生物化学大实验-3ppt课件

1、层析技术层析技术 4.1 层析技术概述层析技术概述4.1.1 引言引言层析法亦称层离法或色谱法层析法亦称层离法或色谱法Chromatography），它从发明至今已有），它从发明至今已有一个多世纪的历史。一个多世纪的历史。1903年俄国植物学家茨年俄国植物学家茨维特维特M. Tswett首先使用此法分离植物色首先使用此法分离植物色素。他向填充有素。他向填充有CaCO3粉末的柱内加入植物粉末的柱内加入植物色素提取液，并以石油醚淋洗，由于色素提取液，并以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，出

2、逐渐分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，出现了不同颜色的谱带。后称之为色谱。由现了不同颜色的谱带。后称之为色谱。由chroma颜色和颜色和graphs图谱构成色谱图谱构成色谱一词，层析法由此而得名。一词，层析法由此而得名。但是，当时这种方法并没引起人们太多的关注，直到1931年R. Kuhn用此法从蛋黄中分离出黄体素、从玉米中分离出玉米黄色素开始，层析技术才逐渐引起了人们的重视。此后1941年Martin用具有亲水能力的硅胶介质填充的层析柱分离氨基酸成功，并提出了液-液分配层析最初的塔板论。 英国生物学家Martin和Synge根据塔板论，提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体

3、相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱HPLC的产生，在60年代末也为人们所实现。80年代后期，人们在气相层析技术和液相层析技术的基础上还发展了超临界色谱。现在它们已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离手段。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。 4.1.2 层析的两个重要理论层析的两个重要理论层

4、析法是一种利用混合物中各组分的物理、化层析法是一种利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到彼此分离的目的。彼此分离的目的。 （1塔板理论塔板理论层析分离技术的目的是要将混合样品中各组分层析分离技术的目的是要将混合

5、样品中各组分彼此分开，它遵循相似相溶的原理，在互不相彼此分开，它遵循相似相溶的原理，在互不相溶的两相固定相和流动相之间进行分配。溶的两相固定相和流动相之间进行分配。根据塔板理论，可以把层析柱设想由若干个层根据塔板理论，可以把层析柱设想由若干个层即塔板组成，被分离组分在每一个层塔即塔板组成，被分离组分在每一个层塔板里的两相之间达到一次平衡，就进行了一板里的两相之间达到一次平衡，就进行了一次分配，相当于经过一个层塔板高。在分次分配，相当于经过一个层塔板高。在分离过程中组分要达到多少次平衡，进行了多少离过程中组分要达到多少次平衡，进行了多少次分配，应经过多少个层塔板高。理论塔次分配，应经过多少个层塔

6、板高。理论塔板数量是衡量物质在柱内的分配次数，分离次板数量是衡量物质在柱内的分配次数，分离次数越多物质的分离效果越好。这样分配系数小数越多物质的分离效果越好。这样分配系数小的组分和分配系数大的组分就能彼此分开，分的组分和分配系数大的组分就能彼此分开，分配系数小的组分每次达到平衡的时间短，从层配系数小的组分每次达到平衡的时间短，从层析柱中先流出；分配系数大的组分每次达到平析柱中先流出；分配系数大的组分每次达到平衡的时间长，从层析柱中后流出。衡的时间长，从层析柱中后流出。 对于一个层析柱来说，可作如下基本假设：1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理

7、论塔板。层析柱的长度用L表示。2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数。4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程即不连续过程）。5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元一次萃取）。则理论塔板数量n为：L/H（2速率理论速率理论根据上述假设，塔板理论初步阐明了组分在层根据上述假设，塔板理论初步阐明了组分在层析中的迁移速度。它可以定量地描述层析柱的析中的迁移速度。它可以定量地描述层析柱的柱效率等。对层析技术的

8、发展起了重要的推动柱效率等。对层析技术的发展起了重要的推动作用。但是塔板理论采用的是平衡过程的研究作用。但是塔板理论采用的是平衡过程的研究方法，忽略了许多动力学因素对柱分离效率的方法，忽略了许多动力学因素对柱分离效率的影响。实际上，层析分离与分子的扩散及运动影响。实际上，层析分离与分子的扩散及运动速度是有关的，而且，同一溶质在不同流动相速度是有关的，而且，同一溶质在不同流动相流速下将具有不同的理论塔板数，所以，后来流速下将具有不同的理论塔板数，所以，后来又发展了非平衡态的层析理论，或称速率理论。又发展了非平衡态的层析理论，或称速率理论。该理论吸收了层析的塔板理论的观点，同时又该理论吸收了层析的

