加单氧酶系及其诱导作用

1、第五节加单氧酶系及其诱导作用84在生物医学领域内，人们对药物在哺乳动物体内经由一定的生化机制进行的生物转化作用，已经给与了极大的关注，对来自哺乳类的细胞色素P450电子传递系统进行了广泛的研究。该系统涉及许多类型药物的氧化作用，例如：芳香及脂肪族化合物的羟基化；N,0和S去烷基化，以及S和N氧化作用。Smith和Rosazza详尽地综述和比较了微生物和哺乳类地药物代谢系统，考虑了所有上述提取的反应以及还原和水解转化、结合作用。目前，在微生物和哺乳类代谢系统中最引人入胜的相似点，或许莫过于它们各自的细胞色素P450均一蛋白加单氧酶系。下面就简要地介绍微生物和哺乳类之间这种外线粒体电子传递系统的异

2、同点，目的在于提供一种对于药物代谢研究中运用微生物模型的明晰的生物化学关系。一、加单氧酶细胞色素P450的重要性哺乳类生物转化过程中I相反应的三种类型是最普遍最重要的。在过去的二十年间，人们对各种类型化合物氧化机理的了解，取得了惊人的进展。Hayaishi的“氧化酶”一书对氧代谢的总体方面进行了详尽的讨论。此后，围绕着氧的活化，氧化酶类的生理功能等机理研究方面研究了许多复杂问题，下面就是近期工作的小结。大多数哺乳类氧化I相反应，都是由细胞色素P450连接主要位于肝脏的加单氧酶，单也存在于肾脏、肺、胃肠道、脾脏和甾体生源器官，如肾上腺皮质、睾丸、卵巢及胎盘。细胞色素P450实际上是一类涉及多种类

3、型化合物氧化代谢活性体系的均一蛋白质，与这种均一蛋白有关的肝脏混合功能氧化酶。在这一光谱基质的氧化作用中需要NADPH和分子氧。通常肝脏的酶固结在膜上，它们出现在当组织消化和差速离心处理所得到的颗粒性的微粒体部分。肝脏P450系统的颗粒本质和相当的不稳定性，使得难于分离，并在纯净状态下工作。通过精巧的电子传递链，包括均一蛋白P450,一种类似于细胞色素P450还原酶的黄素蛋白的作用下，基质的氧化作用就发生了，也需要一种磷脂，如卵磷脂。除肝脏外的细胞色素P450系统常常是水溶性的，在天然基质的氧化中需要一种非均一的铁硫蛋白和NADH,如：甾体化合物即是如此。当分离得到的细胞色素P450,用连二亚

4、硫酸钠处理，就被还原，再用一氧化碳处理，就在450nm的中心峰产生了一差别吸收峰。这样，由Omura和Sato定名为“细胞色素P450”。后来的研究证明了在多种有机化合物的羟基化期间，在分子氧的活化中均一蛋白质是功能性的。存在着许多非常相关的细胞色素，它们可能彼此通过对一氧化碳的差别吸收谱而区别开，其精细差别出现在最大吸收值446和452nm之间，对所有这些均一蛋白质之间的确切功能差别还不完全了解。人们已经付出了相当的努力来探讨通过这种加单氧酶系催化的、尚未揭示的电子传递过程所伴随的氧化作用。细胞色素P450加单氧酶结合基质和分子氧，同还原酶先后两步相互作用到活化氧。最终一个氧原子并入基质，另

5、一个氧原子被还原成水。图36就描述了由P450系统所涉及的基质氧化作用系列循环过程。在这一循环中，形成的P450外来化合物一02三元络合物阐明从细胞色素P450加单氧酶给与的选择性，在该途径中NADPH细胞色素P450还原酶涉及两步序列（二电子），如图所示，也发生了NADH的电子转移，NADH的协同作用、细胞色素b5还原酶和细胞色素b5也在图36表示出来。人们提出这些系统的过氧化氢的偶联和解偶联作用。看来NADPH（和NADPH发生系统）可能被过氧化氢和由某些微粒体混合物及某些纯化了的细胞色素，对某些外来化合物的氧化作用中产生的各种有机过氧化物所取代。显然，这种观察还没有被同等的微生物体系所复

