入射光波长相同的散射光形

6、成，此散射不引起分子内能变化。u 拉曼散射光谱（Raman scattering spectrum）由对称分布在入射光波长两侧的长、短波长的散射光形成，是因入射光与相互作用，使的转动能级及振动能级发生变化，导致散射光的波长改变，这种改变随不同的结构而异。2.按产生光谱的微观粒子类别Ø 原子光谱:物质的原子（离子）与光辐射作用，或原子（离子）受能量激发后由电子能级跃迁所产生的光谱称为原子光谱, 光谱的形貌特征是一组狭窄谱线间隔排列的线状光谱。可分为：u 原子发射光谱（atomicu 原子吸收光谱（atomicu 原子荧光光谱（atomicemission spectrum）absorp

7、tion spectrum）fluorescence spectrum）Ø光谱:物质与光辐射作用或受激发后， 由的价电子能级、子间振动能级、内原整体转动能级跃迁所产生的光谱称为光谱， 光谱形貌表现为带状光谱。右图为中电子能级、振动能级和转动能级示意图。u 紫外- 可见吸收光谱（ ultraviolet andabsorption spectrum）：visible用200780nm的紫外、可见光照射，在的电子能级发生跃迁的同时，伴随的振动和转动能级跃迁，产生的紫外-可见吸收光谱。u 红外吸收光谱（infrared absorption spectrum）：用0.7550 mm的红外光

8、照射，在使的振动能级发生跃迁的同时，伴随子的红外吸收光谱。振动能级的跃迁，产生分5.1.3 光谱分析法的分类常按照与光辐射作用的物质微观粒子，结合产生的光谱类型进行分类，一些常见的光谱分析方法如下表：分析方法光谱类型主要用途原子发射光谱法原子光谱无机元素定性、定量原子吸收光谱法金属元素定量原子荧光光谱法无机元素定量射线荧光光谱法无机元素定性、定量荧光光谱法光谱无机和有机物定性、定量磷光光谱法无机和有机物定性、定量化学发光分析法无机和有机物定量紫外-可见吸收光谱法无机和有机物定性、定量红外吸收光谱法有机物结构、定量拉曼散射光谱法有机物结构5.2紫外-可见吸收光谱发展简史：目视比色法：用比色管通过

9、肉眼比较颜色深浅估测物质浓度（源于18世纪）。光电比色法：用光电比色计（由光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计构成）定量测定物质浓度（20世纪40年代前）。紫外-可见分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry, UV-Vis）又称紫外-可见吸收光谱法（ ultraviolet and visible absorption spectrometry）： 用紫外-可见分光光度计对物质定性及定量分析（20世纪40年代后至今)。ØØØ方法特点和应用：Ø 灵敏度高（检测下限可达10-4-10-6mol·

10、;L-1）。Ø 准确度高（相对误差2%5%）。Ø 稳定性好。Ø 仪器设备相对较为简单、易于普及。Ø 用于无机、有机及生化物质的微量组份定量分析。Ø 测定配合物组成及稳定常数、弱酸解离常数、化学反应速率常数、催化反应活化能等。Ø 根据的紫外光谱判断有机化合物的空间构型，确定结构。5.2.1吸收曲线1.溶液颜色与光吸收的关系Ø 单色光：单一波长（颜色）的光。Ø 白光：由不同波长（颜色）可见光按一定比例混合而成的复合光Ø 互补光：按一定比例混合能得到白光的两种特定波长的可见光。Ø 用白光照射溶液：u

11、若溶液对各种波长的光都不吸收，则溶液透明无色。u 若溶液对各种波长的光全部吸收，则溶液呈黑色。u 若溶液吸收了白光中的某一部分波长的光，则溶液呈现被吸收波长光的互补光颜色（如：CuSO4溶液吸收白光中的黄色光而呈现与黄色互补的；KMnO4溶液吸收白光中的绿色光而呈现与绿色互补的紫红色）。Ø 可见光范围内的互补色关系吸收光颜色吸收光波长/ nm物质颜色紫400450黄绿蓝450480黄绿蓝480490橙蓝绿490500红绿500560红紫黄绿560580紫黄580610蓝橙610650绿蓝红650750蓝绿2. 吸收曲线（absorption spectrum ）测量物质对不同波长光的

