9生长激素生物活性的测定方法中国药品检验标准操作规范

1、生长激素生物活性的测定方法 一、去垂体大白鼠体重法 1 实验材料及用具 1.1 天平精度 0.01mg供试品称量用 精度 1mg 试剂称量用 精度 0.1g 大鼠称重用 1.2 实验用具手术板、注射器（1ml,精度 0.01ml）、吸管、移液管、带塞玻璃小瓶、 烧杯、玻璃棒、量筒、脱脂棉。 1.3 手术器械手术剪、直镣、眼科剪、眼科直镣、眼科弯剪、牙科钻、钻头、抽滤瓶、真空泵、牙科刮勺、止血钳。 1.4 试剂氯化钠、牛血清白蛋白、乌拉坦。 2 溶液配制 生理盐水称取氯化钠适量，加水配成 0.9%的溶液。 牛血清白蛋白的生理盐水溶液，称取牛血清白蛋白适量，加生理盐水配成 0.1%的 牛血清白蛋白

2、的生理盐水溶液，简称溶媒。 乌拉坦溶液称取乌拉坦适量，加生理盐水配成 25%的乌拉坦溶液。 标准品溶液 实验当日，取生长激素标准品，放置至室温。 割开安瓶（注意勿使内容物损失）立即按标示效价精确加以定量溶媒将全部内容 物洗出，使成 1.0IU/ml的标准品溶液；亦可精密加入适量溶媒使溶解，混合均匀，精密吸取适量，用溶媒配制成 1.0IU/ml的标准品溶液。 标准品稀释液 按中国药典附录生长激素生物检定法的要求，选择标准品高（ds2）、低（ds1） 2 组剂量及剂距。 计算 2 组剂量稀释液浓度及大鼠 6 天内皮下注射的总毫升数，一般高浓度稀释液 可配成每 1ml中含 0.100.25IU （随

3、季节、 动物品系和来源不同） ， 低浓度稀释液可配成每 1ml中含 0.0250.06IU,高、低两浓度比值 r=1:0.25,每鼠皮下注射每天 0.5ml/次，连续 6 天，每组至少 8 只，例如： 高浓度稀释液 ds2=0.1IU/mlx0.5ml/（天.鼠）X6 天 X8 鼠/组=2.4IU/组， 即 0.1IU/ml高浓度稀释液 24ml 低浓度稀释液 ds1=0.025IU/mlx0.5ml/（天.鼠）X6 天 X8 鼠/组=0.6IU/组， 即 0.025IU/ml低浓度稀释液 24ml 精密量取 1.0IU/ml标准品溶液适量， 置 50ml烧杯中， 加入溶媒适量成标准品 ds2

4、稀释液 （如0.1IU/ml）。 同法用 ds2标准品稀释液（如 0.1IU/ml）配制成低浓度稀释液 ds1溶液。 供试品溶液按生长激素供试品的标示效价或估计效价（AT）配制溶液。 粉末 . 取生长激素粉末，放置至室温。 . 迅速精密取适量，置带塞玻璃瓶中。 . 将称量的毫克数，乘以标示单位数，得总单位数。 . 精确加以定量白溶媒配成 1.0IU/ml的供试品溶液。 . 精密量取上述溶液适量， 同标准品溶液的释液方法， 加溶媒生理盐水配成相应的高 （dT2）、低（dT1）两浓度供试品溶液。 注射用粉针 . 取供试品放置至室温。 . 割开安瓶（注意勿使内容物损失）立即精确定量加溶媒将全部的内容

5、物洗出，使成1.0IU/ml的供试品溶液。 . 精密量取上述溶液适量，同标准品溶液的释液方法，加溶媒配成相应的高、低两浓度供试品溶液。 . 将标准品和供试品高、低浓度稀释液按每天剂量分装入带塞玻璃瓶中并密封，置-15C 以下保存。 3 实验动物同一来源、品系，出生 2628 天，体重 6080g,同一性别、健康的大白 鼠，试验前 23 周无菌条件下，25%乌拉坦溶液（0.3ml/100g 鼠）腹腔注射麻醉，手术摘除脑垂体，迅速缝合，每只鼠编号记录体重，手术后于清洁级以上动物室饲养使其恢复，备用。 4 检查法 2.5 准备鼠盒，标明组别。 2.6 实验当日称量体重，剔除体重变化大于手术后一周时土

6、 10%的大白鼠。 2.7 选择体重合格大白鼠按体重随机分组，每组 8 只，每只鼠编号并记录体重，正常供给饲料及饮水。 2.8 每天临用时将配好的标准品或供试品稀释液在注射前取出融化，放置至室温。 2.9 按组别分别给以标准品或供试品高、低 2 种浓度稀释液，每鼠 0.5ml,每天 1 次， 连续 6 天，每天应该安排在相同的时间内注射，或分 6 次注射的间隔时间应接近。 2.10 皮下注射勿使药液溢出，每次注射要调换部位，如第一次给药自一侧颈部皮下进针，第二次，第三次在另一侧或中央进针，将药液注入不同部位，每次注射后清洁鼠盒。 2.11 最后一次注射后 24!h,按给药次序脱颈处死大鼠。 2