6、现。过氧化物的效应可能支持这种假定的P4502+02-络合物中间体（见图36）。图36外源化学异物经由P450偶联加单氧酶的氧化作用人们相信细胞色素P450加单氧酶系作用于哺乳类的脂肪合芳香族的羟基化，N、0和S去烷基化和某些S和N的氧化作用。一般而言，我们可设想它们由缺少电子的氧原子对基质起反应。芳香族的羟基化经由芳烃氧中间体而完成。在多数情况下，N、0和S脱烷基化作用是不稳定的，以至于它们同时分解为去烷基基质和一种相应的醛。二、微生物的细胞色素P450系统微生物的加单氧酶系也包括细胞色素P450均一蛋白和其它在基质氧化中起本质作用的有关因子。在细菌发现的该酶系同在酵母和真菌中发现的具有很大

7、差别。原核生物看来具有加单氧酶系（即细胞色素P450，黄素蛋白还原酶，非均一的铁硫蛋白），它十分类似于在肾上腺线粒体发现的加单氧酶系，与此相反，真核微生物（酵母和真菌）具有的加单氧酶系更类似于哺乳类肝微粒体中所发现的该酶系。许多微生物细胞色素P450相关本质的情报，已总结于表6。微生物的这些加单氧酶系在如像碳水化合物、脂类、甾醇类和链烷类的中间代谢中起了重要的作用。又如：在固氮过程，生物碱的合成，棒曲霉素的生物合成，0和N脱烷基作用，以及药物的羟基化过程中都起到了很微妙的作用，其奥秘正在一步步地被揭示出来。表6微生物细胞色素P450加单氧酶系一览表菌名加单氧酶组分生理功能基质细菌：Bacill

8、usmegaterium可溶性的P450（CO抑制、NADPH、细菌铁氧还蛋白）脂肪酸的氧化软脂酸Bacillusmegaterium(ATCC13,368)可溶性的P450，巨大氧还蛋白（非均一铁硫蛋白），巨大氧还蛋白还原酶（黄素蛋白）甾体化合物的15R羟基化3氧一A4甾体化合物Corynebateriumsp.(TEl)可溶性的P450，黄素蛋白还原酶，NADH正一己烷氧化正一己烷Nocardia(NIH菌株)P450（均一性纯化，分子量4200045000）,NADH,黄素蛋白还原酶，氧还蛋白及其它分子量的蛋白质可溶性的P446（结晶，分子量440004O去烷基化4烷基苯甲酸盐Pseud

9、omonasputida46000），Putida氧还蛋白（铁硫蛋白，莰酮一5羟莰酮PpG786分子量12500），FAD-NADH-Putida氧还蛋白还原酶，分子量45000。化酶Pseudomonasolcovorans可溶性的P450（CO,差光谱），NADH，红氧还蛋白，NADH红氧还蛋白酶脂肪酸和碳水化合物的氧化十二烷酸己烷Rhizobiumbacteroids可溶性的P446（估计分子量为50000），无磷脂氮还原真菌：Acremoniumsp.3EI微粒体的P450（意指由CO控制），NADPH烷烃氧化乙烷、丙烷、丁烷Clavicepspurpurea微粒体的P450和P448

10、麦角碱的生物合成含14C的色氨酸生物碱Cunninghamellabainieri(ATCC1244)微粒体P450,NADPH，细胞色素C还原酶苯甲醚、氨基嘌吟、硝氨基苯甲醚、萘Cunninghamellaelegans微粒体的P450，NADPH烃氧化作用萘Penicillinumpatulam(CBS384,48)微粒体的P450P455，NADPH，NADPH依存还原酶棒曲霉素的生物合成m甲苯酚Rhizopusnigricans(ATCC62276)微粒体P450lla羟基化孕甾酮酵母菌:SaccharomycescerevisiaeS.cerevisiae微粒体P448，NADH细胞