12、吸收程度， 以波长为横坐标、透过光强T（或吸光度）为纵坐标，绘制的-T（或-）曲线，又称吸收光谱。Ø光吸收程度最大处的波长叫做最大吸收波长lmax。不同物质其吸收曲线不同，是物质定性分析的依据。同一物质不同浓度的溶液所得的吸收曲线都相似，其最大吸收波长不变，只是相应的吸收程度不同，浓度越大，吸收越强。ØØ5.2.2有机化合物吸收光谱与结构关系1.有机化合物的电子能级跃迁类型有机化合物吸收紫外-可见光后，其外层电子（、n电子）发生*、*、n*、n* 4类跃迁，产生紫外-可见吸收光谱。各跃迁所需能量大小为En* <E * < En* <E*。右图表示

13、了级跃迁过程。的这4类电子能Ø *跃迁跃迁所需能量很大，吸收波长很短（多小于150 nm），处于远紫外光区。饱和烷烃中的C-C键和C-H键只 含有电子，因而只能产生此类跃迁而吸收远紫外光， 如甲烷的max为125 nm。Ø n*跃迁跃迁所需能量略低于*跃迁，吸收波长在近紫外光区的200 nm附近，且吸收强度很小。饱和烷烃C- H键的H被O、N、S、Cl等含孤对电子的杂原子取代后， 可产生此类跃迁吸收，如甲醇羟基的 n*跃迁max为183 nm。Ø *跃迁跃迁所需能量较低，吸收谱带位于小于200 nm的近紫外光区，吸收强度较大（一般在103105L·mol

14、-1·cm-1）。不饱和烃、共轭烯烃、芳香烃等均可产生此类跃迁吸收，中几个不饱和键相互共轭，随共轭程度增 加，*跃迁的吸收带明显向长波方向移动，且吸收强度增大，如乙烯的*跃迁吸收峰为185 nm， 为10000 L·mol-1·cm-1，而丁二烯的*跃迁吸收峰为217 nm，增大到21000 L·mol-1·cm-1。Ø n*跃迁跃迁所需能量最低，吸收谱带大多位于200700 nm 的近紫外至可见光区，但吸收强度很小，通常只有* 跃迁吸收强度的1/1001/1000，基团中同时存在含孤对电子的杂原子（N、O、S等） 以及不饱和键时，即

15、可在产生*跃迁吸收的同时，伴随产生n*跃迁吸收。如偶氮基CH3N=N中CH3的n*跃迁吸收峰为339 nm，其只有5 L·mol-1·cm-1。u * 和n*跃迁吸收处在或接近紫外区，特别是*跃迁，其吸收强度很大，是有机化合物紫外-可见吸收光谱的主要吸收类型。2.生色团和助色团的概念Ø 生色团（chromophores）：含电子和n电子的不饱和基团受光辐射后就会引起* 和n*跃迁，从而产生紫外-可见光的吸收， 这类基团称为生色团，又叫发色团 。生色团往往由双键和三键体系构成（如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基等）。Ø 助色团（auxochrome）：含n电子

16、的基团（如-OH、-NH2、-SH、卤素等）可与 生色团中电子相互作用形成n-共轭，降低*跃迁 能量，使吸收峰向长波长方向移动（红移），且吸收强度增加，增强生色团的生色能力，这类基团称为助色团。3.有机化合物的重要紫外-可见吸收带Ø R吸收带（基团吸收带）：由n-共轭基团n*跃迁形成，吸收带最大吸收波长一般大于270 nm，但吸收强度较弱，可判断否具有羰基、羧基、偶氮基、硝基等。如中是在280nm处的一个弱吸收峰（e=16 L·mol-1·cm-1）就属于R吸收带。Ø K吸收带（共轭吸收带）：由共轭键*跃迁形成，吸收带最大吸收波长一般小于R吸收带（约在2

