发酵液中透明质酸的分离纯化方法

1、发醉液中透明质酸的分离纯化方法摘要：微生物发酵法是生产透明质酸的主要方法，透明质酸微生物发酵液中往往都含有蛋白质、核酸等杂质1,分离纯化是发酵法制备高分子量、高纯度透明质酸的关键环节，因此需要分离纯化。只有高纯度的透明质酸才能更好的发挥其工业效用，但是分离纯化的方法却多种多样。目前主要方法有过滤法、凝胶层析法、离子交换层析法等，而不同的方法又将导致操作、成本、和纯度的不同。因此本文将从多方面多角度综合分析各种透明质酸分离纯化方法。本文探讨了透明质酸发酵液的特性和分离纯化过程中工艺条件对透明质酸分子量和结构的影响2,对预处理、分离、纯化各阶段的工艺方法进行了系统比较和分析3,指出了透明质酸分离纯

2、化工艺中存在的问题，并提出了今后分离纯化研究的重点关键词：透明质酸；发酵液；分离纯化工艺一、透明质酸介绍透明质酸(Hyaluronicacid,简称HA)又名玻璃酸，是一种由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸为结构单元的酸性高分子粘多糖。HA具有许多天然多糖共有的性质：呈白色，为无定形固体无臭无味，有强吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂。它是一种国际上公认的生物大分子保湿剂用于眼科显微手术、关节炎治疗、高档化妆品、食品添加剂等领域。二、透明质酸的作用1在临床医学方面眼科由于透明质酸分子为高分子化合物，不具抗原性，不致敏,不发生免疫反应，无热原性，无色透明，无胶质渗透作用，具有高赫性和高弹性，理

3、化性质稳定透明质酸可广泛的应用于滴眼液、干眼病的治疗、青光眼的手术、白内障的手术、泪道探通术和一些眼外伤手术4。(2)骨科HA在骨科领域主要应用在关节疾病中。5HA是构成关节软骨和滑液的主要成分，关节中的HA主要是由滑膜细胞及单核吞唆细胞合成6。(4)药物透明质酸与甲壳素制成缓释、控释材料既具有透明质酸的豁膜薪附作用，同时有甲壳素的渗透促进效果7,8。它们联合使用在体外试验中表现出缓释和促进药物吸收利用的特点9,10,112在化妆中的应用透明质酸具有特殊的保水作用，高分子量的透明质酸最多可以持水6L/g,因而是一种理想的天然保湿因子。它可以改善皮肤的营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、

4、防止衰老(1)保湿作用HA在低相湿度(35%)下的吸湿量最高，吸收的水分是其它物质的1.5?6倍，而在高相对湿度(75%)下的吸湿量最低，吸收的水分仅为其他物质的1/25/6.。这种独特的性质，正适应皮肤在不同季节、不同环境湿度下对化妆品保湿作用的要求。HA作为保湿剂较少单独使用，常与其他保湿剂配合使用。(2)营养的作用HA是皮肤固有的生物物质，外源性的HA是对皮肤内源性HA的补充。分子量较小的HA可渗入皮肤表皮层，促进皮肤营养的供给和废物的排泄，从而防止皮肤老化，起到美容和养颜的作用。(3)皮肤损伤的修复和预防作用庚肤受到阳光暴晒所引起的光灼伤或日灸，如皮肤变红、变黑、脱皮等，主要是阳光中的

5、紫外线的作用。HA通过促进表皮细胞的增殖和分化，以及清除氧自由基的作用，可促进受伤部位皮肤的再生12。其作用机制与防晒霜中常用的紫外线吸收剂不同。因此，在防晒护月品中HA与紫外线吸收剂混合使用，具有协同作用，可同时减少紫外线的透过和对透过的少量紫外线所造成的皮肤损伤进行修复，起到双重保护作用。皮肤遭受轻度的烧资伤时，表面涂抹含HA的水剂化妆品可减轻疼痛，加速受伤部位皮肤的愈合。(4)润滑性和成膜性HA属于高分子聚合物，具有很强的润滑感和成膜性。含HA的护肤品涂抹时润滑感明显，手感良好。涂于皮肤后，可在皮肤表面形成一层薄膜，使皮肤产生良好的光滑和湿润感，对皮肤起到保护作用。含HA的护发品，可在头