11、素b5还原酶，NADPH细胞色素C还原酶，脂类因子微粒子P447P448（估计分子量为51000），NADPH，细胞色素C还原酶S.cerevisiaeP450（意指由CO控制），NADPH甾醇代谢像酵母甾醇一样的羊毛甾醇4去甲基甾醇类S.cerevisiaeJYD56微粒体P450,NADPH，黄素蛋白还原酶不饱和脂肪酸和麦角甾醇合成Schicosaccharomycespombe972h微粒体P450，其它细胞色素类Torulopsissp.微粒体的P450（意指由CO控制）,NADPH脂肪酸代谢油酸CandidatropicalisLM7可溶性的P450，NADPH，NADPH细胞色素P

12、450还原酶，溶血磷脂酰乙醇胺类脂氧化C.tropicalis可溶性的P450，NADPH，NADPH细胞色素C还原酶烷烃，脂肪酸氧化十二烷酸、氨基嘌吟、甲苯异丙基苄胺、己巴比妥、乙基吗啡十二烷酸、十六烷、氨基嘌吟、甲苯异丙基苄胺、己巴比妥、乙基吗啡C.tropicalis1-01微粒体的P450，NADPH，NADPH细胞色素C还原酶四十烷和脂肪酸氧化C.tropicalis微粒体的P450，NADPH，NADH脂肪酸代谢联苯（4，羟基化）三、细菌的细胞色素P450系统通常细菌的P450是可溶性的，需要NADH，具有一种黄素蛋白还原酶及一种非均一的铁硫蛋白，呈现很狭窄的基质专一性，类似于甾体

13、生源器官肾上腺线粒体的P450系统。细菌和哺乳类的细胞色素P450系统在其它方面也非常相似。Pseudomonasputida细胞色素P450(P450nm)同苯巴比妥诱导的肝微粒体比较,提供催化活性的竞争性结合和抑制作用，证明了免疫交叉反应。两种细胞色素P450具有相同分子量和氨基酸组成的亚单位。然而，微生物和哺乳类具有不同的基质专一性、可溶性、P450cam系统需要一种铁硫蛋白，而肝微粒体的P450cam系统需要磷脂。已经知道，细菌在电子传递链中所需要的其它成分同肝外细胞色素P450系统是相似的，酵母和真菌细胞色素P450系统非常类似于在肝微粒体中发现的该系统。巨大芽抱杆菌(Bacillu

14、smegaterium)和PS.Putida是最规范的细菌细胞色素P450系统，可以把它们看作是典型的原核生物加单氧酶系。其它研究过的P450都来自于Pseudomonasoleovorans，Nocardia和Corynebacterium。PS.Putida的细胞色素P450cam从被莰酮诱导的微生物细胞中结晶出来。它是一种选择性的氧一和基质*的莰酮次甲基一5exo羟化酶的再活化组分。在基质存在的条件下，P450cam的纯化工作容易完成，该酶系统由两种不同的方法分离。结晶的细胞色素P450分子量是4400046000。这取决于测定的方法。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳指出：蛋白质部分是由

15、简单的多肽组成。加单氧酶系也包括假单胞氧还蛋白。这是一种分子量为12500的铁硫氧还蛋白，含有铁和由无机硫化物两个原子和一个FAD黄素蛋白，NADH假单胞氧还蛋白氧还还原酶。当黄素蛋白和铁硫蛋白供给还原剂时，细胞色素P450被结合和催化莰酮5次甲基的氧化。该铁硫蛋白也参加产物的形成。脸儿硫酸钠和CO处理过的P450cam在446nm处出现一最大的索瑞氏吸收谱。早些时候，Peterson等指出：PPutida莰酮系统被甲吡酮所抑制。这种抑制剂对均一蛋白的结合作用同基质莰酮和由偶联的加单氧酶系摄取的氧所抑制的甲吡酮是竞争性的。已经指出，甲吡酮在肝微粒体P450中是一种典型的II型基质。假单抱菌系具

16、有同P450II型基质相互作用的特征，当存在或缺少莰酮的条件下，发现加入甲吡酮到细胞色素P450，就出现差光谱。巨大芽抱杆菌P450行使脂肪酸氧化和甾体羟基化的功能。发现一种需要NADPH的无细胞甾体15羟化酶系，并由一氧化碳、SKF525A、咪唑和甲吡酮所抑制。所有这些性质说明该系统是依赖于细胞色素P450的。人们发现NaIO4和NaCIO2能够作为对铁酶的氧供体，结果形成一种活泼的细胞色素P450氧合作用类群。在存在这些试剂下的羟基化反应，就可能是典型的依赖于细胞色素P450系统。B.megateriumATCC13,368的这种复杂的加单氧酶系具有下述特征，包括NADPH，称为“巨大芽抱