17、20280 nm），但吸收强度大，是共轭的特征吸收带，可据此判断中是否存在共轭结构。如己三烯在268 nm处的强吸收峰（e=43000 L·mol-1·cm-1）就属K吸收带。Ø B吸收带（苯系吸收带）：由*跃迁与苯环振动重叠引起的分布于230270 nm宽峰，谱带上叠加有振动产生的精细结构。是芳香化合物的特征吸收带，B带可用来辨别芳香族化合物。Ø E吸收带：由苯环内共轭大键* 跃迁形成，常分max为180 nm左右的E1带和max为200 nm左右的E2带，吸收强度均大于B吸收带，e 接近或大于104 L·mol-1·cm-1。右图

18、是苯在乙醇溶剂中的紫外吸收光谱，可见其中的B、E1、E2带。4.影响有机化合物紫外-可见吸收光谱的因素Ø结构中含助色团会使吸收峰发生红移，且吸收强度增加。如苯环上有助色团取代，会使E带和B带向长波方向移动，吸收强度增加（见下表）。助色团E2 带B 带max/nme /L·mol-1·cm-1max/nme /L·mol-1·cm-1-H2037400255230-F2048000-CI2097400263190-Br2107900261192-OH211-NH2230-PH22343500-SH2368000Ø 外部环境u 溶剂化效应

19、：在极性溶剂中吸收波长及吸收强度发生变化。溶剂极性增加，一般会使*跃迁吸收峰发生红移，而n* 跃迁吸收峰则发生蓝移；同时溶质振动受到限制，由振动引起的精细结构消失。右图显示了对称四嗪在气态、非极性溶剂和极性溶剂中可见吸收光谱的改 变情况。(在极性溶剂中K带长移，R带短移）u pH：极性和有酸碱基团的有机化合物， 在不同pH条件下其解离平衡发生改变， 紫外吸收光谱有显著变化。如苯酚在酸性环境中有210 nm和270 nm两个吸收峰，而在碱性环境中变化为235 nm和287nm两个吸收峰。5.3光吸收定律5.3.1 透过率和吸光度一束强度为I0的平行单色光入射到试样溶液时，因溶液中存在吸收该单色光

20、的吸光质点，使透过溶液后的该单色光强度减弱为 It ，则定义：Ø透过率（transmittance）T：ItT =I 0(T常用百分比表示，称为百分透过率T%，其取值范围为0100%) 吸光度（absorbance)A:A = lg I 0It（A值越大表明溶液对光的吸收越强） 吸光度A与透过率T的关系：A = -lgTØØ5.3.2 朗伯-比尔定律1.朗伯-比尔定律（Lambert-Beers law）：又称光吸收定律。即当一束平行单色光垂直射入溶液时，溶液产生的吸光度A与溶液浓度c及溶液厚度b 成正比关系：A = lg I 0= abcIt（A-吸光度；a-比

21、例系数；b-吸收介质厚度，称为吸收光程；c-吸收介质浓度）Ø 朗伯-比尔定律适用条件：u 入射光为单一波长的单色光u 吸光物质浓度较稀（一般c< 0.01 mol·L-1）Ø 吸光系数a ：吸收光程用cm，吸光物质浓度用g·L-1表示时，比例系数称为吸光系数a ，其为L·g-1·cm-1。Ø 摩尔吸光系数（molar absorptivity）e：吸收光程用cm，吸光物质浓度用mol·L-1表示时，为L·mol-1·cm-1。比例系数称为摩尔吸光系数，其u e是吸光物质吸光能力的量度，e越

22、大表明分析方法 越灵敏。u 不同的物质在同一吸收波长处的e往往不同，而同一物质的e随吸收波长的改变而改变。u 物质的e和a与该物质的相对质量M有关。e = aMe=M/10×E%已知T=0.501，则A=lgT=0.300，b=2.0cm,解25 .0 ´ 10 -6 g50 .0 ´ 10 -3 Lc = 5.00 ´ 10- 4g × L-1A=abc，则根据朗伯比尔定律A0.300a = 3.00 ´10-2 L.g-1.cm-12.0cm ´ 5.00 ´10-4 g × L-1bc而= Ma =

23、 64.0g·mol-1×3.00×102 L·g-1·cm-1=1.92×104 L·mol-1·cm-1例：浓度为25.0g/50mL的Cu2+溶液，环已酮草酰二腙分光光度法测定，于波长600nm处用2.0cm比色池测得T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数e 。（M(Cu)=64.0g·mol-1）2.偏离朗伯-比尔定律的现象和原因：测定溶液对紫外-可见光的吸收时，吸光度与溶液浓度之间有时会偏离朗伯-比尔定律描述的线性关系（如右图所示），此时将会产生较大的测定误差。引起偏离朗伯-比尔定律现象的主