9、塔板理论的观点，同时又进一步把层析分离的分配过程与涡旋流扩散、进一步把层析分离的分配过程与涡旋流扩散、分子扩散及传质阻力三者的关系联系起来，提分子扩散及传质阻力三者的关系联系起来，提出了连续流塔板模型。出了连续流塔板模型。用Van Deemter方程表示影响塔板高度的因素。H=A+B/u+Cu其中，A、B、C分别表示涡旋流扩散、分子扩散和传质阻力的3种系数；u表示流动相线性流速。由上式可以看出，当流动相流速一定时，A、B、C越小，H也越小，理论塔板数越大，柱效就越高。下面我们来讨论一下这三方面因素的影响。涡旋流扩散A） 流动相中的组分由于受到固定相颗粒的阻碍，不得不从各种无规则的固体颗粒之间的

10、间隙绕行，迫使其流动的方向不断发生改变，称为涡旋流扩散。由此可见，涡旋流现象的发生是由于固定相的颗粒大小不均匀及填充柱的不均匀引起各组分在层析柱中所发生的位移不同。它与流动相的性质、流速及组分的性质无关。因此，层析最好使用颗粒细、粒度均匀的填料作为固定相，以减少涡旋流扩散。 分子扩散分子扩散B/uB/u分子扩散是由浓度梯度所造分子扩散是由浓度梯度所造成的。当样品随着流动相流经层析柱的时候，成的。当样品随着流动相流经层析柱的时候，样品的前端和后端的浓度一定会降低，这就产样品的前端和后端的浓度一定会降低，这就产生了浓度差，有了浓度差就会形成自由扩散，生了浓度差，有了浓度差就会形成自由扩散，即分子扩

11、散。分子扩散对于气相色谱和液相色即分子扩散。分子扩散对于气相色谱和液相色谱的影响大相径庭，由于组分在液体中比气体谱的影响大相径庭，由于组分在液体中比气体中的扩散要小中的扩散要小105105倍，它对液相色谱的影响可倍，它对液相色谱的影响可以忽略。分子扩散不仅与组分在气相层析中停以忽略。分子扩散不仅与组分在气相层析中停留的时间成正比，它还与载气和组分的性质、留的时间成正比，它还与载气和组分的性质、温度液相色谱的影响、压力和分子量等有关。温度液相色谱的影响、压力和分子量等有关。 传质阻力传质阻力CuCu） 在层析过程中，样品各组分在层析过程中，样品各组分总是从流动相进入固定相，又从固定相进入流总是从

12、流动相进入固定相，又从固定相进入流动相，如此反复多次，最终完成层析。那么，动相，如此反复多次，最终完成层析。那么，流动相把组分交给固定相速度，固定相把组分流动相把组分交给固定相速度，固定相把组分交给流动相的速度，以及各组分在固定相和流交给流动相的速度，以及各组分在固定相和流动相中达到平衡的速度都是影响层析的因素，动相中达到平衡的速度都是影响层析的因素，这就是传质阻力。由此可见，传质阻力与流动这就是传质阻力。由此可见，传质阻力与流动相中组分的扩散和固定相中组分的扩散有关。相中组分的扩散和固定相中组分的扩散有关。由于气体分子的传质速度特别快，传质阻力对由于气体分子的传质速度特别快，传质阻力对于气相

13、色谱和液相色谱的影响也是大相径庭的，于气相色谱和液相色谱的影响也是大相径庭的，与分子扩散的影响相反，它对气相色谱的影响与分子扩散的影响相反，它对气相色谱的影响可以忽略。若要减少液相层析的传质阻力，最可以忽略。若要减少液相层析的传质阻力，最好使用颗粒细，且微孔孔径大的固定相。好使用颗粒细，且微孔孔径大的固定相。 4.1.3 层析的基本概念层析的基本概念 1. 固定相：固定相： 固定相是由层析基质组成的。它可以是固体固定相是由层析基质组成的。它可以是固体物质如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也物质如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质如固定在纤维素或硅胶上的可以是液体物质如固定在纤维素或硅

