免疫实验样式编辑母版文本样式

1、免疫学实验免疫学实验 一一 血清学反应血清学反应微生物学与免疫学教研室【基本要求基本要求】 1. 上实验课时，把个人的书包和衣物放在衣柜内，穿上实验课时，把个人的书包和衣物放在衣柜内，穿好白大衣。随身只带必要的实习指导、笔记本和文具好白大衣。随身只带必要的实习指导、笔记本和文具。实验室内禁止饮食。实验室内禁止饮食。 2. 用过的实验材料，放于指定地点，不得随意抛置。用过的实验材料，放于指定地点，不得随意抛置。 3. 注意节约实验试剂，爱护实验器材。损坏器材时，注意节约实验试剂，爱护实验器材。损坏器材时，应立即报告指导教师，听候处理。应立即报告指导教师，听候处理。 4. 实验结束后，将实验台整理

2、清洁，离开实验室后，实验结束后，将实验台整理清洁，离开实验室后，将白大衣放入柜内后离去。值日同学打扫好室内卫生将白大衣放入柜内后离去。值日同学打扫好室内卫生并检查水、电、等开关是否关好，防止意外事故发生并检查水、电、等开关是否关好，防止意外事故发生。21、抗原抗体反应 指抗原Ag与相应抗体Ab之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内，也可发生于体外。 3解离解离Ag + AbAg Ab一定条件一定条件（动态平衡）（动态平衡）一、血清学反应的定义及用途一、血清学反应的定义及用途体内反应可介导杀菌、溶菌、调理、中和毒体内反应可介导杀菌、溶菌、调理、中和毒素等作用素等作用免疫病理损伤免疫病理损伤超敏

3、反应、免疫性疾病等超敏反应、免疫性疾病等4 抗原与相应抗体可在体外特异性结合发生反抗原与相应抗体可在体外特异性结合发生反应，应，因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为原抗体反应亦称为血清学反应血清学反应。 体外反应根据抗原的物理性状、抗体的类型体外反应根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现相载体等）不同，可出现凝集、沉淀、溶细凝集、沉淀、溶细胞、中和毒素、补体结合等胞、中和毒素、补体结

4、合等各种不同的反应各种不同的反应类型。类型。5血清学试验应用血清学试验应用血清学鉴定：血清学鉴定：用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗用已知抗体鉴定未知的细菌或标本中的抗原原血清学诊断：既可以测抗体也可以测抗血清学诊断：既可以测抗体也可以测抗原原用已知抗原检测血清中的特异性抗体用已知抗原检测血清中的特异性抗体6 应用: 疾病临床诊断:感染性疾病,自身免疫性疾病,肿瘤等 鉴定免疫细胞及分型73D模型模型 IgG1IgIg：存在于血：存在于血清（占血清免疫球清（占血清免疫球蛋白总量的蛋白总量的80%80%）和组织液中。和组织液中。8IgAIgM二、血清学反应的特点：二、血清学反应的特点：1、特异性

5、特异性：抗原抗体在体外的结合与在体内一样，也具有专一性，即特异性。9分子基础：分子基础：Ag-ADAg-ADHVR-AbHVR-Ab空间结构高度互补空间结构高度互补V VH H和和V VL L各具三个各具三个HVRHVR与与ADAD互补互补应用：应用： 由于抗原抗体反应具有高度特异性，故由于抗原抗体反应具有高度特异性，故可用已知的抗原（抗体）来检测相应未知的可用已知的抗原（抗体）来检测相应未知的抗体（或抗原）。抗体（或抗原）。2、可逆性可逆性：抗原与抗体的结合是分子表面的非共价键结合，不形成牢固的共价键，因此抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离状态，反应具有可逆性。10静电

6、引力静电引力（electrostatic forces）范德华引力范德华引力:作用最小作用最小（van der Waals interactions）氢键氢键:最具特异性最具特异性（hydrogen bond ）疏水作用力疏水作用力:作用最大作用最大 （hydrophobic interactions） 3、可见性：天然抗原为多价抗原，分子表面有多种多个抗原决定簇。抗体有两个Fab段可与相应的AD结合，相互交叉连接成网格状复合物，若反应体系中抗原抗体的比例适当，就能形成较大的抗原抗体复合物，在有一定量电解质或适宜pH等条件下，出现肉眼可见的凝集、沉淀等可见反应。如果抗原抗体的比例不适当，就不能

