分子流行病学(研究生,3学时)

1、分子流行病学分子流行病学Molecular Epidemiology 第四军医大学流行病学教研室 闫永平主要内容分子流行病学为何产生？ 动力分子流行病学怎样产生？ 条件分子流行病学是什么？ 定义分子流行病学干什么？ 任务分子流行病学怎么干？ 方法一、分子流行病学为何产生？ 动力实践需求是学科发展的根本动力如：SARS防治中存在的问题病例的诊断 密接的管理环境消毒 消毒剂滥用背景背景问题问题传染病 耐药性菌株出现 病原体变异鉴定，分布特征，影响因素,传染源追踪，传播途径确定，阐明流行规律，防控措施 新的病原微生物SARS等慢性病多病因、多阶段、多基因、长潜伏期 因果判断困难 生物个体、群体间遗传

2、变异易感性差异 实验研究从分子水平提出了很多病因假设（如毒物大分子加成物、癌基因、抑癌基因等），需要流行病学在人群进行深入研究 n传统流行病学的研究方法n 暴露 疾病 举例： 吸烟 肺癌 过程? 机理？ “Black box” Exposure Disease Molecular Epidemiology 二、分子流行病学怎样产生？二、分子流行病学怎样产生？ 条件n学科分化、交叉和融合是学科发展的基本规律n分子生物学的发展n分子遗传学的发展n生物与化学分析技术的发展n分子流行病学从九十年代初期开始逐渐引入到了我国流行病学的教学中，1998年由第四军医大学主编出版了国内首本分子流行病学专著。n1

3、999年和2001年分别由北京医科大学和天津医科大学主编出版的供预防医学专业和临床医学专业本科生用的流行病学统编教材也相继纳入了分子流行病学章节。三、分子流行病学是什么三、分子流行病学是什么? 定义定义n分子流行病学是一门以流行病学现场研究为基础，结合相关的生物学标志的测量，从宏观与微观水平综合研究疾病及其相关事件的病因、分布和流行规律，以制定和评价预防措施和促进健康的科学。 n从上述定义中可看出，分子流行病学研究中，宏观的群体现场研究是基础，微观的个体分子生物学标志研究是核心，宏观和微观研究的结合是解决问题的关键。 国际上的定义 nThe term The term ”molecular m

4、olecular epidemiologyepidemiology” may be may be used to describe used to describe such an Approach: such an Approach: the incorporation of the incorporation of molecular, cellular, molecular, cellular, and other biologic and other biologic measurements into measurements into e p i d e m i o l o g i

5、 ce p i d e m i o l o g i c research. research. 生物学标志(biological markers，biomarkers)（一）概念（一）概念 是指从暴露到疾病各个连续过程中可测量的、能反映结构和功能改变的各种细胞的、生物化学的、免疫的或分子的物质。n但分子流行病学常常需更加敏感地反映机体在分子水平的微小变化，因此有人把能反映分子水平、基因水平的DNA损伤、变异和表达异常的蛋白分子的生物学标志称为分子生物学标志(molecular biomarkers)。（二）主要生物学标志（二）主要生物学标志n生物学标志种类繁多，分类方法尚未统一，但可按从暴露到

6、疾病的连续事件，主要分为:n暴露标志(exposure marker)n效应标志(effective marker )n易感性标志(susceptibility marker)1. 暴露标志（1）外暴露标志 主要指宿主对环境因素的暴露标志。如：细菌、病毒、农药等物理和化学因子。（2）内暴露标志 指宿主暴露于上述生物性的和非生物性的因子后在其体内可测量到的相关标志。有人称之为体内剂量（internal dose）。如烟草中尼古丁(nicotine)的代谢产物尿中的可丁宁(cotinine)。（3）有效暴露标志 指已与靶组织细胞内DNA或蛋白质相互作用的外源性物质或其反应产物的含量标志，又称为分子

7、剂量（molecular dose）。如暴露于苯并芘后，在淋巴细胞中能检测到特异的DNA加成物(adduct)。显然，它是比外暴露标志与内暴露标志更具说明力的剂量标志。2.效应标志（1）早期效应标志 由于结合到靶细胞上的外源性物质的持续作用，引起组织与细胞的生物学或生化学的变化，从而产生疾病前期的生物学标志。例如，吸烟导致肿瘤的抑癌基因p53序列上的一些特殊部位发生G到T的突变而使其失活。 （2）疾病标志 是从暴露到发病的整个过程中最终的效应标志，是组织结构或功能改变的结果。所以这类标志也是疾病筛检和诊断的标志。它往往代表疾病的亚临床阶段或者它本身就是疾病的表现。3.易感性标志n是指宿主体内在