24、要原因有：Ø 入射的单色光不纯实际测定中，紫外-可见分光光度计提供的入射光并非完全纯的单色光，而是具有一定波长范围（一般在25 nm之间） 的复合光，而物质对不同波长光吸收能力不同，这是导致偏离朗伯-比尔定律的主要原因之一。Ø 试液浓度过高试液浓度高，吸光质点间平均距离减小，每个粒子都可能影响其邻近粒子的电荷分布，从而影响它们的吸光能力，浓度越高，粒子间相互作用越 大，偏离朗伯-比尔定律越严重。Ø 吸光物质的形体发生改变溶液中的吸光物质因pH、离子强度等环境或自身浓度变化而发生离解、缔合、互变异构等反应，使部分吸光物质的形体发生改变，导致吸光物质的浓度变化，也会导

25、致偏离朗伯-比尔定律。5.3.3 吸光度的加和性在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，则溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和。nA总 = A1 + A2 + A3 + .An = å Aii=1A总是多组分溶液在l波长下的总吸光度，A1、A2、A3、.An 分别是在该波长下组分1、组分2、组分3、组分n单独存在时的吸光度。5.4.1 紫外-可见分光光度计的基本组成部件紫外-可见分光光度计通常由光源、分光器、吸收池、检测器、信号处理和读出装置五大部件组成（见下图）。5.4 紫外-可见分光光度计以单光路仪器为例，其光路结构和光束的见下图。途径1. 光源(Lig

26、ht source)：发出测定所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。Ø 紫外区：氢灯，氘灯(160380 nm)Ø 可见光区：钨灯，卤钨灯(3202500 nm) 2.分光器：将光源发出的连续光谱分解为单色光，有单色器和多色器之分。Ø 单色器（monochromator）：分光后只截取某一波长的单色光，是分光光度计中最常用的分光器。由入射狭缝、准直镜、色散元件和出射狭缝等组成，其中色散元件是关键部件，有棱镜和光栅两类。u 棱镜：构造简单（见下图），但色散能力较差。3503200nm,石英1854000nm。1白光2出射狭缝棱镜聚焦透镜准直透镜入射狭缝u

27、光栅:在镀铝的表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。利用光通过光栅时发生衍射和现象而分光，工作波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,能得到均匀排列的光谱，光能量衰减小，现代分光光度计基本都使用光栅作为色散元件。Ø 多色器：分光后将得到的各单色光按波长顺序会聚于一平面，与阵列检测器配合，用于光学多道型分光光度计。3. 吸收池(cell):又称比色池或比色皿，用于盛放试样溶液。Ø 要求：匹配性（一台仪器中使用的各个吸收池对光的吸收和反射应一致）。会吸收紫外光，仅适用于可见光区，石英 不吸收紫外光，适用于紫外及可见光区。Ø 材质：4.检

28、测器(detector)：作用是将透过吸收池的光能量转换为电信号进定，其关键部件是光电转换器，现代紫外-可见分光光度计中常用的光电转换器有光电管、光电倍增管和半导体光电二极管阵列等。Ø 光电管：通过光电效应将光子流转换为电子流（见右图），构造简单，但灵敏度较低，用于低档仪器。Ø 光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）：由光电管改进发展而来，阴极C的结构与光电管相同，但阳极A是一金属栅网，且在阴极与阳极之间 排布一组倍增极D（911个），通过电子倍增（见 下图），1个光子可产生105108个电子。光电倍增管灵敏度高、响应快、光谱范围宽，是目前各类光谱分

29、析仪器中最常用的光电转换器。Ø 半导体光电二极管阵列（photo diode array，PDA）：采用集成电路技术将多个光电二极管单元规则排列制作在一个硅片上,构成线或面阵列器件,其体积小，例如集成了5124096个单元的线阵列器件其感光面仅为2 mm × 20 mm左右，易与全息光栅多色器配合组成光学多道型分光光度计。与光电倍增管相比，半导体光电二极管阵列还有工作电压低、耐用等优点。长、坚固5.信号处理和读出装置(display)信号处理装置将检测器产生的电信号进行放大和对数变换等处理，并由读出装置输出显示。Ø 低档分光光度计:一般采用电流计、数字电压表直接显