7、形成大的免疫复合物，不出现可见反应。1112亲水胶体亲水胶体疏水胶体疏水胶体转化转化NaClNaCl可见反应可见反应血清学反应条件下，抗原抗体均带负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体。 当抗原与抗体结合使表面电荷减少，水化层变薄，失去亲水性能，抗原抗体复合物成为疏水胶体在电解质作用下，中和胶体粒子表面的电荷，使各疏水胶体之间靠拢，形成可见的抗原抗体复合物亲水胶体转化为疏水胶体亲水胶体转化为疏水胶体 4、阶段性：抗原抗体反应分两个阶段， 抗原抗体发生特异性结合的阶段，反应快，抗原抗体发生特异性结合的阶段，反应快，几秒或几分钟，不可见几秒或几分钟，不可见 可见阶段，短至数分、数小

8、时，长至数日，可见阶段，短至数分、数小时，长至数日，出现凝集、出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现象沉淀和细胞溶解等现象 13概念：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结概念：两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。构的抗原表位，可与彼此相应的抗血清发生反应。交叉反应（交叉反应（cross reactionscross reactions）抗原抗体交叉反应示意图抗原抗体交叉反应示意图B亲缘关系亲缘关系越近，交叉反应的程度也越高越近，交叉反应的程度也越高 14三、血清学反应的影响因素三、血清学反应的影响因素151 1、反应物自身因素、反应物自身因素 * *抗原

9、：理化特性、抗原：理化特性、AgAg决定簇数量和种类。决定簇数量和种类。 * *抗体：抗体：1 1、来源、来源 2 2、特异性与亲和力、特异性与亲和力 3 3、浓度、浓度 比例要和适比例要和适16（1 1）电解质）电解质 作用：中和胶体表面电荷，破坏水化层，作用：中和胶体表面电荷，破坏水化层， 使使Ag-Ag-AbAb聚集。聚集。 常用：常用：0.85%NaCl0.85%NaCl溶液溶液、缓冲液、缓冲液、CaCa2+2+、 MgMg2+2+等。等。 注意：盐析（注意：盐析（saltingsalting）即电解质浓度过高）即电解质浓度过高 引起的非特异性蛋白质沉淀。引起的非特异性蛋白质沉淀。2

10、2、环境因素：、环境因素：（2 2）酸碱度）酸碱度 AgAg、AbAb多为蛋白质，具两性电离特性，有其故有多为蛋白质，具两性电离特性，有其故有的的PI , pHPI , pH过高或过低均可影响过高或过低均可影响AgAg、AbAb反应。反应。 一般：一般：pH6pH68 8为宜，补体参与时为宜，补体参与时pH7.2pH7.27.47.4。 注意：自凝现象注意：自凝现象-即即pHpH达到或接近颗粒性抗达到或接近颗粒性抗原的原的PIPI时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。时，引起的抗原非特异性自身凝集现象。（3 3）温度）温度影响反应速度影响反应速度一般：一般：151540 40 为宜，为宜，最适温

11、度：最适温度：3737过高（过高（5656）: Ag-Ab: Ag-Ab解离，解离， AgAg、AbAb变性，变性， 补体失活。补体失活。冷凝集实验：冷凝集实验：4 4 凝集，凝集，2020解离。解离。（4 4）其他）其他 适当的振荡、搅拌等可加速反应适当的振荡、搅拌等可加速反应抗体的两个抗体的两个FabFab段段分别分别结合两个结合两个AgAg分子，分子，相互相互交叉结合连接成巨交叉结合连接成巨大的网格状立体聚大的网格状立体聚合物，（可见）。合物，（可见）。 Ab/Ag Ab/Ag过剩过剩过剩方的结合价得不到饱和，大过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复多数游离存在，只形成

12、小分子复合物（不可见）。合物（不可见）。只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合反应。只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合反应。免疫检验技术发展进程的主要阶段免疫检验技术发展进程的主要阶段自然的肉眼观察的抗原抗体反应（凝集反应、沉淀反应）自然的肉眼观察的抗原抗体反应（凝集反应、沉淀反应）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了

13、反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合四、反应分类四、反应分类 （一）凝集反应 1、定义：颗粒性抗原（如细菌、红血球等） +抗体凝集现象。颗粒性抗原与相应的抗体在体外结合，在电解质存在的条件下，形成肉眼可见凝集块，为凝集反应，反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素21 2、分类 （1）直接凝集反应 概念：天然的凝集原与相应抗体直接结合呈现的细菌凝集或红细胞凝集现象称为直接凝集反应。 方法： 玻片法：抗原和抗体在玻片上的反应，常用于定性检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定 试管法：试管中系列稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于定