8、暴露之前就已存在的遗传性或获得性的、决定着因暴露而导致疾病发生可能性的可测量指标。n易感性与暴露至疾病发生的整个过程中的每一个环节均有关系，是决定暴露至发病整个进程的重要因素。n例如，在吸烟量相似的吸烟者群体中，作为效应标志的苯并芘-DNA加成物的水平，在不同个体可相差2-100倍，其原因可能就是由于宿主的遗传易感性不同造成，从而可使个体由吸烟导致肺癌发生的过程和结局也不同。 四、分子流行病学干什么？四、分子流行病学干什么？ 任务任务(一一)疾病病因的探讨疾病病因的探讨 n疾病的发生，大多是环境因素与遗传因素同疾病的发生，大多是环境因素与遗传因素同时起作用。时起作用。n遗传因素起重要作用的疾病

9、往往与基因有关；遗传因素起重要作用的疾病往往与基因有关；n很多与环境因素有关的疾病，也常常需从基很多与环境因素有关的疾病，也常常需从基因方面去研究，因为环境因素可以通过宿主因方面去研究，因为环境因素可以通过宿主的基因突变或异常表达引起疾病。的基因突变或异常表达引起疾病。 因此，分子流行病学研究在这方面起着因此，分子流行病学研究在这方面起着非常重要的作用。非常重要的作用。举例1：n以前一般认为肺癌的家庭聚集性很少见，故基因因素的作用很小。n但Dragani从小鼠模型发现染色体上存在易感或抑制肺癌的基因位点。n此后作者在人群中进行了病例对照研究，结果显示，在KRAS2基因第2外显子下游有个基因位点

10、与拮抗肺癌产生并延长肺癌患者的生存期有关。 表1 肺腺癌病人和普通人群对照中KRAS2 等位基因的基因型频率 肺 腺 癌基因型普通人群 观察数观察数aA1/A1968981.5A1/A2685957.8A2/A215412.7计179152152 a：按普通人群的频率推算所得 ，P=0.025 n因此，提示人群中A2/A2基因型与拮抗肺癌产生有关。n同时他对肺腺癌的全部存活者进行了随访研究，发现：n携带KRAS2A2等位基因的患者平均生存期：56个月n携带A1/A1纯合子基因型的患者：30个月 表明具有A2等位基因型的患者预后较好。 (二二)危险因子致病机制的研究危险因子致病机制的研究 n癌症

11、发病的分子流行病学研究是个典型的例子。n肿瘤的病因十分复杂，是环境和宿主多因素作用的结果。从分子水平看，肿瘤的发生与发展与癌基因激活和抑癌基因失活密切相关。但究竟是哪些危险因素起作用，其作用机制是什么？分子流行病学研究将会提供进一步的证据。n例如，大量的流行病学调查显示，黄曲霉毒素（AFT）是肝癌发生的主要危险因素。n进一步的分子流行病学研究发现，AFT可在体内氧化酶的作用下，形成AFT环氧化物，其易与肝细胞内的DNA分子N7鸟嘌呤残基结合，从而造成DNA的损伤。n另外，研究还发现肝脏解毒酶之一，谷胱甘肽转硫酶（GST）在肝癌患者的肝组织中的T1基因缺失比例远远高于对照组。 (三三)疾病易感性

12、的测定疾病易感性的测定 n近来分子生物学与免疫学研究发现，如同传染病一样，机体对慢性病也同样存在着易感性，且往往与个体的某些基因型别或序列或其表达产物有关，如果与遗传有联系，往往称之为遗传易感性。 举例：n1987年国外学者发现了一种新的病症，家族性载脂蛋白-100缺陷，由于其低密度脂蛋白受体结合力下降，发生高脂血症。n结合力下降是由于载脂蛋白-100第10、708位碱基突变所造成建立了等位基因特异性PCR检测这个突变位点的试验进行了流行病学研究，显示此突变携带者中，50岁时男性40%、女性20%患冠心病n表明这些携带者为冠心病的易感者 n很多传染性疾病的发生也存在易感性问题，除了与能刺激机体

13、产生特异性抗体的致病微生物有关外，也和机体的某些基因类型有联系，因为后者决定了机体对致病微生物的免疫反应的方式与强度。 (四四)流行规律的研究流行规律的研究 n这方面研究最多的是传染病。n在传播范围的确定，传播途径的判断与传染源的追索方面，分子流行病学可以发挥无与伦比的作用。 1.传播范围的确定 n按照传染病流行病学基本理论，在一次爆发或流行中，其受染范围的确定应根据如下原则：在爆发或流行期间，有共同或有效暴露史，经过一个平均潜伏期发病或出现急性感染的生物学标志可判定为受染者，然后总计受染人员，结合这些人员活动的区域以确定受染或流行涉及范围。n可是，过去测定的生物学标志主要是属于血清学、免疫学