30、示透过率或吸光度值。Ø 中高档分光光度计：多用微型计算机作为信号处理和读出装置，可方便准确地对信号数据进行处理变换和储存，并以图形、表格、文字、数字等多种方式显示分析结果。5.4.2紫外-可见分光光度计主要类型1.单光束分光光度计多为简易的可见分光光度计，其基本结构如下图。Ø 结构简单，价格低廉，易于普及，可以胜任一般的定量分析。Ø 操作比较麻烦，不具备自动波长扫描功能。Ø 无法自动校正因光源发光强度变化等环境因素引起的波动。2.双光束分光光度计现代紫外-可见分光光度计大多为双光束型，结构如图所示。Ø 可自动扣除参比。Ø 可自动扫描得

31、到吸收光谱。Ø 自动消除光源强度等波动 引起的误差，工作稳定性好。Ø 结构较复杂，价格较贵。3.光学多道型分光光度计仪器结构。Ø 采用半导体光电二极管阵列同时检测所有波长的光吸收信号。Ø 无需扫描即可同时测得各波长的光吸收，给出完整的吸收光谱，特别适用于化学反应动力学研究及多组分分析。5.5紫外-可见分光光度分析的实验条件5.5.1显色反应及其影响因素1.显色反应和显色剂被测物质在某种试剂的作用下，转变成有色化合物的反应称为色反应（color-forming reaction），所加入试剂称为显色剂(color-forming reagent)。

32、6; 常见的显色反应:u 大多是生成稳定有色螯合物的配位反应。u 少数氧化-还原反应和增加吸光能力的生化反应。Ø 对显色反应的要求u 灵敏度高：一般要求生成的有色化合物e达104105L·mol-1·cm-1水平。u 选择性好：所用的显色剂仅与被测组分显色，而与其它共存组分不（或少）显色。u 有色化合物组成恒定：显色剂与被测物质的显色反应要定量进行，生成有色化合物组成要恒定。u 有色化合物稳定：有色化合物的化学性质要稳定， 不易受溶液中其它化学因素及外界环境条件影响。u 色差大：有色化合物与显色剂的吸收在测定波长处有明显区别，以降低测定的空白值。Ø 常用

33、显色剂u 无机显色剂: 过氧化氢、硫u 有机显色剂：酸铵、碘化钾等。l 偶氮类：偶氮胂IIIl 三苯甲烷类：铬天菁SCOOHCOOHHOOCH3CCH3ClClSO3HAsO3 H2OHOH H2 O3 AsNNN NHO3SSO3Hl 二甲酚橙类：二甲酚橙l 邻菲罗啉类：新亚铜灵l 肟类：丁二酮肟CH 3CCCH 3NNOH HO NNCH3CH32.影响显色反应的因素Ø 显色剂用量通过实验做出在固定待测物浓度条件下，显色反应的吸光度随显色剂浓度的变化曲线（见下图），找到吸光度恒定不变（即平台区）（曲线a的情况）或达 最大值(曲线b的情况)时的显色剂用量，再适当过量即可。Ø

34、; 溶液酸度u 酸度影响显色剂的酸效应系数（许多显色剂都是有机弱酸或有机弱碱），影响其与金属离子反应条件稳定常数。u 金属离子会随溶液酸度降低而生成羟基配合物甚至水解产生沉淀。u 酸度会影响有色配合物组成。因此，显色反应中须控制合适的反应酸度，通过实验，固定显色剂及金属离子浓度，改变溶液酸度，测得吸光度A与pH的变化曲线，选择吸光度大且恒定时的pH。Ø 反应时间、反应温度、溶剂等其他实验条件u 有些显色反应速度较慢，而有些有色化合物容易褪色（空气氧化、光照、试剂分解或挥发等），因此不同的显色反应有不同的最佳反应时间范围，可通过实验来确定，并在该时间范围内完成测定。u 有些显色反应需要