14、量检测抗体，如诊断伤寒病的肥达试验。-实验内容2223血型鉴定血型鉴定（2）间接凝集反应 概念：先将可溶性抗原或抗体包被在胶乳颗粒或红细胞表面，再与相应抗体或抗原结合出现反应的称为间接凝集反应。 类型： 正向间接凝集：用已知抗原包被颗粒以检测未知抗体 反向间接凝集：已知抗体包被颗粒检测相应抗原24 （3）间接凝集抑制试验：先将可溶性抗原与相应抗体充分结合，再加入同种抗原致敏的颗粒，将不出现凝集，称间接凝集抑制试验，可用来检测可溶性抗原，25间接凝集抑制试验妊娠试验【实验原理实验原理】可溶性抗原致敏的乳胶颗粒与相应抗体作用可使乳胶颗粒凝集，此为间接乳胶凝集试验。若使抗体先与可溶性抗原作用，再加入

15、该抗原致敏的乳胶颗粒，则乳胶凝集被抑制，此为间接乳胶凝集抑制试验。孕妇尿中绒毛膜促性腺激素（HCG）含量明显增高。HCG与抗HCG抗体先作用后，再加入HCG致敏的乳胶颗粒，不出现凝集反应，此为妊娠试验阳性；非孕妇尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗体，抗体与后加入的HCG致敏乳胶结合呈现凝集现象，则妊娠试验阴性。注：早孕试纸采用的是胶体金免疫层析技术（注：早孕试纸采用的是胶体金免疫层析技术（GICAGICA），与），与此原理不同此原理不同（二）沉淀反应（二）沉淀反应 1、概念：可溶性抗原+抗体沉淀现象。 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）与相

16、应的抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的细微的白色沉淀。27环状沉淀反应絮状沉淀反应抗原沉淀环抗血清抗原抗血清混合常用于毒素、类毒素和抗毒素的定量测定 主要用于抗原的定性试验，如炭疽病的诊断（Ascoli氏试验）、链球菌的血清型鉴定和血迹鉴定等 28 2、分类 （1）液相中的沉淀反应：环状沉淀、絮状沉淀（2）凝胶扩散凝胶扩散：单向扩散：1%琼脂凝胶的孔径约85纳米，可允许各种Ag或Ab自由扩散，由近及远形成浓度梯度。29通过标准品绘制标准曲线 不同病人抗原浓度测定1.测定沉淀环直径2.在标准曲线上查找相应抗原浓度火箭免疫电泳火箭免疫电泳是单向单扩散和电泳技术相结合的一种血清学试验，是让

17、抗原在电场的作用下，在含有抗体的琼脂中定向泳动，二者比例合适时形成类似火箭样的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的浓度成正比 。30电泳完毕后，观察琼脂板上沉淀峰，并测量从孔中心到峰尖的高度。以峰高为纵坐标，浓度为横坐标(对数坐标)，绘制标准曲线，求出待检样品内抗原浓度31 可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝琼脂糖凝胶胶板的对应孔中各自向四周板的对应孔中各自向四周自由扩散自由扩散,若两者分子比若两者分子比例适当例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线成白色沉淀线.双向扩散：(1) 沉淀线吻合：待检抗原

18、与标准抗原完全相同。(2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。A1：待检抗原；A2：标准抗原32免疫电泳对流免疫电泳33在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高，只带有微弱的负电荷，而且分子又较大，因此电泳力小，小于电渗力，泳向负极；而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子较小，电泳力大，大于电渗力，泳向正极，电泳时抗原放负极侧，抗体放正极侧，抗原抗体相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，在比例适当处形成

19、肉眼可见的沉淀线。实验内容实验内容 一、直接凝集试验一、直接凝集试验试管法（1份/人） 试管法凝集试验是一种半定量的试验方法，是在试管内将抗原或抗体稀释不同倍数后加入等量的待检抗体或抗原，根据每管内的凝集程度，判定待检样品中相应抗原或抗体的有无及其效价。 试验中由于电解质浓度或pH 值不适宜等原因，可引起抗原非特异性凝集，出现假阳性反应，所以应设立阴性对照管。34教材教材P29935材料：材料：1% 新鲜绵羊红细胞悬液、羊红细胞凝集素（兔抗绵羊红细胞免疫血清）等方法方法：（理解对倍稀释法）：（理解对倍稀释法）1. 取小试管7支，置于试管架上，编号。2. 用 1ml 刻度吸管吸生理盐水，第一管加