14、、微生物学范围，缺乏基因型标志，因而可能出现错误的判断。 举例：n以色列海法市(Haifa)Rambam医学中心的急性乙型肝炎爆发的分子流行病学调查就是典型的一个例子。n1986年6月7日至26日有4例暴发性乙型肝炎(患者-)入院，均死亡；n8月17日又有1例(患者)同样入院后病故n经过血清学调查又发现1例亚临床乙肝(患者)。 流行病学调查发现：n患者-于同年4月23日至6月28日同住在一个病房，有共同暴露史，经描述性与分析性流行病学调查，确定这是一次乙肝的爆发流行；n传播时间很可能在4月29日；n传染来源为一名HBsAg携带者，当时也住在同一病房。 n研究者此后又考虑到病人在此爆发中5名均为

15、致死性的暴发性肝炎，且潜伏期非常短；而传染来源，即那名HBsAg携带者为抗HBe阳性的慢性肝病患者，故决心弄清其基因有否特殊的突变。 结果意外地发现n传染源、病人 - 、这6人的HBV的前C区1898与1901位核苷酸均发生了点突变，此外在X、前C与C区还有很多突变；n而患者与4名对照患者(4名该医学中心的急性乙肝)的病毒株却无此突变。 结果提示n 此次爆发是由HBV的突变株引起；n病人不是这次爆发中的病例，引起其发病的病毒株不同于传染源与其他5名病人。 2.传播途径的判定 n以往，传染病流行中传播途径或传播媒介的调查通常使用排除法，同时尽可能在媒介物中分离到引起流行的病原体或检测到病原学标志

16、。近来分子流行病学研究引入了一些新的技术，如分子进化诊断(molecular evolutionary diagnosis)。 例如n不少分析性流行病学研究与血清流行病学研究均认为丙肝病毒可经性传播途径感染配偶。n然而，出人意料的是，有人用分子进化法进行的研究提出了相反的意见。 n筛检50对至少有一方抗HCV阳性的夫妇，发现仅4对夫妇双方抗HCV均阳性。用PCR扩增、测序分型，结果发现： n其中2对配偶男女之间的HCV RNA彼此的基因型别不同；n另2对夫妇之间型别相同，用分子进化诊断判定男女病毒株的分株时间(divergence time)，发现：n第1对配偶的分株时间发生在45-52年前，

17、而结婚却才32年；n第2对配偶分株时间已有30-34年，结婚时间则才25年。 作者认为HCV经性传播的可能性很小 3.传染源的追索 n判定传染来源或两人之间的传播关系应符合如下4条原则：n A(传染源)与B(受染者)的接触是有效接触(暴露)；n 接触发生在A的传染期内；n B的发病时间是在暴露后该病最短与最长潜伏期之间；n A与B受染致病的血清学型别一致。n 如今看来，第条应该用基因型别来代替。 (五五)防制措施的研究防制措施的研究 1. 传染病预防n由于对传播与流行范围的确定，传播途径、传播媒介与因子以及传染来源的推断更为精确，所以提出的控制措施更有针对性，更有成效。n 同时，传染病预防中最

18、可靠的手段是疫苗接种。但在疫苗预防注射方面尚存在一些问题，如接种的效果，接种的副作用。近来由于分子流行病学研究的进展，对一些问题有了比较清晰的了解。 举例：疫苗株引起的感染n如1990年Forsey报告，英国1988年10月开始使用麻疹、腮腺炎、风疹三联疫苗，此后出现3例腮腺炎病毒性脑膜炎；同时在加拿大发现类似病例8人，前西德1人。n作者收集：8名Urabe疫苗株接种者的发病株 6名未接种疫苗的临床病例的病毒株 2种疫苗株(分别为Urabe与Jeryl)n用PCR扩增测序发现，8名疫苗接种者的发病株序列与Urabe疫苗株完全相同，不同于Jeryl疫苗株，也不同于临床病例的野毒株；6株野毒株属于

