量化成像流式细胞技术在心血管研究中的应用

1、“我国每5个成年人中就有1个心血管病患者，每10秒钟就有1人死于心血管疾病“，心血管疾病在致中国城镇与农村居民死亡疾病中占首位。因此可见，心血管疾病的预防与治疗是未来临床与科研重点关注的研究方向。转化医学这一概念的提出促进了临床实践向基础研究提出新的命题，基础研究提出可能的解决方案进行临床验证，相互转化。目前中国转化医学的研究重点在心血管疾病与肿瘤，集中在疾病的发病机制、疾病的早期非创伤性诊断、疾病的规范治疗及新药物新技术的开发等。细胞水平建立体外疾病模型从而研究相关发病机制与治疗手段，是心血管疾病关注的重要方向。流式细胞检测和显微成像，是细胞水平研究的两大传统方法。利用流式细胞技术，科研人员

2、可以分析上万个细胞，获得每个细胞的相对大小、颗粒度和荧光信号的数值，从而得到细胞群体的各种统计数据，筛选出稀有的细胞亚群。但是传统流式细胞检测技术存在一定局限，获得高通量的同时忽略了细胞承载的丰富信息。研究人员仅仅得到散点图上的一个点，而不是真实的细胞图像，缺乏细胞形态、亚细胞器结构与荧光信号空间分布的相关信息。要想获得基于细胞图像的数据，研究人员必须借助各种显微成像设备进行观察，但显微镜能够观察到的细胞数量是非常有限的，容易遗漏稀少事件，手动分析数据耗费大量人力和时间，而且受实验人员的主观因素影响，实验结果的稳定性很差，难以提供准确的细胞群体量化与统计数据。因此，量化成像流式细胞技术（Ima

3、geStream）的出现结合了流式检测的高通量与荧光显微镜的高内涵，同时提供细胞图像与群体统计数据，给传统细胞分析带来了重大变革，在流式细胞分析、分选的传统技术之外开创了“成像流式“下一代专家级流式细胞技术的发展方向。心脑血管研究经常涉及分离分析原位组织中的干细胞、前体细胞等，若仅仅使用传统流式分析方法，难以精确鉴定细胞。荧光显微镜又受通量的限制，难以捕获稀有现象。量化成像流式细胞技术的优势在于高功率激光器与785nm SSC专用激光器适合分析低含量细胞，结合了量化成像高内涵与传统流式分析的高通量特点，准确显示稀有细胞的形态学特性，并可进一步结合细胞表面与内部标记物确认该细胞群生物学功能。极小

4、胚胎样干细胞（VSELs）是指人类血液及骨髓中存在的一类体积非常小、数量非常稀少的多能干细胞，被认为具有替代胚胎干细胞的潜力，其在科学界深受重视。然而，这种细胞真的存在吗？来自肯塔基大学的一个心血管疾病研究小组利用ImageStream发现了心肌缺血患者VSELs迁移到外周血的证据（图一），骨髓中这群细胞的比例仅为0.01%，表达CXCR4+、SSEA+、Oct4+和Nanog+。研究人员精确地了解到VSELs的直径约为3.6微米左右，而造血干细胞HSC的直径较大些，大约为6.5微米。对于核/质比的分析发现，VSELs的核/质比显著高于HSCs，细胞质区显著小于HSCs。组织器官受损时（如该研

5、究证实的心肌梗死），VSELs可能从骨髓中释放入血液循环中，以参与损伤修复过程。而受损组织炎性因子或趋化因子的释放，也会影响VSELs向损伤区域或其他脏器的归巢。与此类似，ImageStream可应用与心肌组织干细胞研究，结合高通量与形态精确鉴定，研究信号通路的活化。图一：心肌萎缩病人的极小胚胎样干细胞VSELs迁移到外周血中。Lin/CD45为造血干细胞HSCs的标记物，Oct4和CD34为极小胚胎样干细胞VSELs的标志物，7-AAD标记细胞核，该研究使用了ImageStream系统检测VSELs，显示了明场图像与biomarker的荧光成像，发现Oct4可以与细胞核共定位。来源：Evid