20、0.9ml，其余管各加0.5ml。3. 用 1ml 刻度吸管吸取兔抗羊红细胞血清0.1ml 加入第一管 中，反复吹吸三次，使之与盐水混匀反复吹吸三次，使之与盐水混匀，吸出0.5ml注入第二管。同样混匀后吸取0.5ml 注入第三管，依此类推。自第6管吸出0.5ml 弃掉。第八管不加血清作为对照。此时自第一管至第七管稀释倍数分别是1:101:10，1:201:20，1:401:401:3201:320，具体稀释方法可参阅下图。36血清稀释度血清稀释度 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320弃弃之之生理盐水生理盐水.血清血清.ml. 4. 各管加入绵羊红细胞悬液 0.5ml，

21、于是各管血清稀释倍数又增加了一倍。 5. 将各管震荡均匀，放入37温箱中过夜，次日观察结果。 二、双向扩散试验二、双向扩散试验检测血清中的AFP（1份/2人） 【操作方法】 1. 双向琼脂扩散试验抗原抗体孔位置如下图所示 2. 用微量加样器孔中分别加抗甲胎蛋白诊断血清，周围孔 中分别加入待测血清和阳性对照血清，每孔加入25-30l。 3. 将琼脂板放入密闭的盒内（内放浸有5%石炭酸的纱布以保持湿度），置37温箱中，于24小时后观察结果。37注意：加样量力求准确，勿使样品外溢或在孔缘上注意：加样量力求准确，勿使样品外溢或在孔缘上残存小汽泡，以免影响扩散结果。残存小汽泡，以免影响扩散结果。原则：满

22、而不溢原则：满而不溢37待测待测1AFP-AgAFP-Ab待测待测2定位标记孔38免疫学实验免疫学实验 二二 续血清学反应续血清学反应一、分析上次结果一、分析上次结果（一）血球凝集（直接凝集试管法）血球凝集（直接凝集试管法）：观察结果并分析 1、从温箱中轻轻取出试管架，不要摇动试管。先观察对照管（第7管），此管血球不出现凝集现象，红细胞在管底自然沉降呈现点状结构，上层液基本清澈透亮，管底可见红细胞沉积物，呈圆形，边缘整齐，轻轻振摇试管后，可见红细胞浮起又分散仍呈悬液。 2、试验管从第一管看起，管底有凝集块，边缘不整或卷起等现象，均为阳性反应，分别用（+）、（）、（+）、（）、（+）、）、（+）

23、表示凝集程度。 （+）表示血球100% 凝集，红细胞形成片层凝集，均匀布满管底或边缘皱缩如花环状；（+）表示血球75% 凝集，红细胞形成片层凝集，面积略多于（+）；（+）表示血球50% 凝集，红细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较松散；（+）表示血球25%凝集，红细胞沉于管底，周围有散在的少量凝集。39 3. 按下列标准判定，记录结果。 +：凝集特别显著，红细胞均匀地铺于管底，呈一薄层边缘有折迭状。 +：凝集显著，红细胞均匀地铺于管底呈一薄层，但周边红细胞凝集较疏松。 +：凝集清楚可见，红细胞平铺于管底呈一薄层，中央可明显见到一疏松的红点。 +：红细胞大部分沉集于管底成圆点状，周围有少量凝集的红

24、细胞。 ：红细胞全部沉集于管底呈圆点状，四周液体清晰。 4. 判断效价：能见到明显凝集现象（+）的血清最高稀释度为该血清对1%绵羊红细胞的凝集效价（或滴度）。一般以出现 + 凝集反应的最高血清稀释倍数作为血清中所含凝集抗体的效价。40 （二）双向扩散（沉淀反应）双向扩散（沉淀反应）：观察结果并分析 观察各孔之间有无白色沉淀线，根据他们的关系判断结果。 在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线（抗原抗体复合物）为阳性反应。若72 小时后仍未出现沉淀线则为阴性反应。试验时阳性对照与待测血清两者沉淀线发生吻合时，才能确定待测血清中含有甲胎蛋白。41二、血清学反应分类（续前）二、血清学反应分类（续前） （