17、氧还蛋白还原酶”的黄素蛋白还原酶及“巨大芽抱氧还蛋白”非均一铁硫蛋白和细胞色素P450meg。图37表示涉及3氧一A4甾体化合物羟基化的B.megaterium电子传递系统,它同肾上腺线粒体的甾体11p-羟化酶和其它细菌的加单氧酶系形成对照。有趣的是：该系统在组成上是如此的类似，以至于B.megaterium和PS.putida系统的组分名称都出自在肾上腺线粒体所发现的类似组分名称。迄今为止，尚未发现任何同链霉素有关的细胞色素P450加单氧酶系。这是令人意外的。因为链霉素已被证明具有代谢宽泛基质专一性的倾向。Rosazza和Smith研究了一株链霉菌(Streptomycesgriseus)的

18、性质。该菌表现出了对多种特殊基质令人惊叹的代谢能力。使用抑制剂的初步实验表明：加单氧酶系就是中介性的细胞色素P450。该菌株氧化基质的反应类型包括各种芳香化合物的羟基化,海罂兰、罂粟碱、10,11二甲氧啊朴啡和苯甲醚的O去甲基化、海罂兰和d防己碱的N去甲基化；对长春刀灵的烯胺及二聚体形成作用的研究，和对唐松茸卡品(Thalicarpine)代谢物的制备。利用S.griseus的全细胞进行的初步分析实验表明，这种反应可能就是通过细胞色素P450。因为利用苯巴比妥可明显地诱导酶活性，使用甲吡酮可部分抑制酶活性。当然，对全细胞的抑制剂实验须得审慎解释。据称：该菌的无细胞制剂实验有了进展。值得关注的是

19、S.griseus的细胞可以在深度冷冻达6个月以上的贮放而无任何加单氧酶活性损失。这种稳定性和表现出的广泛基质专一性，使得S.griseus系统对研究工作具有特殊而实际的意义。2B.megateriumNADPHPs.PutidaNADHNocardiaNHINADH肾上腺线粒体NADPH巨大氧还蛋白(FMN)还原酶假单胞氧还蛋白(FAD)还原酶黄素蛋白还原酶肾上腺氧还蛋白(FAD)还原酶巨大氧还蛋白假单胞氧还蛋白氧还蛋白肾上腺还原酶P450P450megP450camP450npdP4503 氧一A4甾体一15p羟化酶莰酮一5次甲基羟化酶4 O脱烷基酶甾体11p羟化酶86图37巨大芽抱杆菌、

20、假单抱菌、诺卡氏菌和肾上腺线粒体在基质氧化过程中的电子传递系统四、真菌的细胞色素P450系统没有一种真菌的加单氧酶系像细菌或酵母一样给与确切的定义。一般来说，它存在于细胞匀浆的微粒体部分，本质上是颗粒状的，需要NADPH，涉及宽泛的生理过程，包括链烷的氧化，生物碱和棒曲霉素的生物合成，以及存在有较广谱的基质氧化能力。目前已鉴定的真菌系统类似于肝脏微粒体P450系统的性质。下面提出关于真菌细胞色素P450系统的几个例证，以帮助理解。Ambike等人使用一氧化碳的差示光谱法从真菌麦角菌(Clavicepspurpurea)表明生长培养物的微粒体制剂中证明了细胞色素P450的存在，该菌的加单氧酶系看

21、来，对生物碱的产生有关系。黑根霉(Rhizopusnigricans)含有一种细胞色素P450，它在孕甾酮的11a羟基化中具有重要意义。一氧化碳抑制该微粒体制剂，同时450nm的紫外光回复了这种抑制，并由CO差示光谱确证了细胞色素P450的存在。真菌Acremonium氧化乙烷为乙酸就是依赖于细胞色素P450，其反应为NADPH激活，并被一氧化碳所抑制。在105000g对Penicilliumpatulum离心，得到两部分制剂。二者都需要氧，NADPH和一种氧化甲苯酚的还原酶，该加单氧酶系为一氧化碳所抑制，并且这种抑制作用被450nm最大光谱的光化学反应的光所作用，而成为可逆的。各种类型的细胞