6、ence of Mobilization of Pluripotent Stem Cells into Peripheral Blood ofPatients with Myocardial Ischemia.Exp Hematol. 2010 Dec; 38(12): 11311142.e1.细胞自噬是一种利用溶酶体对自身细胞器进行分解、将产生的大分子物质予以回收利用的高度保守的细胞降解过程。饥饿、缺血、氧化应激等均可诱导其发生。自噬的调节也与心血管疾病相关，包括心脏肥大、缺血性心脏病、心力衰竭以及缺血-再灌注损伤。正常的细胞自噬对心肌细胞有保护作用,自噬不足或自噬过度则可促发疾病或加重病变

7、。量化成像分析技术可以（1）借助多种细胞表面与内部标记物追踪自噬蛋白与自噬小体的变化，（2）统计自噬蛋白与溶酶体的共定位，（3）研究自噬蛋白与受体的相互作用，并可组合多种应用模块量化分析（4）细胞自噬与凋亡的关系、涉及的上下游信号分子。ImageStream技术在自噬方面的研究成果已有多篇发表于Science、Oncogene、Autophage、Journal of Immunology等高水平专业杂志。ImageStream技术建立在传统的流式细胞术基础之上，结合了荧光显微成像技术，它具有12个检测通道，可以对流动中的每个细胞进行成像，并实现了对细胞图像各种形态学参数量化分析，获得全新的细

8、胞形态统计学数据。ImageStream技术与传统流式细胞仪很类似，其系统平台也是由液流系统，光学系统和检测系统三大部分组成。液流系统通过注射泵将样本细胞悬液和系统鞘液注入流动室中，细胞在鞘液流的约束下聚焦在液流的中心，逐个流过检测窗口。光学系统中光源照射通过检测窗口的细胞，从而产生光信号。光源分为两种，其一用于产生明场细胞图像，另一种是用于产生荧光细胞图像的激光器。独特、定制的全固态激光器，功率高且可调节，有利于同时检测多种荧光信号或是微弱信号。本系统拥有一个独特的785 nm激光器，用于检测侧向角（SSC）参数，极大提高了该参数的检测灵敏度。光源照射细胞产生的光信号被大数值孔径的物镜收集，

9、然后通过光路系统传递到由二向色镜构成的滤光片堆栈。光信号在这里被分成不同波段投射到CCD的相应检测通道上，产生明场细胞图像、暗场细胞图像和多个荧光通道的细胞图像，即每个细胞可以获取12副不同成像。ImageStream技术的检测系统十分独特，采用不是传统流式细胞仪的PMT检测方式，而是基于时间延迟积分技术的CCD（TDI (time delay integration) CCD）采集，保证了系统对高速运动的流体细胞也能采集高质量图像。图二：系统性红斑狼疮SLE病人与正常人群相比，免疫细胞自噬程度增高。绿色荧光标记LC3自噬蛋白，在High高自噬情况下，LC3发生聚集。CD19、CD4、CD14

10、分别标记B细胞、T细胞和单核细胞。来源：Autophagy is activated in systemic lupuserythematosus and required for plasmablast development.Ann Rheum Dis. 2015 May; 74(5): 912920.ImageStream系统配有功能强大的数据分析软件IDEAS®，可以对每个细胞的图形进行超过100种量化参数分析。这些参数不仅包括细胞整体的散射光和荧光信号强度，还包括对细胞形态，细胞结构及亚细胞信号分布的分析。点击散点图上的点，就可以直观的看到这个点代表的细胞的图像。目前已经广泛应用于细胞信号转导、细胞共定位、细胞形态变化、胞间相互作用、细胞自噬等典型应用，从而提高了软件的易用性。另外，使用者还能够根据自身研究的特殊需要，自定义参数的设定，进行更深入的分析。因而，科学家们既可以将其应用于基础生命科学研究，如免疫学、生物化学、转录组学等等，又可以用于深入了解某些疾病的发病机制。从2005年至今，利用量化成像流式细胞技术已经发表了超过500篇的同行评议文章，其中已有多篇文章发表在Science、Nature、Immunity等顶尖杂志上，说明该技术已经得到了科研界的广泛肯定。随着ImageStream技术的应用不断推广，科