35、加热提高反应速度，有些显色剂或有色化合物在较高温度下易分解褪色，温度对光吸收程度也有影响。因此应保持标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。u 溶剂会影响有色化合物（如配合物）的生成及其吸光特性等，从而影响显色反应的灵敏度。5.5.2 吸光度测定的实验条件1.入射光波长基本原则：“吸收最大，干扰最小”Ø 一般选择被测组分的max为测量波长，此处测定吸收最大，灵敏度最高（左下图）。Ø 若干扰组分在max处有明显吸收，则可选择干扰组份收、测定组份吸收相对较大的其他波长，此处测定干扰最小（右下图）。2. 参比溶液（reference solution）Ø 作用和目的:用

36、参比溶液调节仪器的A值为零（或T为100%）， 以扣除试液中溶剂和其他共存组分的吸收(空白吸收)，得到被测组分的净吸收。Ø 根据显色剂及待测试液组情况选择：u 溶剂参比:试样溶液、显色剂及其他试剂（酸碱缓冲剂、质，参比溶液可按三种掩蔽剂等）均收，仅生成的有色化合物有吸收,则直接用纯溶剂(或去离子水)作参比。u 试剂参比:试样溶液收，但显色剂或其他试剂有明显吸收时，则用加显色剂和其他试剂的溶液(称为空白试剂)作参比。u 试样参比:显色剂和其他试剂均收，但试样溶液中所含共存组分有吸收时，则使用不加显色剂，只加其他试剂（如缓冲液）的试样溶液作参比。例如:用(NH4)2S2O8氧化显色测定M

37、n2+，若试样含红色Co2+，会干扰MnO4-的测定，则可用不加(NH4)2S2O8的试样做参比扣除试样中Co2+的吸收。3.吸光度测量范围待测物浓度测定的相对误差,除取决于仪器测定透过率T的固有测定误差T(与仪器精度有关,基本固定)外，还与T值有关,右图显示了吸光度测定所得 浓度相对误差的大小与透过率（吸光度） 的关系。（书上第138页）Ø 为提高测量的准确度，被测溶液吸光度应尽量接近0.434，一般控制A 值在0.20.8（T为65%15%）范围内。Ø 通过改变称样量、调整溶液稀释倍率、使用不同厚度吸收池等方法来实现。5.6紫外-可见分光光度分析的应用5.6.1定量分析

38、定量分析是紫外-可见分光光度法的最主要的应用。一般可分为单组分和多组分测定。1.单组分测定Ø 通常采用标准曲线法。Ø 方法简单、方便，适合于分析大批的同类试样。如：邻二氮菲与Fe2+形成3:1的红色配离子，lmax=512nm，e=1.1×104L·mol-1·cm-1。在pH为39范围内显色迅速稳定。在铁含量0.58mg·mL-1范围内，浓度与吸光度符合朗伯比尔定律。用pH=4.55.0的缓冲液保持其酸度，并用盐酸羟胺还原其中的Fe3+，可用标准曲线法测定微量铁。2.多组分测定Ø 吸收峰互不重叠若试液中各组分吸收峰互不重叠

39、，则可分别在各组分的最大吸收波长处，用单组分测定法测定各被测组分。Ø 吸收峰相互重叠若试液中各组分吸收峰有一定程度的重叠，但各组分吸收光谱仍有一定差异，则可利用吸光度的加和性原理，采用计算分光光度法对各组分进定，但此法在实际应用中当组分数大于3时，得到的分析结果存在很大误差，这时，往往要借助最小二乘法、因子分析法等计算数学的方法，求得准确的结果。例如：试样溶液两组分x和y吸收峰相互重叠（右下图所示），则分别在x、y最大吸收波长1和2处测出x、y两组分的总吸光度A1和A2，在相同的条件下，配制已知浓度的纯x组分溶液，于1和2处测定吸光度，求得x组分在两波长处的x、x，12同法求得y组分

40、在上述两波长处的yy1、2，并列出联立方程：Al= e x bc + e y bcl1xl1y1Al= e x bc + ebcyl2l2xy2最后此方程组可求得cx与cy。5.6.2定性分析主要用来分析判断不饱和（特别是含共轭体系）有机化合物的异构体、等。1.指定化合物的定性分析的共轭状态和验证已知化合物Ø 用标准物质的吸收光谱进行比较将在相同条件下测得的未知物吸收光谱与标准物质吸收光谱进行比较，若两者吸收光谱的形状（最大吸收波长、最小吸收波长、吸光系数、吸收峰数目、位置、拐点等）完全一致，则可初步认为是同一化合物，Ø 用已有的紫外-可见标准光谱进行对比判断u Sadtl