19、另外一个基因型。n这就从基因水平证实了Urabe疫苗株引起的发病。 2.非传染病的预防n由于分子流行病学不仅研究疾病的危险因素，而且研究其引起疾病整个过程中的所有环节，因此，这就为疾病的三级预防特别是第级预防采取针对性措施奠定了科学的基础。 ( (六六) )其他方面的研究其他方面的研究n除了上述五个方面的研究范围外，分子流行病学在传染病病原体进化、人群健康的影响因素及其遗传背景等方面的研究也将发挥重要作用。 五、分子流行病学怎么干怎么干？ 方法 分子流行病学在某种意义上讲，是一种流行病学宏观与实验室微观结合的方法学，需要现场流行病学调查研究与实验室先进的检测技术相结合。因此，分子流行病学的研究

20、方法大致可以分为二大类：实验室技术与流行病学现场研究方法。 (一一)实验室技术实验室技术 n分子流行病学中使用的实验室技术相当广泛，因为只要检测与致病因子及其致病机制中相关的生化、生理、免疫、分子、遗传等的生物学标志的技术均可被应用于分子流行病学研究。n同时需要指出的是，现今的一些分子技术有可能在将来被取代而废弃。n常用的是：血清学、免疫学、生物化学、分子生物学技术等n常用的技术操作：ELISA，RIA、免疫组织化学、质粒提取、限制性内切酶图谱分析、DNA杂交、多聚酶链反应、分子克隆、核酸序列分析等。( (二二) )现场流行病学研究方法现场流行病学研究方法n在传统的流行病学研究中，结合检测一些

21、生物学标志，以从分子水平更深层次揭示病因联系或致病因子的致病机制，是目前比较常见的分子流行病学研究模式。n目前比较常用的有下面2种 1.巢式(套式、嵌入式)病例对照研究(nested case control study)n运作开始是按队列研究的方式进行：选择一队列，收集基线资料，采集所需研究的生物学标志的组织或体液标本储存备用，然后随访到出现能满足病例对照研究样本量的病例数为止。把这些病例作为病例组，按配比条件，从同一队列中选择1或数个非病例作对照，抽出病例与对照的基线资料并检测收集的标本，进行病例对照研究 2.病例-病例研究(case-case study)n在病例对照研究的病例组中，临床

22、类型可以不同，如脑卒中有出血型、缺血型，冠心病有心梗型、无心梗型；某些生物学标志往往也是不均一的，即部分病例有某种生物学标志，而其余的则没有。n那么就可把不同的临床类型或具有标志的这些病例与无标志的病例，按病例对照研究的方式处理资料，以探讨不同临床类型的危险因素的差异或者这个生物学标志与该疾病的其他危险因素之间的关系和相互作用。 传染病研究中的应用传染病研究中的应用 n既往传统流行病学研究已经表明HCV可经微量血暴露而传播，但是传播的确切证据尚难得到。nSuzuki等通过3对发生针刺事故的当事人HCV感染的分子进化分析研究，在分子水平上找到了易感者可经微量血暴露而感染HCV的直接证据，而且为传

23、播途径的流行病学研究提供了新方法，更重要的是使人们看到了分子流行病学研究的意义。n研究者首先通过流行病学调查方法研究了3例由于针刺事故而发生HCV感染的患者(A2、B2 和C2)的详细感染过程。第一对（A1-A2）n第1个指示病例(A1)为1名24岁的因输血而受染的慢性HCV感染的男性患者(抗HCV和HCV RNA均阳性)，受染者(A2)是1名24岁的女护士。 nA2在给A1采血时左手食指被针头刺破，当即鲜血流出，她马上清洗了伤口，并报告了医院。n如何调查？n在事故发生当天检测肝功未发现异常，抗HCV和HCV RNA均阴性。n但2个月后发生了急性丙型肝炎，并转为慢性。 第2对（ B1-B2 ）

24、n第2个指示病例(B1)为1名59岁肝硬化肝癌男性患者(抗HCV和HCV RNA均阳性)，受染者(B2)是1名35岁内科医生。 n当护士给B1抽肘静脉血时，B1肝性脑病发作，护士只好拔出针，并放在病床旁的椅子上，这时B2过来帮忙，不慎坐在该椅子上深度扎伤左臀部。n虽然在以后随访时无明显临床症状，但检测特异性生物学标志发现B2在2个月后发展为慢性HCV感染。 第3对（ C1-C2 ）n第3个指示病例(C1)为1名68岁的肝硬化肝癌男性患者(抗HCV和HCV RNA均阳性)，受染者(C2)是1名43岁无症状HBV携带的护士。nC2在给C1插静脉导管后拔针时扎伤左手中指与无名指间的手掌，当时出现流血