6、发表面形成一层薄膜起到保湿、润滑、护发、消除静电等作用，使头发易于梳理、飘逸自然。(5)增稠性HA在水溶液中具有很高的粘度，其1%的水溶液呈凝胶状，添加在化妆品中可起.增稠和稳定作用,而不会存在油腻感觉。三、分离纯化工艺介绍分离纯化的主要目的是获得纯度较高的HA,目前国内外一般以葡糖醛酸含量表示HA的纯度，保健食品及化妆品级HA的葡糖醛酸含量为35%45%,药用级为42%48%。生物发酵法制得的药用级HA蛋白质含量不应大于0.1%(质量分数)，细菌内毒素限量应小于1EU/mg,溶血率应不大于5%。针对HA发酵液的特性，分离纯化方法很多，在不同阶段所适用的分离纯化技术不尽相同，但总体上分离纯化工

7、艺过程可以概括为如下流程：发酵液一预处理一分离(初步纯化)一纯化一干燥一成品四、预处理预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。对于一些非透明质酸酶缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质酸酶，减少HA分子量的降低。史鹏13等采用两种预处理方式进行灭酶，热处理方式为发酵液在70C下保温1h,静置5h;酸处理方式为发酵液用三氯乙酸调pH值至4.5,1h后回调至6.0,静置5h,两种预处理方式的蛋白质去除率、HA得率很接近，但酸处理的分子量降低率要低于热处理，表明酸处理能更有效的抑制透明质酸酶的活性。杀灭发酵液中的菌体通常加入杀菌剂，常用的杀菌剂包括三氯乙酸、氯仿等。三氯

8、乙酸可以溶解细胞上的脂类物质，使细胞破坏，从而起到灭菌和抑制酶活力的作用。氯仿和三氯乙酸的作用类似，能够使HA逐渐从细胞膜上脱落3,使蛋白质变性沉淀，并能渗入细胞膜，除去细菌内毒素等致炎物质，使HA产品安全性提高14。采用加热进行灭菌，灭菌温度一般为7580C15,国外专利报道，将发酵液加热到90C,再除去菌。通过有效除菌可以改善分离效果，使HA分离得率提高，同时也可以去除部分杂蛋白。除菌的方法较多，祝庆16等比较了微滤除菌和经盐酸、甲醛和三氯乙酸分别处理后再离心除菌的效果，发现微滤除菌效果最好，但微滤过程中需要加压和不断稀释，在后期沉淀阶段需消耗大量有机溶剂，滤速慢也使得整个分离周期延长，因

9、此工业化生产可行性不大。相对于盐酸法、甲醛法，三氯乙酸除菌法HA产量和质量均有提高，这是由于三氯乙酸的加入使HA与蛋白质的络合有一定的解除。邓禹17等采用25g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，以混合硅藻土为过滤助剂，再配以特定的后处理工艺，所得成品透明质酸中蛋白质含量仅为0.047%。周荣清等比较了絮凝、离心、三氯乙酸3种预处理方式对超滤膜污染的影响，所采用的絮凝剂为阴离子型聚丙烯酰胺（AN926）,添加量为100X103mg/mL,絮凝预处理的上清液经超滤后膜通量降低率仅为其它两种方法的1/10,表明絮凝法预处理可以有效除去菌体和杂蛋白，改善膜分离效果。郭育涛等采用发酵液中加入2倍体

10、积的氯仿除菌体的方法，在28C、pH值为7.0的条件下搅拌60min,离心后，HA提取率达97.5%,纯度达97.3%。国外专利报道了采用过滤除去菌体的方法。盛瑞堂等也采用过滤法除去菌体，并发现使用硅藻土作吸附剂时的滤液浊度和终滤液HA收率优于活性炭。在HA发酵结束后，将发酵液加入工业乙醇得到HA粗品沉淀，以20g/L的浓度溶于去离子水，加入硅藻土，充分搅拌以吸附菌体杂质，在pH值4.64.8的条件下过滤，滤液在pH值为4.8时浊度最小，在pH值为4.6时蛋白含量最低，蛋白含量和浊度变化趋势随pH值改变基本一致。过滤法除菌体是物理过程，操作简便，效果明显，并且容易在工业化生产中应用。五、分离提

11、纯透明质酸发酵法生产的HA具有分离精制容易，保湿f生强，品质稳定产量大等优点，目前已得到广泛使用并已成为研究HA生产的主要方向。由于微生物发酵液中提取的透明质酸粗品都含有菌体杂蛋白、核酸等杂质，需要进一步分离纯化。以下简单介绍几种工业上常用的发酵液中透明质酸的分离提纯的方法。181 .过滤法过滤法分离纯化发酵液中的HA是一种简单有效并可以规模化生产HA的分离纯化方法，可以有效地除去菌体和杂蛋白，对分子量的影响相对较小。邓禹等采用25g/L三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，以发酵液质量1.2%的混合硅藻土为过滤助剂，过滤温度为60C,pH为7.0的透明质酸发酵液预处理工艺，完全去除了透明质酸发