41、er Standard Spectra （Ultraviolet）. Heyden，London，1978.（收集46000多种化合物）。u R.A.Friedel and M.Orchin,Ultraviolet andVisible Absorption Spectra of AromaticCompounds ,Wiley，New York，1951.（收集近600种芳香化合物）。u Kenzo Hirayama.Handbook ofUltraviolet andVisible Absorption Spectra of OrganicCompounds.New York，Plenum

42、，1967.u Organic Electronic Spectral Data. John Wileyand Sons, 1946-.Ø 利用Woodward-Fieser规则和Scott规则定性根据Woodward-Fieser规则和Scott规则计算化合物的最大吸收波长，并与实验值进行比较，来确认物质的结构。u Woodward-Fieser规则是计算共轭二烯、多烯烃及共轭 烯酮类化合物max的经验规则。主要以类丁二烯结构 作为母体得到一个最大吸收的基数，然后对连接在母体上的不同取代基以及其他结构因素加以修正，得到一个化合物的max总值。u Scott规则用来计算芳香族羰基衍生

43、物和取代苯的max,其方法类似于Woodward-Fieser规则。2.互变异构体构型的判断紫外-可见吸收光谱可用来确定化合物的构型和构像、判别异构体等。如：5.6.3 在生化分析中的应用紫外-可见分光光度法被广泛应用于蛋白质、酶、氨基酸、核酸等生物大化合物的分析。1.蛋白质含量测定蛋白质可与偶氮胂M在pH=2.32.8条件下显色形成稳复合物（ max=605nm， =4.5×105L·mol-1·cm-定1），测定灵敏度高、选择性好，生物体内普遍存在的离子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cl-等）及维生素、肌苷、尿酸、葡萄糖等均无干扰，可将试样粉碎

44、、提取、过滤后直接用此法进定。1. 脲酶酶促反应动力学常数（米氏常数）Km值测定Ø Km值是酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度，是表征酶的特征性常数。Ø 脲酶能催化分解脲，产生碳酸铵在碱性溶液中与(KI)2HgI2（奈氏试剂）显色成橙黄色的碘化双铵（ max=620nm），用光度法测定时间所产生的碳酸铵量，从而求得脲酶促反应速度。2.核酸定量测定核酸中的碱基含有共轭双键，有很强的紫外吸收（ max=260nm），测出核酸溶液的吸光度，的吸光度（即A=1）相当于核酸浓度：Ø 当吸收光程为1 cm时，一个u 双链DNA为50 g·mL-1。u 单链DNA

45、为33 g·mL-1。u 单链RNA为40 g·mL-1。u 寡核苷酸为20-30 g·mL-1。5.7荧光光谱分析法简介5.7.1荧光光谱分析基本原理1.几个概念：Ø 光致发光和荧光（Fluorescence）：吸收紫外-可见区一定波长的光后，从基态跃迁到不稳定的激发态，经极短的时间又重新跃迁到低能级， 此过程中以光辐射形式放出能量，这种现象被称为光致发光，荧光是光致发光的一种。Ø 荧光光谱分析法（Spectrofluorimetry）：利用受紫外-可见光激发后所发出的荧光进行物质定性、定量分析的方法，称为荧光光谱分析法，也称为荧光分析法（f

46、luorimetry）。2.荧光的产生Ø 电子能级的多重度M ：的电子能级多重度M = 2s + 1 (s为电子自旋的总量子数)。u 如果电子全部配对，电子自旋的总量子数s=0，则M =1，处于单线态（singlet state）,用符号S表示.l 大多数有机化合物的基态是单线态（表示为S0）。l被激发到高能级，电子自旋不发生变化，处于激发单线态（可表示为S1、S2等）。u 如果处于激发态的s=1，则M =3，用符号T表示。具有两个自旋同向的电子，即处于激发三线态（triplet state），Ø 激发态的跃迁：处于激发态的不稳定，可通过无辐射跃迁（振动弛豫、内转移、外转移