25、，便向院方作了报告。nC2在2个月后发生了急性丙型肝炎，并转为慢型。为了阐明A1与A2、B1与B2和C1与C2之间的传播关系和方向，分子流行病学如何研究？生物学标志n抗-HCV：ELISA法nHCV RNA：巢式RT-PCR法，引物选自5端高保守区 n选择HCV高变异区E2区进行巢式PCR扩增、克隆、测序，然后进行n种系发生分析(phylogenetic tree analysis)n基因序列差异估计(estimation of nucletide sequence diversity)n “靴襻”分析(bootstrap analysis)。n结合计算机辅助分析n种系发生分析显示该3对当事人

26、均为HCV 1b基因型；进化距离非常接近。n“靴襻”分析3对当事人的E2区序列多克隆、多次重复试验结果，并结合统计分析表明：同一对当事人不同的克隆间的序列变异存在着非常密切的同源进化关系。n基因序列差异估计显示来自指示病例不同克隆的序列变异均高于受染者的序列变异：nA1A2=0.075520.01129nB1B2=0.049210.01046nC1C2=0.055960.04950 进一步支持指示病例至受染者的HCV传播方向。 从本研究案例可看出，n传统流行病学研究仅能明确暴露方式与可能的传染源，通过与分子流行病学研究的结合，可进一步从分子水平上为微量血传播提供可靠证据，并精确地判断传染来源。

27、 非传染病研究中的应用非传染病研究中的应用 n近年来，随着分子流行病学的发展，使人们对各类致癌物及其作用于人体后所产生的各种生物学效应和宿主的易感性，尤其是环境和遗传对肿瘤发生的相互作用有了更加深入的认识，从而有利地促进了肿瘤的防治。 n胃癌是人类常见的癌症之一，病因不明。n有研究者采用PCR和原位杂交技术对8例具有重度淋巴细胞浸润的未分化胃癌(淋巴上皮瘤样癌)标本中EB病毒（EBV）基因组进行了检测，7例EBV RNA呈阳性，并均匀分布于癌组织的不同细胞中。n在反应性淋巴样浸润和正常胃粘膜组织中未发现EB病毒。 n随后，在研究胃淋巴上皮瘤样癌的过程中，无意中发现在1例典型胃腺癌的癌组织中也存

28、在EBV RNAn因此他们又将研究扩大到典型的胃腺癌上，结果发现16(22/138)的典型胃腺癌标本中的癌细胞和癌旁非典型增生上皮细胞均存在有EBV分子n但在其周围的淋巴细胞、其它正常基质细胞、肠化生和正常胃粘膜中未检测到EBV基因。 n随后，对970例连续胃癌病例的999份癌组织标本进行原位杂交检测，6.9EBV RNA呈阳性。n进一步研究发现淋巴细胞浸润明显的胃癌，EBV几乎均为阳性，而在癌旁与非恶性瘤组织中EBV均为阴性。 n采用限制性片段长度多态性分析（RFLP）方法进行分子流行病学研究发现，73例与EBV相关的胃癌病例中，51例为A亚型EBV株, 4 例为B亚型。n与日本当地的健康人

29、群中流行株分型比例一致。 n这些研究结果有利地提示了EB病毒感染是胃淋巴上皮瘤样癌和部分胃腺癌的可能病因之一。 环境与健康研究中的应用环境与健康研究中的应用 n目前环境铅污染对人类的健康造成了很大的威胁，我国学者应用现场流行病学和分子流行病学方法在这方面进行了长期有效的探索。 n首先为了使暴露标志得以精确测量，研究者采用了末梢血对研究对象进行血铅测定。n在此基础上，应用不同的研究方法研究了铅对儿童健康影响。 n研究中发现，上海市某工业区内273名学龄前儿童的血铅水平均值为218gL，高于250gL的比例是30.75（儿童铅中毒诊断标准为100gL）；n血铅和身高(长)及体重之间也有显著的负相关；n高铅组总智商、操作智商和语言智商显著低于低铅组； 提示铅暴露水平能影响儿童的体格生长和智能发育 n研究者采用前瞻性研究的方法对胎儿期铅暴露与婴儿发育关系进行了探讨n以脐带血铅水平作为胎儿期铅暴露标志，调查了348例孕妇分娩时婴儿脐带血铅水平，发现婴儿出生时脐带血铅水平明显高于儿童铅中毒诊断标准。n通过婴儿出生时脐带血铅水平的测量将研究对象分为高铅组和低铅组进行跟踪随访n测量儿童的身长、体重和头围，测定儿童Bayley婴儿发育量表的精神发育指数(MDI)和心理运动发育指数(PDI)n结果表明：铅的暴露水平确能对儿童的神经