12、酵液中的菌体和蛋白质等杂质。采用这一工艺得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%,蛋白质含量仅为0.047%,分子量为190万,提取收率为91.3%。这种方法利用三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，然后以硅藻土作为过滤助剂吸附、截留蛋白质和菌体的透明质酸发酵液预处理方法。2 .凝胶层析法凝胶层析法是生物化学中一种常用的分离手段，凝胶层析是依据不同分离纯化目的和HA分子量大小选择合适的分子筛量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。吴华昌等采用葡聚糖凝胶G-100以0.1mol/L氯化钠溶液为洗脱剂，以HA提取率与纯度为指标，对HA发酵液进行

13、分离纯化，再用醇沉法提取HA,拟达到提高HA提取率和纯度的目的。在优化的凝胶层析条件下，HA提取率达到79.85%,蛋白质去除率为84.93%。3 .离子交换层析法如果采用化学方法从发酵液中分离纯化透明质酸，纯化过程中的pH值、光、热和还原剂等因素易导致其黏度发生不可逆的下降。而在进入HA纯化阶段后，由于离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术已经成为分离提取生物大分子的有效方法。倪杭生等采用强酸型阳离子树脂为交换剂的离子交换柱，和经组氨酸基团修饰的强碱型阴离子树脂为交换剂的离子交换层析柱串联。选择以氯化钠溶液为洗脱剂，在优化的洗脱条件下，对HA粗品进行分离纯化，纯化重量收率为58%61%,

14、分子量近100万19。HA粗品溶液先通过交换柱，其中主要杂质蛋白质是两性物质，在偏酸性溶液中带正电荷，能与强酸型阳离子发生交换吸附而被纯化。六、纯化工艺1 .季镂盐纯化氯化十六烷基口比咤（CPC是一种季俊盐类阳离子表面活性剂，它能与黏多糖分子中的聚阴离子形成络合物，此络合物在低浓度盐溶液中产生沉淀，而在高浓度的盐溶液中逐渐解离，引起HA与CPC复合物解离所需的盐浓度远比其它黏多糖与CPC复合物解离所需浓度要低，利用此性质可达到纯化HA的目的。Cifonelli等早在1957年就对发酵液经浓缩后再用CPC纯化进行了研究。洪水声等向HA粗品溶液中加入等体积的质量分数为4%的CPC溶液，形成絮状物后

15、静置1h,再离心分离，沉淀溶于1.5mol/L的NaCl溶液中，离心除去不溶物。祝庆将乙醇沉淀得到的HA粗品溶于0.05mol/L的NaCl溶液中，加入1%CPC搅拌30min后静置1h,离心收集沉淀后溶于不同浓度NaCl溶液中，发现NaCl溶液浓度为0.35mol/L时HA纯度和产量较高。丁霞将HA粗品溶于0.15mo1/LNaCl中得到0.25%的HA溶液，1倍体积10%CPC熔在0.15mo1/LNaCl中）加入8倍体积的0.25%的HA溶中，通过离心分离CPC沉淀，用0.15mol/LNaCl洗涤，得到较纯的HA溶液。采用CPC进行纯化的优点是操作简单，但CPC回收困难，单位价格较高，

16、所以应用成本较高。十六烷基三甲基澳化镂（CTAB纯化HA的作用机制与CPC相似，但成本相对较低。丁霞等将初步除去菌体和不溶性杂质的提取液中加入CTAB通过离心分离沉淀，并用0.15mol/LNaCl洗涤沉淀，浸泡在1.5mol/LNaCl溶液中过夜，CTAB-HA复合物可解离溶解，最终可得清亮、较纯的HA液体20。盛瑞堂等报道了用CTAB沉淀法从发酵液中分离HA的方法，将发酵液稀释至4.5倍，调节pH值至6.5,加入发酵液体积12%的CTAB溶液（体积分数为10%）,HA的收率可高达97.0%,与乙醇法相比，CTAB法HA的收率提高了2.1%,HA沉淀中杂蛋白的质量分数降低了2.4%,与CPC