14、胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。逆的吸附，溶解，交换等作用。 2. 流动相：流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体等，向一定方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。层层析时称为展层剂。3. 分配系数及迁移率或比移值）：分配系数及迁移率或比移值）： 分配系数是指：在一定的条件下，某一组分分配系数是指：在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相

15、中含量浓度的比值，常在固定相和流动相中含量浓度的比值，常用用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的重要依据。迁移率或比移值是指：在一的重要依据。迁移率或比移值是指：在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用常用Rf来表示。实验中我们还常用相对迁移率来表示。实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离相同时间内，某一组分在固定相中

16、移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于它可以小于等于1，也可以大于，也可以大于1。用。用Rx来表来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。差异越大，分离效果越理想。4. 分辨率或分离度）分辨率或分离度） 简言之，分辨率是指相邻两个峰的分开程度，简言之，分辨率是指相邻两个峰的分开程度，是用来判断相邻两组

17、分在层析柱内的分离情况是用来判断相邻两组分在层析柱内的分离情况的，可以用两个层析峰保留值之差与两峰底宽的，可以用两个层析峰保留值之差与两峰底宽的平均值之比表示。用的平均值之比表示。用Rs来表示。图是计算分来表示。图是计算分辨率的示意图。分辨率：辨率的示意图。分辨率： 由上式可见，由上式可见，Rs值值越大，两种组分分离的越好。当越大，两种组分分离的越好。当Rs 1时，两时，两峰总会有部分重叠；当峰总会有部分重叠；当Rs = 1时，两组分具有时，两组分具有教好的分离，互相重叠约教好的分离，互相重叠约2%，即每种组分的，即每种组分的纯度约为纯度约为98%；当；当Rs=1.5时，两组分完全能时，两组分

18、完全能分开，每种组分的纯度可达到分开，每种组分的纯度可达到99.8%。一般。一般而言，而言，Rs 0.8标志相邻两组分的分离不符合标志相邻两组分的分离不符合要求，要求，Rs=1.5是相邻两组分达到完全分离的是相邻两组分达到完全分离的重要标志。重要标志。 总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。 5. 正相色谱与反相色谱正相色谱与反相色谱正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，正相色谱是指固定相的极性高于

19、流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。一般来说，正相色谱或正相柱中流出来。一般来说，正相色谱或正相柱用于分离纯化极性大的分子带电离子等）。用于分离纯化极性大的分子带电离子等）。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。一般来说，分子移动的速度快而先从柱中流出。一般来说，反相色谱或反相柱用于分离纯化极

20、性小的反相色谱或反相柱用于分离纯化极性小的有机分子有机酸、醇、酚等）。有机分子有机酸、醇、酚等）。 6. 操作容量或交换容量）操作容量或交换容量）在一定条件下，某种组分与基质固定相反在一定条件下，某种组分与基质固定相反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量或交换容量）。一般以每克们称为操作容量或交换容量）。一般以每克或毫升基质结合某种成分的毫摩尔数或毫或毫升基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克来表示，数值越大，表明基质对该物质的亲克来表示，数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强；否则反之。应当注意，同一种基质合力越强；否则反之。应当注意，同一

21、种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，其受对不同种类分子的操作容量是不相同的，其受到分子大小空间效应）、带电荷的多少、溶到分子大小空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等诸多因素的影响。因此，实际操作剂的性质等诸多因素的影响。因此，实际操作时，要想能得到有效的分离，样品的加入量要时，要想能得到有效的分离，样品的加入量要尽量少些。尽量少些。7. 床体积床体积Vt）通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积有的体积Vt）。）。Vt是基质的外水体积是基质的外水体积Vo和内水体积和内水体积Vi以及自身体积以及自身体积Vg的总和。的总和。即即Vt= Vo

22、+ Vi + Vg。柱床体积。柱床体积Vt可以通过可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。量水的体积来测定。8. 洗脱体积洗脱体积Ve）洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。 9. 外水体积外水体积Vo）外水体积指基质颗粒之间体积的总和。外水体外水体积指基质颗粒之间体积的总和。外水体积积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定。一般常用蓝色葡聚糖洗脱体积来测定。一般常