47、、系间窜越等）或辐射跃迁（荧光发射、磷光发射）能量而跃迁回基态。u 振动弛豫-处于激发态的从某一电子能级的较高振动能级降到同一电子能级中最低振动能级的过程。振动弛豫发生的时间约为10-12s数量级。u 内转移-两电子激发态能级比较接近，较高电子激发态能级中的振动能级与较低电子激发态能级中的振动能级部分重叠，因碰撞而失去能量的过程发生可能会在不子能级的振动能级之间，称为内转移。内转移发生的时间约为10-13-10-11s。u 荧光发射-激发态通过振动弛豫和内转移跃迁到第一激发单线态的最低振动能级后，以光辐射的形式放能量，跃迁回基态的任一振动能级的过程，所发出的光辐射称为荧光。该过程时间约为10-

48、9-10-7s。u 系间窜越-当两激发单线态的振动能级与激发三线态的振动能级有部分重叠时，有可能发生电子激发态自旋方向的改变而发生无辐射跃迁。u 磷光发射-当激发态发生系间窜越后，接着发生快速的振动弛豫而到达三线态的最低振动能级，如果无其他过程发生竞争， 在10-4-10 s时间内，以光辐射的形式能量跃迁回基态的过程，所发出的光称为磷光。磷光的发光速度较慢，有时甚至在激发光熄灭后仍能观察到磷光。u 外转移-激发态与溶剂或其他溶质碰撞而失去能量，使辐射荧光或磷光减弱或者消失的过程。该过程常发生在激发单线态S1或激发三线态T1的最低振动能级向基态S0转移的过程。能级的上述各种跃迁过程见下图：3.激

49、发光谱和发射光谱Ø 激发光谱（excitation spectrum）：固定观察荧光强度的波长，连续改变激发光波荧光强度对激发光波长lex的光谱曲线。激发光谱反映了物质发射的荧光强度与激发该物质发光的激发光波长的关系。Ø 发射光谱（emission spectrum）：固定激发光波长，连续改变观察荧光的波长，所得到的荧光强度对观察波长lem的光谱曲线，此发射光谱也称为荧光光谱。长，例如：下图a和b分别是蒽的激发光谱和发射光谱。可以看到，采用357 nm的紫外光作为激发光，蒽所发出的荧光强度最大，357 nm为该化合物的最大激发波长lexmax。采用相同的激发光照射蒽，在40

50、2 nm处观察到蒽的荧光强度最大，402 nm为该化合物的最大发射波长lem。maxØ荧光物质光谱的特征：u 发射峰波长总是大于激发峰波长（称为Stokes位移），原因是辐射跃迁所的能量总是小于激发所需的能量（发射荧光前总会因振动弛豫、内转移等损失一部分能量）。u 发射光谱形状与激发光波长无关。通常选择lex为激发光波长，但如果选择其他max波长作为激发光时，虽然所得发射光谱的荧光强度在整个波长范围内都会降低，但其波峰、波谷的位置不变，且形状与选择lex 所得的发射光谱相似。maxu 发射光谱与其激发光谱具有一定的镜面对称关系。Ø 荧光物质激发光谱和发射光谱上的特征，如le

51、xmax和lemmax、谱的峰谷波长、谱形状等，可作为定性分析的参考依据。进行定量分析时，选用l和lmax可得到最高灵敏度。maxexemØ 用荧光光谱进行定性的可靠性比紫外光谱高（每种荧光物质的都可以获得激发光谱和发射光谱两个光谱图）。Ø 定量分析时，当待测物质的发射光谱与干扰物质重叠时，只要激发光谱不重叠，也能通过合理选择激发波长，消除共存干扰物的干扰。4.荧光化合物的结构特征Ø 荧光量子效率（fluorescence quantum yield）：= 发射的光子数f吸收的光子数受光激发后发射荧光的能力（取决Ff反映了物质于荧光辐射跃迁与无辐射跃迁之间的竞争，与关）。结构有Ø结构与荧光强度的关系：u 共轭体系-含大p键共轭体系的芳香化合物有较强荧光，共轭体系越大，量子效率越高，荧光波长越向红端移动。u 刚性平面结构-具有刚性平面结构的，其荧光量子效率高（形