7、.12 称大鼠体重。 2.13 对可疑大鼠可进行尸检，切开蝶鞍区，肉眼检查有无垂体残留，剔除有垂体残存的动物。 5 实验结果计算 计算每只动物反应值（y）,即体重变化 y=给药后体重-给药前体重。 将反应值实验结果按“生物检定统计法”（中国药典附录 XIV）中的量反应平 行线测定随机设计法列表的格式整理。 按量反应平行线测定（2.2）法或（2.2.2）法随机设计处理结果。 编制程序，用计算机计算效价、实验误差。可靠性测验应通过，本法可信限率 FL（%）不得大于 50%。 计算也可用手算进行可靠性测试，实验结果成立者，进行以下计算。计算 M、R、 PT、Sm、FL、FL%。 实验结果中出现的特大

8、、特小等特异反应值，按中国药典规定判断其是否可以剔除，个别剂量组缺失的数据，如符合药典附录要求，按所规定的方法补足。 6 结果判断 生长激素（2.2）法或（2.2.2）法的可靠性测验应为剂间，回归变异项非常显著，偏离平行，二次曲线，反相二次曲线不显著，否则实验结果不成立。对实验结果不成立者应做以下检查。 检查实验操作包括溶液配制，注射，对实验动物的照顾等是否符合本法的实验要 求。 剂间、回归不显著，S、T或 U 的反应不在对数剂量-反应值线范围内，应根据反应结果，重新调整剂量复试。 可靠性测验通过，实验结果成立，若试品间变异显著时，可根据 S和 T各剂量组 的反应情况调整剂量以减小实验误差。

9、T或 U 各剂量组反应彳 1 明显高于 S剂量组时，可调低 T 或 U 的剂量，或提高 T 或 U 的估计效价。 T或 U 各剂量组反应彳 1 明显低于 S剂量组时，可调高 T 或 U 的剂量，或降低 T 或 U 的估计效价。 实验误差（FL%）的判断按药典规定，FL%超过者，可做以下处理。 检查动物来源，实验操作，对动物的照顾等是否符合本法的实验要求。 重复实验。 按规定将几次实验结果合并计算，求得合并计算的效价及实验误差，应符合规定。 二、去垂体大白鼠胫骨法 本法与去垂体大白鼠体重法的标准品与供试品溶液配制与稀释、检定法和实验结果计算 一致，并常与体重法同步进行。增加和不同之处有以下。 1

10、 实验材料及用具 试剂甲醛、丙酮、硝酸银、硫代硫酸钠、乙醇，其它与体重法相同。 实验用具刀片、载玻片、腊板、带有测微尺的光学显微镜，60W 台灯，其它与 体重法相同。 2 溶液配制 甲醛称取甲醛适量，加水配成 10%的溶液。 硝酸银称取硝酸银适量，加水配成 2%的溶液。 硫代硫酸钠称取硫代硫酸钠适量，加水配成 10%的溶液。 乙醇量取乙醇适量，加水配成 80%的溶液。 3 检定法 体重法实验结束后，处死的大鼠取下左右二只后腿。 剪开皮肤及肌肉，剥离出胫骨并标号。 将胫骨从近心端顶部中间沿矢状面切开并置 10%甲醛保存。 脱蛋白将胫骨水洗 10min后，置丙酮中 10min。 染色将胫骨水洗 3

11、min,置 2%硝酸银中染色 2min。 水洗一次后置水中台灯下强光照射至胫骨变棕黑色。 固定将胫骨置 10%硫代硫酸钠中固定 30s。 保鲜将胫骨置 80%乙醇中供测量用。 切片将胫骨沿刨面切 1mm左右薄片。 薄片置光学显微镜下测量胫骨骨髓板宽度作为反应值。 4 实验结果计算与体重法一致。 注意事项： .动物取幼年（体重 6080g）大白鼠，以消除内源性生长激素的干扰；一般用雄性，较为敏感。 .垂体切除术 麻醉：25%乌拉坦溶液（一般 0.3ml/100g 鼠重），要求浅麻，术后即能苏醒。 钻孔：大白鼠平躺于大鼠架上，固定 4 肢及嘴部，沿颈部中线近下腭处，用剪刀剪一长 约 12cm的切口