23、用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大为为200万），在各种型号的凝胶中都被完全万），在各种型号的凝胶中都被完全排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。10. 内水体积内水体积Vi）内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。11. 基质体积基质体积Vg）基质体积是指基质自身所具有的体积。基质体积是指基质自身所具有的体积。12. 死时间死时间t0及死体积及死体积V0）流动相中的溶质进入层析柱后，不被固定相所流动相中的溶质进入层析柱后，不被固定相所吸附，与固定相不发生任何作

24、用，通过柱所需吸附，与固定相不发生任何作用，通过柱所需要的时间，称为死时间要的时间，称为死时间t0）；通过柱所收集）；通过柱所收集的体积，称为死体积的体积，称为死体积V0）。）。13. 保留时间保留时间tR及保留体积及保留体积VR）自流动性中的某一组分进入层析柱开始到出现自流动性中的某一组分进入层析柱开始到出现该组分峰最高点时，所需要的时间称为保留时该组分峰最高点时，所需要的时间称为保留时间间tR），所收集的体积称为保留体积），所收集的体积称为保留体积VR）。）。4.1.4 层析法的分类层析法的分类 层析根据不同的标准可以分为多种类型：层析根据不同的标准可以分为多种类型：1. 根据固定相基质的

25、形式分类，层析可以分为根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的制备，通常为一次性使

26、用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分别。生物化学层析形式，适用于样品分析、分别。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。2. 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析、气相层析和超临界层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化，大大限制了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式，适于生物样品的分析、分别。3. 根据分离的原理不同分类，层

27、析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子

28、进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。4.1.5 柱层析的基本装置及基本操作柱层析的基本装置及基本操作1. 柱层析的基本装置柱层析的基本装置柱层析的设备主要有溶剂池、层析柱、恒流泵、柱层析的设备主要有溶剂池、层析柱、恒流泵、部分收集器、检测仪和记录仪。有时还需要梯部分收集器、检测仪和记录仪。有时还需要梯度混合器等。溶剂池主要用于储存样品和作为度混合器等。溶剂池主要用于储存样品和作为流动相溶液或溶剂的储存器。层析柱包括层析流动相溶液或溶剂的储存器。层析柱包括层析介质、带有筛板的玻管和各种接口。恒流泵用介质、带有筛板的玻管和各种接口。恒流泵用以保持一定

29、的操作压，作为流动相的推动力，以保持一定的操作压，作为流动相的推动力，以便使样品和洗脱液以一定的流速通过层析柱。以便使样品和洗脱液以一定的流速通过层析柱。部分收集器收集柱子流出液的装置，它使每一部分收集器收集柱子流出液的装置，它使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集，把整个流出液划分移位，下一管再继续收集，把整个流出液划分成许多个部分。检测仪是用来监测通过层析柱成许多个部分。检测仪是用来监测通过层析柱的流出液的仪器，主要有紫外检测器、荧光检的流出液的仪器，主要有紫外检测器、荧光检测器、示差折光率检测器和电导检测器等。测器、示

30、差折光率检测器和电导检测器等。梯度混合器是有两个彼此相通的圆筒容器和一个搅拌器组成的。如图：通过该装置可以制造出线型梯度、凸型梯度、凹型梯度三种梯度形式。在图中的A瓶中注入低浓度溶液，在B瓶中注入高浓度溶液，若A1=B1时，则为线型梯度；若A1B1时，则为凹型梯度。如果在A瓶和B瓶中注入的是不同的pH或极性的溶液，同样也可以得到类似于上述的三种梯度类型。 2. 柱层析的基本操作柱层析的基本操作柱层析的基本操作包括以下一些步骤：柱层析的基本操作包括以下一些步骤： 选柱选柱 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，层析柱分辨率的

31、要求来进行选择。一般来讲，层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等现象。一般柱长引起柱子不均一、流速过慢等现象。一般柱长度不超过度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:251:100之间。之间。 装柱柱子填充质量的好与差，是关系到柱层析法能否成功分离纯化物质的关键。一般要求填料在柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，不能分层