22、色素P450可能涉及氧化甲苯酚为2,5二羟基甲苯或3羟基苯甲醇。Ferris等研究了班尼小克银汉霉(CunninghamellabainieriATCC9244)的加单氧酶系，使用该真菌的细胞进行转化，发现其加单氧酶系活性几乎同肝脏加单氧酶系所得结果相同。在存在环氧水合酶的条件下，萘被转化成为反式二氢二醇。a和R萘酚的混合物比率为9:1，这接近于使用哺乳类系统的体外体内实验结果。利用这株微生物也观察到了苯甲醚的2和4羟基化以及0去烷基化。但是，成为的比率同哺乳类比较是不相同的。它们对弯抱菌(Curvularia)也进行了广泛的研究，证明对氨基嘌呤的去甲基，对4硝基苯苯甲醚的0去烷基的氧化能力，

23、以及还原硝基和偶氮基。该菌的酶系统类似于肝微粒体的加单氧酶系。研究发现需要NADPH和分子氧，被SKF525A和甲吡酮所抑制，不被氰化物抑制，这就证明了细胞色素P450的存在。该菌的微粒体制剂在450nm的最大吸收呈现出C0的差示吸收谱，这就清楚地证实细胞色素P450加单氧酶系的存在，此外，一株雅致小克银汉霉(Cunninghamellaeldgans)类似的细胞色素P450也已经被鉴定。五、酵母的细胞色素P450系统酵母的细胞色素P450以被研究了许多年。各种类型的酵母含有可溶性的或颗粒性的细胞色素，它们一般都需要NADPH，这是一种黄素蛋白还原酶。在有的情况下对整个加单氧酶来说为一脂类成分

24、。对真菌和肝微粒体而言，酵母氧化相当宽泛的基质，它代谢如脂类和脂肪酸这样的化合物，以及如苯巴比妥、乙基吗啡、甲苯异丙基苄胺和氨基嘌呤这样的药物，一般来说，酵母的细胞色素P450加单氧酶系比真菌类似的系统具有更复杂的含义。热带假丝酵母(Candidatropicalis)就是一例证。它生长在四十烷碳源上，收获细胞经用一种压力装置崩解，使之释放P450。得到三个部分：细胞色素P450，NADPH细胞色素P450还原酶和一种热稳定性的脂类组分。对脂肪酸和其它基质，包括药物的氧化作用，NADPH和分子氧一起，所有这些都是必需的。值得注意酵母还原酶和脂类都可被鼠肝微粒体相应的组分所替代。因为该物质在lO

25、OOOOg不沉降，所以把它看作是可溶性的细胞色素P450。还报导了另外一株热带假丝酵母类似的加单氧酶系。有趣的是，还报导了其它两株热带假丝酵母的加单氧酶系，呈现颗粒状的性质。Yoshida等报导了在厌氧条件下生长的一株酿酒酵母的加单氧酶系。该系统包含同哺乳类肝细胞微粒体同样类型的电子传递组分，包括细胞色素b5,NADH细胞色素b5还原酶，NADPH细胞色素C还原酶和一种脂类因子。该系统是颗粒状的，表现为II型和和同巴比妥酸盐及低级醇类变型的基质一结合谱II型。一氧化碳的差光谱专门这类细胞色素最大值在447448nm。Aayama等估计了这株酿酒酵母的细胞色素P448的分子量为51000，并指出

26、了用甲基胆蔥诱导肝脏产生的细胞色素同该酵母细胞色素的相似性。微生物细胞色素P450呈现同已知的肾上腺线粒体及肝微粒体系统显著的类似性。所以，微生物和哺乳类在它们氧化代谢药物、外来的化学性异物及形成次生代谢物的发生上的相似性，这就具有坚实的比较生物化学基础。虽然在微生物和哺乳类的细胞色素P450加单氧酶系方面已经获取了相当前面而可取的情报，但是，对它们的生物化学机制了解甚少，特别是通过这种机理进行的生物转化作用，无论是在微生物或在哺乳类，都还有很多工作要作。六、细胞色素P450的诱导作用微生物的细胞色素P450的加单氧酶系是可以由基质诱导的。常常可以观察到这种现象，特别是在通过富集培养术分离到的