25、一）凝集反应 （二）沉淀反应 （三）中和反应：抗体与相应毒素和病毒结合后使其失去与靶细胞结合的能力而丧失生物学活性称为中和作用，利用这一原理设计的试验称为中和试验，主要用于毒素的鉴定、病毒感染性疾病的诊断以及病毒的鉴定。4243（四）补体溶血：红细胞与相应抗体结合，可激活补体使红细胞溶解，称为补体溶血反应或免疫溶血反应。原理为补体激活的经典途径（补体的动画）补体特点：补体可与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与抗原或抗体结合。在有特异抗体存在时可以溶解细胞（溶菌或溶血）。 补体结合反应：是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。44溶血

26、反应溶血反应RBCRBC+ + RBCRBC抗体抗体 ( (溶血素溶血素) )新鲜血清（补体）新鲜血清（补体）溶血溶血451 21 12 21 12 21：No Ab； 2：Ab461.定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。2.分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC(异硫氰酸荧光素) ，PE(藻红蛋白 )免疫酶测定法：HRP，AP（五）免疫标记技术：Isotype of antibody:Isotype of antibody:Immunize RabbitImmunize Ra

27、bbitRabbit anti-mouse IgG1Rabbit anti-mouse IgG1481、酶联免疫吸附试验（ELISA）： 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。中未知抗体或抗原的方法。将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体检测液相中未知抗体将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原检测液相中的可溶性抗原将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体抗体检测液相中

28、的可溶性抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体49（以间接性（以间接性ELISAELISA为例）为例）：50 ELISA-测抗原（Ag）或抗体（Ab）三要素o抗原或抗体的固相化：已知的Ag/Ab结合到固相载体表面，并保持其免疫活性；o抗原或抗体的酶标记：酶标Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；o底物显色：底物被酶催化成为有色产物定性和定量 放大免疫反应的信号 （1）双抗夹心法）双抗夹心法将已知抗体已知抗体吸附在固相载体表面，洗除未吸附的抗体，加入样品(含有抗原)与一定量的酶标记抗体，竞争温育后，在固相载体表面形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。洗除多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发

29、生降解应，产生有色物质。颜色深浅与抗原含量成正比。通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。 5152改良双抗夹心法改良双抗夹心法双抗夹心法双抗夹心法（2）间接法）间接法将已知抗原已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗抗体，与吸附在固体表面的抗原-抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。5354（3）抗原竞争法）抗原竞争法 待测抗

30、原和酶标已知抗原与固相抗体竞争结合，使结合于固相的酶标抗原与待测抗原的含量呈反比，此法多用于单价的检测抗原。5556直接竞争直接竞争法检测可溶性抗原法检测可溶性抗原原理：待检抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合；原理：待检抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合；待检抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后待检抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。的显色也愈浅。2、放射免疫测定法（RIA）：用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的技术。它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合，使检测的灵敏性达pg水平。常用于标记的放射性核素有125I和131I

31、。其基本原理是用放射性核素标记的已知抗原（Ag*）与待测的同种抗原（Ag）共同竞争有限数量抗体（Ab），若待测Ag含量愈多，则形成的可溶性AgAb复合物愈多，形成的Ag*Ab复合物（B）愈少，而游离Ag*（F）愈多。反之若样品中Ag甚少，则大量Ag*存在于复合物中，用适当的方法分离免疫复合物，分别测定复合物中的Ag*和游离Ag*的放射性，从标准曲线上可以查知待测Ag的含量。放射免疫测定法灵敏度达pg水平，特异性强，常用于微量物质测定。573、免疫荧光技术、免疫荧光技术是用荧光色素对抗体或抗原进行标记，再与相应抗原或抗体结合，然后在荧光显微镜下观察抗原抗体复合物散发荧光的有无、强弱、部位等以分析

32、示踪相应的抗原或抗体，借此对标本中的抗原（或抗体）作出定性、定量、定位检测。 。常用的荧光色素有异硫氰酸荧光素（FITC），此外还有四乙基罗丹明（RB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）和三氯三嗪基氨基荧光素（DTAF）等 。 58三、实验内容三、实验内容 （一）补体溶血试验（1份/4人） 试剂：2% 绵羊红细胞、 溶血素（兔抗绵羊红细胞免疫血清）、 补体（新鲜豚鼠血清） 绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡5960成分管号成分管号1%SRBC羊溶血素羊溶血素（2单位）单位）补体补体（2单位）单位）生理盐水生理盐水结果结果10.50.50.50.520.50.51.030.50.5