12、，将领下腺向左右两侧分开，右侧处皮用止血镣夹住后，向外侧拉开，即可清楚见到覆盖于气管的胸甲状肌，在此肌左侧近咽部处，用眼科弯镣层层分离肌肉直到触 及骨板。然后用小锐匙或用眼科弯镣夹住小棉球除净附着于骨板上的肌肉，在咽部正下方、左右两听囊之间，可触到一“丁”形突起，用小棉球将“丁”形附近及突起部位的肌肉全部 擦干净，即可清楚地见到“丁”形突起。在横突起上有一条深蓝色横肉线（蝶枕软骨联合） 在此横线上方 1mm中间处用探针刺一小凹孔，然后将手钻（用牙科钻头，固定在用过的圆珠笔芯上）固定于此凹孔处，轻轻旋转手钻，避免用力过度和下压，尤其在第一层骨片被钻破后，进行第二层骨片钻孔时，尤需注意。当手上感觉

13、孔已钻通，即用一小针进入孔内试探，若无任何阻碍，则进行垂体吸取，钻孔以与横线相切最为理想。 垂体吸取将一端与抽气瓶相连的垂体吸取管对准钻孔，开动抽气泵，吸取垂体，待垂体吸出后，用棉球擦干血液，立即将皮肤切口缝合，并给动物编号、称重。同一批实验的动物，垂体切除术应在 3天内完成。 在切除手术过程中，如动物出现窒息现象，可立即用一玻璃吹管插入动物喉部，有节奏 的向气管内吹气，进行抢救。 环境：要求二级实验室以上并室温在 2426C,否则需注射青霉素抗感染。 饲养：术后大白鼠喂饲标准饲料并饮 5%葡萄糖水至少 3 天。 剔除：去垂体手术后第 1 周为恢复期，从第 2 周起称重并记录，并每隔 1 天称

14、重 1 次直至给药实验前，及时剔除掉体重变化大于手术后第 2 周的第一天土 10%的大白鼠，即选择给药实验前大鼠体重变化小于手术后第 2 周第一天体重土 10%的合格健康动物，按体重均匀随机分组。 3.胫骨法切片、染色、测量实验条件应一致，用带有测微尺的光学显微镜测量骨髓板宽度。 起草人：李湛军（中国药品生物制品检定所）3、真真的心，想你；美美的意，恋你；暖暖的怀，抱你；甜甜的笑，给你；痴痴的眼，看你；深深的夜，梦你；满满的情，宠你；久久的我，爱你! 4、不管从什么时候开始，重要的是开始以后不要停止；不管在什么时候结束，重要的是结束以后不要后悔。爱情来了，你还在犹豫么？ 5、美女，我注意你好久

15、啦，就是不知道怎么表白。我翻来覆去，思来想去，最终想到一个大胆的办法，我要俘虏你的心，让你爱上我。爱上了吗？ 6、对你的爱意，早已飞过万水千山，飞到你眼前，请你睁开眼，仔细看认真听，我的眼睛为你明亮，我的嗓音为你歌唱，来吧，让我们一起舞动爱情之歌! 7、爱你没商量，你的眼睛眨一下，我就死去，你的眼睛再眨一下，我就活过来，你的眼睛不停地眨来眨去，于是我便死去活来! 8、因为深爱，找不到词汇诠释，因为深爱，找不到言语概括，因为深爱，只能发条短信，轻声说一声我爱你”这不是三个字，而是一辈子! 9、我对你的心是鲜啤酒，清澈甘冽；我对你的情是葡萄酒，味美甘甜；我对你的爱是刀烧酒，热情浓烈；醉倒在怀，无限

16、爱恋。 10、人生短短几十年，不要给自己留下了什么遗憾，想笑就笑，想哭就哭，该爱的时候就去爱，无谓压抑自己。人生的苦闷有二，一是欲望没有被满足，二是它得到了满足。 11、一片琼花天庭落，万里江山披银河，冰凌也有相思苦，写意窗花含泪说，昙花一现夜梦短，早有晨光盼春歌。想你，我的心会和你一起启程，祈祷每一个黎明。 12、戒指好比爱情，戴在手上，也是戴在心上；伤在心上，便也伤在手上。不敢碰的，是那心里的伤；不愿摘的，是那难舍的爱。 13、在追求爱情的列车上，透过车窗，可以欣赏到许多优美的景色，但是，请不要留恋，因为终点站才是真正的目的地。但愿我能够成为你永远的终点站! 14、爱一个人真的好难，让我欢喜让我忧！如果不让我去爱你的话，我会更难受，更彷徨。所以为了我自己，我还是爱着你吧! 15、诚挚的微笑，每一次心跳，或许寂然无声，却胜过虚幻的海誓山盟；真情的碰撞，灵魂的契合，或许不够浪漫，却胜过无数的真情告白。 16、此时此刻我又想起了你，想你的感觉是一种酸酸的痛！不能打电话告诉你，只想用文字亲