32、，连接处无死体积，柱床体积稳定，在较高的工作压力下不坍塌变形、流速稳定等。否则要重新装柱。在填充层析柱之前，对所要填充的材料需作一些预处理。可根据不同的材料作相应的溶胀、漂洗、再生、转型、脱气等。例如，将层析用的基质如吸附剂、树脂、凝胶等在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸0.5N1N）、碱 （0.5N1N）、盐0.5M1M溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质，用去离子水或蒸馏水洗涤干净，然后再用酸碱处理得到所需的离子形式，最后再用去离子水或蒸馏水洗涤至中性。 层析柱的填充是先关闭出水口，用溶剂灌注至1/3柱高，并使筛板下的“死体积不存有气泡，再将处理好的填充材料缓慢地倒入柱中，以

33、防止气泡存留在柱内，静置使其沉降，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填充，则在二次填充前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后在床面上铺一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。 平衡 柱子装好后，要用所需的缓冲液有一定的pH和离子强度平衡柱子。用恒流泵控制其流速平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为23倍柱床体积，以保证平衡后柱子符合填充均匀、松紧一致和没有气泡的标准。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。 加样加样

34、加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于量应少于20%的操作容量，加样体积应低于的操作容量，加样体积应低于5%的床体积。对于分析性柱层析，加样体积的床体积。对于分析性柱层析，加样体积不超过床体积的不超过床体积的1%。上柱前，应先将样品溶。上柱前，应先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，使样品溶液的浓解在溶剂里或对洗脱液透析，使样品溶液的浓度尽可能高些，以减少加样体积，使区带狭窄。度尽可能高些，以减少加样体积，使区带狭窄。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验当然，最大

35、加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。后才能决定。 应注意的是：应注意的是：样品溶液不能有沉淀出现，样品溶液不能有沉淀出现，否则应过滤后再上样。否则应过滤后再上样。加样时应缓慢小心地加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击填将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击填料，以保持填料表面平坦。料，以保持填料表面平坦。样品的粘度不能样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。过大，否则会影响分离效果。 洗脱洗脱 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。三种。 简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂进行洗脱，简单洗脱：柱子始终用同样的一种

36、溶剂进行洗脱，也就是溶剂的种类、浓度、也就是溶剂的种类、浓度、pH等都不变化。如果被分等都不变化。如果被分离物质的各组分在该溶剂和固定相中的分配系数较大，离物质的各组分在该溶剂和固定相中的分配系数较大，采用这种方法是适宜的。采用这种方法是适宜的。 分步洗脱：对层析柱进行洗脱时，当与柱子结合的分步洗脱：对层析柱进行洗脱时，当与柱子结合的一个组分被一种溶剂洗脱后，更换溶剂洗脱下一个组一个组分被一种溶剂洗脱后，更换溶剂洗脱下一个组分，一种溶剂洗脱其中一种组分。这种用几种洗脱能分，一种溶剂洗脱其中一种组分。这种用几种洗脱能力递增的溶剂进行逐级洗脱的方法称为分步洗脱。力递增的溶剂进行逐级洗脱的方法称为分

37、步洗脱。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，可以采用逐渐改变溶剂的性质，形成一个浓度、极性、可以采用逐渐改变溶剂的性质，形成一个浓度、极性、离子强度或离子强度或pH值等连续递增或递减的梯度，从而使各值等连续递增或递减的梯度，从而使各组分依次被洗脱，这种方法称为梯度洗脱。最常用的组分依次被洗脱，这种方法称为梯度洗脱。最常用的是浓度梯度，在水溶液中，亦即离子强度梯度。它的是浓度梯度，在水溶液中，亦即离子强度梯度。它的优点之一是能够减少拖尾现象。优点之一是能够减少拖尾现象。 由于影响柱层析效果的因素很多，洗脱条件的选择就尤为重要。在选择了洗脱

38、方式后，同时还应注意洗脱时的速率。根据速率理论，我们知道流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。因此，为了获得满意的分离结果，溶剂的流速务必恰当控制。除了洗脱方式、流速以外，还有温度、压力等条件的影响。总之，我们必须经过反复的试验与调整，才能得到最佳的洗脱条件。 搜集、检测、合并及保存搜集、检测、合并及保存 洗脱下来的流出液用部分收集器来收集。每洗脱下来的流出液用部分收集器来收集。每管的收集量不能太多，一般管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。然管。然后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线以管号或据测定结果