17、法相比成本降低了45.2%。可见，采用CTAB法对HA进行分离纯化具有明显优势和很好的应用前景。2 .酶解纯化加入蛋白酶能够使HA与蛋白质的络合状态除，HA更多地游离于溶液中，使其易于纯化。常用的蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，链酶蛋白酶等，链酶蛋白酶对接近糖蛋白质链肽键上的作用效果优于木瓜蛋白酶，而胃蛋白酶的水解作用不够彻底，往往需要配以其它酶才能见效。祝庆等将除菌体后的上清液加入链酶蛋白酶作用2h,乙醇沉淀后再经氯仿除蛋白，HA产量得到了较大幅度的提高，杂蛋白的含量为2.8%,与采用氯仿三次除蛋白后的纯度相当。3 .过滤法纯化过滤法纯化易于实现工业化，能有效滤除菌体和蛋白质，对分子量影响相对

18、要小。盛瑞堂等报道了采用过滤法纯化HA的工艺：将HA粗品以20g/L的浓度溶于水中，加入硅藻土作为吸附剂，调节溶液pH值至4.64.8,在HA粗品溶液中加入10g/L粗硅藻土和3.3g/L细硅藻土为助滤剂，用粗硅藻土和细硅藻土预涂层过滤，然后用H乙-1型滤板过滤，经过超滤后，将滤液用乙醇沉淀并干燥，得到葡糖醛酸含量达44.2%的HA。邓禹等将发酵液经过前处理后，以发酵液质量1.2%的混合硅藻土（粗细硅藻土比为1.5：1）作为过滤助剂，过滤温度为60C,pH值为7.0,再配以酒精沉淀、气浮、酒精造粒的后处理工艺，得到的成品透明质酸中葡萄糖醛酸含量达46.39%,蛋白质含量仅为0.047%,相对分

19、子质量为4 .9X106Da。4 .离子交换层析纯化在进入HA纯化阶段后，离子交换层析等具有选择性吸附特点的层析技术往往被采用。与化学方法相比，离子交换层析分离条件温和，不引起分子结构的变化，己经成为分离提取生物大分子的有效方法。离子交换法用于纯化HA的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件21°Poli等将粗滤后的滤液先后流经阳离子交换树脂和AmberliteIRA900强碱型阴离子交换树脂，杂质吸附在树脂上，HA不被吸附而流出，流出液直接冷冻干燥或减压干燥可得纯度在98%以上的HA,其蛋白质含量为0.3%。Gerard等曾报道了采用DEAE-纤维素、DEAE葡聚糖分离HA的

20、研究，但由于这两种层析剂价格昂贵，限制了在工业上的应用。倪航生等选择经组氨酸修饰的强碱型阴离子树脂作为离子交换剂，以增大HA及其所含蛋白质、核酸等各组分与交换剂相互作用的差异，选择氯化钠为洗脱剂，对HA粗品进行离子交换层析，Z化质量收率为58%61%,相对分子质量近1.0X106Da蛋白质含量为0.075%。5 .凝胶过滤柱层析纯化凝胶过滤层析常在纯化阶段的后期被采用，需要根据不同分离纯化目的和HA分子量大小选择合适的分子筛。丁霞采用SephadexG-25凝胶过滤柱层析分离HA溶液中残留的CPC及其它杂质。洪水声等将发酵液经过氯仿与正丁醇混合液除蛋白、季俊盐(CP。复合物沉淀、DEAE纤维素

21、柱层析后制得的样品，配成质量分数为0.5%的溶液，采用SephadexG-75凝胶过滤柱进行层析纯化，进样量为2.0mL,用蒸储水进行洗脱，洗脱速度为6mL/h,收集洗脱峰并冷冻干燥，HA总收率为59.65%,蛋白质含量为0.075%。六、总结纯度和分子量的高低决定了HA产品国际市场中的竞争力，下游分离纯化工艺是获得高纯度、高分子量HA的关键环节。从发酵液中分离纯化制得高纯度、高分子量的HA,必须充分考虑工艺条件对HA分子量的影响，根据发酵液的特性和分离纯化方法的特点找到合适的分离纯化工艺路线22。发酵液中HA分离纯化工艺研究的重点将是：对分离纯化方法进行遴选、优化组合，精细化操作，降低生产成

22、本，探索适合于工业化生产的下游分工艺路线，在提高HA纯度的同时尽量保持高的分子量；提高分离纯化工艺的安全性，操作上的简捷性，缩短生产周期。参考文献：1 凌沛学.透明质酸M.北京：中国轻工业出版社，2000:11-15.2 JornKaufmann,KerstinMohle,Hans-JorgHoimann,KlausAmold.MoleculardynamicsstudyofhyaluronicacidinwaterJ.Journalofmolecularstructure(Theochem),1998,422:109-121.3埃德加洛厄，崔励才译.透明质酸(英)J.日用化学用品科学，199

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