扫描电镜与透射电镜样品制作完全版

1、相关仪器的信息： 透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号） TEM，产地：日本 超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克 临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本 真空喷镀仪：Eiko IB5 ion coater，产地：日本 包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USATEM样品包埋块制作有关注意事项一、 取材：1、动作迅

2、速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态；2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织；3、组织块大小：一般要小于1mm3。二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中2、使用锇酸的注意事项I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中

3、操作，废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。脱水过程中应注意：I 逐级脱水而不能急剧脱水；II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4保存。五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增

4、塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。包埋剂配制及使用过程中的注意事项：I 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的；II配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；III配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10-20冰箱中，延长其使用期。表1 戊二醛溶液的配制终浓度1.01.52.02.53.04.05.00.2M PBS/ml5050505050505025%戊二醛水溶液/ml46810121620重蒸水加至/ml100100100100100100100表2 0.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制A液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液B液

5、：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 Na2HPO4 28.4g 或Na2HPO4.H2O 31.61g或Na2HPO4.2H2O 35.6g 或Na2HPO4.7H2O 53.63g 或Na2HPO4.12H2O 71.64g加双蒸水至1000mL NaH2PO4 24.0g 或NaH2PO4.H2O 27.6g 或NaH2PO4.2H2O 31.21g加双蒸水至1000mL按下表比例混合A、B液后，配成0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方pH值5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0A液8.0 12.3 18.5 26.5 37

6、.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7B液92.0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。表3 多聚甲醛-戊二醛固定液的配制溶液名称剂量10%多聚甲醛溶液20ml0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液50ml25%戊二醛水溶液10ml重蒸水20ml表4 2%锇酸溶液的配制试剂用量锇酸/g1重蒸水/ml50表5 Spurr包埋剂配方药品名称硬配方软配方我们现用的配方VCD树脂10g10g10gDER7366g7g8gNSA26g26g26gDMAE

7、0.4g0.4g0.4g注：通过改变DER736的用量可以调节包埋剂的硬度。DMAE的用量则调节聚合反应的速度。透射电镜样品制备程序：No.1 包埋切片样品的制作过程样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜，然后按下列步骤处理样品：² 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；² 用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；² 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；² 用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100

8、%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min。² 用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；² 用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；² 纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察。1).Double fixation: The specimen was first fixed with

9、 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15min; then postfixed with 1% OsO4 in phosphate buffer (pH7.0) for 1hour and washed three times in the phosphate buffer.2).Dehydration: The specimen was first dehydrated by a g

10、raded series of ethanol (50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%) for about 15 to 20 minutes at each step, transferred to absolute acetone for 20 minutes. 3). Infiltration: The specimen was placed in 1:1 mixture of absolute acetone and the final Spurr resin mixture for 1hour at room temperature, then trans

11、ferred to 1:3 mixture of absolute acetone and the final resin mixture for 3hours and to final Spurr resin mixture for overnight.4).Embedding and ultrathin sectioning: Specimen was placed in capsules contained embedding medium and heated at 70 for about 9hours. The specimen sections were stained by u

12、ranyl acetate and alkaline lead citrate for 15 minutes respectively and observed in TEM of Model JEM-1230.No.2 负染样品的制作（以细菌为例）Negative staining of bacteriumThe bacterium suspension was stained by 1 to 2%solution of phosphotungstic acid (PTA，磷钨酸) in a pH range of 6.5 to 7.0 for 15 to 30 seconds. Then,

13、 the bacterium was observed in TEM of Model JEM1230.扫描电镜样品制备方法样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜，然后按下列步骤处理样品：  倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；²  用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；²  倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；²  用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，

14、每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20² min。  用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。²  临界点干燥。²  镀膜，观察。²处理好的样品在荷兰Philips公司的XL30ESEM型环境扫描电镜中观察。Spurr低粘度包埋剂ERL-4206 2.5gNSA 6.5gDER-736 2.0gDMAE 0.1g前三种试剂混合均匀后，加入DMAE，充分混合。按每个样品2.5g的用量配制。70聚合8h以上。干脆把透射电

15、镜样品的制备方法一起发了：透射电镜样品制备方法样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜，然后按下列步骤处理样品：  倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；²  用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；²  倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；²  用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到

16、纯丙酮处理20min。²  用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；²  用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；²  纯包埋剂处理样品过夜；²将经过渗透处理的样品包埋起来，70加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15min，即可在*JEOL公司的JEM-1230型透射电镜中观察SEM需前处理样品制备过程中的注意事项I 取材：1cm3左右即可，不需要象T

17、EM样品那么小；II脱水：样品较大，脱水时间可适当延长；III临界点干燥：一般采用液体二氧化碳为置换液，二氧化碳与乙醇或丙酮互溶性较差，而与醋酸异戊酯互溶液性较好。因此，样品脱水后需逐渐过渡到醋酸异戊酯溶液中浸泡，以便置换存留于组织中的脱水剂。注意：醋酸异戊酯挥发性较强，应在通风橱中操作，废液用密闭容器装好后丢弃。IV 金属喷镀：新鲜样品自身就可导电，而经过干燥的生物样品不能导电。这种不导电的样品在SEM中观察时，会产生电荷积累而影响观察稳定性。使样品导电的方法通常是在样品表面喷一层厚度约100埃的金膜。No.1直接观察的扫描电镜样品I 样品粘附在样品台上，在Eiko IB5型离子溅射仪中喷镀

18、4-5min。II样品在荷兰Philips公司的XL30型ESEM（环境扫描电镜）中观察。The specimen was coated with gold-palladium in Eiko Model IB5 ion coater for 4-5min and then observed in Philips Model XL30 ESEM.No.2需前处理的SEM样品制备程序样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜，然后按下列步骤处理样品：² 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；² 用1%的锇酸溶液固

19、定样品1-2h；² 倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；² 用梯度浓度（包括50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min。² 用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（V/V=1/1）处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。² 临界点干燥。² 镀膜，观察。处理好的样品在荷兰Philips公司的XL30型环境扫描电镜中观察。I Double fixation: The specimen was first fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer (pH7.0) for more than 4hours; washed three times in the phosphate buffer, once for 15m