27、含有P450的菌种。传统的哺乳类细胞色素P450诱导剂(例如：苯巴比妥、3甲基胆蔥聚氯联苯)只在微生物P450水平的诱导作用中被适度地应用。在研究过的有限数量的情况下，发现了具有同哺乳类加单氧酶的诱导作用的类似之处。细菌的P450诱导作用有人报导，一株细菌具有可诱导的异香草酸P450的0去烷基酶系，它对一系列P烷基苯酯类有活性。荧光假单抱菌(Ps.Putida)的P450cam可被基质樟脑诱导，因为该菌株是最早采用富集培养术，使用樟脑作为唯一碳源。虽然未对该现象作深入研究，但显然该系统不可能是由传统的诱导剂苯巴比妥所诱导，其狭窄的基质专一性似乎不能保证诱导剂的代谢，这种诱导剂对诱导作用是必不可

28、少的物质。一株棒状杆菌(CorynebacteriumSP.(TEIC)也生长在正己烷的唯一碳源上,维持饱和的气态环境。对生长在其它碳源上与正己烷代谢无关，称为醋酸盐培养物的详细研究结果表明，其细胞色素降低六倍，而这种只是以P420的形式出现。在光谱和催化活性两方面都表现出诱导作用。羟基化酶系的分部分离表明在未被诱导的细胞(在醋酸盐上生长)培养物中缺乏核黄素。Edilson和McMullen(1977)研究了一种普通的肠道微生物区系菌E.coli的0去甲基酶活性。有关P硝基苯甲醚的去烷基作用的研究表明，这种活性可以被苯比妥诱导，同未经诱导处理的细胞相比，为1.5倍。该诱导剂仅只略降低细胞的生长

29、。没有发现添加外源性辅助因子的刺激效应，但是一氧化碳的抑制作用是明显的。本研究的重要性在于肠道微生物区系对药物和其它外来化学物质的代谢具有一定关系。药物和其它外来化学物质有助于哺乳类影响消化道微生物对它们的代谢活性。这可能意味着开辟一个新的富有生命力的研究领域。真菌的P450诱导作用产生物碱的麦角菌的P450水平因为由苯巴比妥而加倍增高。其生物碱产量的增加平行于P450的诱导作用。使用3甲基胆蔥，诱导作用不明显，发现从450到448nm的典型光谱位移。用蛋白质合成抑制剂得到的证据表明，因采用3甲基胆蔥而出现新的P448的合成作用。麦角菌生物碱生物合成的一种前体物色氨酸不是作为细胞色素P450的

30、诱导剂，但若使用苯巴比妥却具有增效作用。Ferris等研究Cunninghamellabainieri(ATCC9244)对形成的细胞色素P450的一些诱导剂。出人意料，苯、3甲基胆蔥、苯巴比妥及巴比妥钠在激活增高苯并芘羟化酶活性方面竟是无活性的。但是，当采用菲作诱导剂时，发现诱导的羟化酶活性增加10倍。可惜的是，这些结果因低的细胞产量而变得复杂化。在哺乳类、芳香烃羟化酶活性是被P448所催化，所以，证明巴比妥酸盐无效，则不足为奇。但奇怪的是：3甲基胆蔥这种传统的哺乳类P448和芳香烃羟化酶的诱导剂对本菌没有显著影响。因此，深入研究这些诱导剂对本菌在各种不同的P450催化反应方面的效应，可能是有兴趣的课题。Breskvar和HudnikPlernik提供了有说服力的证据：他们使用孕甾酮在生长培养物或蔗糖缓冲液细胞悬物中作为基质诱导出黑根霉的P450酶系孕甾酮羟化酶。后一种处理表明了较高的诱导活性。利用放线菌酮作抑制作用的研究发现羟基化作用的增高是因为新酶蛋白的合成作用所致。传统的P450诱导剂对于由C.eleg