33、1.040.50.5（人溶血素）（人溶血素）0.50.550.51.5实验步骤混匀，混匀，37，30min（二）（二）ELISA双抗夹心法（双抗夹心法（1份份/2人）人） 步骤： 1.加样：设空白孔1孔，第26孔加 20ng/ml 标准品、200ng/ml标准品、待测1、2、3号血清各100l，37水浴30min。 2.洗涤：取出后甩去孔内液体，加洗涤液(绿盖)2滴，轻轻摇动几次弃去，然后用蒸馏水加满各孔洗涤5次，然后在吸水纸上拍干。 3.加酶标抗体：在各孔中加入酶结合物（橙盖）滴（100l），空白孔不加，置37孵育15min。 4.洗涤：同步骤“2”。 5.加底物：各孔内加底物（黑盖）1滴，

34、随即加入显色剂（蓝盖）1滴，充分混匀，置室温避光反应25min观察结果（此时肉眼观察呈蓝色）或每孔加入终止液2N H2SO4（黄盖）100l终止反应后观察结果或比色（体系颜色变黄）。61 【注意事项】 1. 封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。 2. 加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出 3. 每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1 分钟 4. 洗涤后板要甩干，不要残留液体。62【结果分析结果分析】 目测：根据显色深浅，用（-）为无色，（+）为浅色，（+）为黄色，（+ + +）为棕黄色表示。一般呈+ +以上者为阳性 本试验是定性试验。通过与标准管颜色进行比较，来判断结果

35、。400ng/ml者为阳性，怀疑肝癌等；20400ng/ml弱阳性；20ng/ml判断为阴性，正常人通常20ng/ml 。63TMB四甲基联苯胺经酶作用后的四甲基联苯胺经酶作用后的显色反应显色反应终止前终止后终止前终止后四、写实验报告四、写实验报告 补体溶血试验补体溶血试验 1、目的 2、原理-补体途径 3、材料与方法 4、结果 5、结果分析6465成分管号成分管号1%SRBC羊溶血素羊溶血素（2单位）单位）补体补体（2单位）单位）生理盐水生理盐水结果结果10.50.50.50.5溶血溶血20.50.51.0不溶不溶30.50.51.0不溶不溶40.5（人溶血素）（人溶血素）0.50.5不溶不

36、溶50.51.5不溶不溶结果结果反应类型反应类型实验技术实验技术结果判断结果判断凝集反应凝集反应 直接凝集试验直接凝集试验观察凝集现象观察凝集现象间接凝集试验间接凝集试验同上同上抗球蛋白试验抗球蛋白试验同上同上沉淀反应沉淀反应 液相沉淀试验液相沉淀试验观察沉淀，检测浊度观察沉淀，检测浊度免疫电泳技术免疫电泳技术观察扫描沉淀峰、沉淀弧观察扫描沉淀峰、沉淀弧补体参与补体参与的反应的反应补体溶血试验补体溶血试验观察测定溶血现象观察测定溶血现象补体结合试验补体结合试验同上同上免疫学检测技术的类型免疫学检测技术的类型反应类型反应类型实验技术实验技术结果判断结果判断中和反应中和反应病毒中和试验病毒中和试验

37、检测病毒感染性检测病毒感染性毒素中和试验毒素中和试验检测外毒素毒性检测外毒素毒性标记免疫反应标记免疫反应荧光免疫技术荧光免疫技术检测荧光现象检测荧光现象放射免疫技术放射免疫技术检测放射性强度检测放射性强度酶免疫技术酶免疫技术检测酶底物显色检测酶底物显色发光免疫技术发光免疫技术检测发光强度检测发光强度金免疫技术金免疫技术检测金颗粒沉淀检测金颗粒沉淀观看细胞免疫的示教片观看细胞免疫的示教片68实验原理实验原理 本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.0740.001），利用比重介于某两类

38、细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。6970用用Hanks液配成液配成1 110106 6 细胞细胞/ml/ml的淋的淋巴细胞悬液。巴细胞悬液。提取外周血单个核细胞（提取外周血单个核细胞（PBMC）细胞数细胞数/ml4大格中细胞总数大格中细胞总数410104 4 稀释倍数稀释倍数71 T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体植物血凝素（植物血凝素（PHAPHA）、刀豆蛋白）、刀豆蛋白A A（ConAConA）可选择）可选择性刺激性刺激T T细胞增殖细胞增殖；脂多糖（脂多糖（LPSLPS）可刺激）可刺激B B细胞增殖；细胞增殖；7