39、，即可绘制出洗脱曲线以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标）。在合并一个峰的各管溶液或活性为纵坐标）。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物起。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓活性，一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干

40、燥，得到干粉，在低温下保存备缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。用。 柱子的再生柱子的再生 柱层析的许多填料吸附剂、离子交柱层析的许多填料吸附剂、离子交换树脂或凝胶等经过适当方法的处理，换树脂或凝胶等经过适当方法的处理，又恢复其性能，可以反复使用多次，这又恢复其性能，可以反复使用多次，这就称为柱子的再生。各种填料的再生方就称为柱子的再生。各种填料的再生方法是不同的，详细操作可参阅操作手册法是不同的，详细操作可参阅操作手册及有关文献。及有关文献。 4.2 凝胶层析凝胶层析 凝胶层析是凝胶层析是20世纪世纪60年代发展起来的一种年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法，又称为凝简便

41、有效的生物化学分离分析方法，又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析等。它是以具网状结构的凝胶填料作为透层析等。它是以具网状结构的凝胶填料作为固定相，小分子物质能进入其内部，而大分子固定相，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，按分子量大小分离样品物质却被排阻在外部，按分子量大小分离样品中各个组分的液相色谱方法。中各个组分的液相色谱方法。1959年，年，Porath和和Flodin首次将多孔聚合物交联葡首次将多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料，后来人们将凝胶制成球聚糖凝胶作为柱填料，后来人们将凝胶制成球形微珠，作为分离介质，获

42、得了巨大成功。形微珠，作为分离介质，获得了巨大成功。1964年，年，Moore又制备了具有不同孔径的交又制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析流动相为有机溶剂的凝胶称为凝胶渗透层析流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前已经成为生物化得到不断的完善和发展，目前已经成为生物化学实验中不可替代的技术手段之一。学实验中不可替代的技术手段之一。 凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前

43、主要用于生物化学、分子生物学和生物制药研究和生产中的蛋白质包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。它具有设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高、条件温和，特别是不改变样品生物学活性等优点。 4.2.1 凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理 凝胶层析是一种物理的分离纯化手段，它是凝胶层析是一种物理的分离纯化手段，它是依据样品中各组分间分子大小的差异设计的。依据样品中各组分间分子大小的差异设计的。凝胶层析的填料溶胀后是具有立体网状结构的凝胶层析的填料溶胀后是具有立体网状结构的球形惰性凝胶颗粒，颗粒的表面和内部形成很球形惰性凝胶颗粒，颗粒的表面

44、和内部形成很多孔穴，且孔穴直径较一致。若样品中各组分多孔穴，且孔穴直径较一致。若样品中各组分的分子大小不同，样品进入凝胶层析柱后，各的分子大小不同，样品进入凝胶层析柱后，各个组分向凝胶颗粒的孔穴内扩散，能否进入孔个组分向凝胶颗粒的孔穴内扩散，能否进入孔穴内部取决于孔穴的大小和组分分子的大小。穴内部取决于孔穴的大小和组分分子的大小。比孔穴孔径大的分子不能进入孔穴内部，完全比孔穴孔径大的分子不能进入孔穴内部，完全被排阻在孔穴之外，只能沿着凝胶颗粒间的空被排阻在孔穴之外，只能沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，随流动相向下流动，它隙或大的网状孔通过，随流动相向下流动，它们在柱内迁移的路径短，停留时

45、间短，保留值们在柱内迁移的路径短，停留时间短，保留值小，所以迁移率最快，首先从柱中流出；小，所以迁移率最快，首先从柱中流出；而分子小的组分则可以完全进入凝胶颗粒内部，沿着凝胶颗粒内的立体网状孔穴流过，它们在柱内迁移的路径长，停留时间长，保留值大，所以迁移率最慢，最后从柱中流出；而分子大小介于二者之间的在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们的大小，所以它们流出的时间也介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。样品经过凝胶层析后，各个组分按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。4.2.2 凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质 凝胶的种类很多，但能用于凝胶层析的，应凝胶的

46、种类很多，但能用于凝胶层析的，应具有这样几个特征：具有这样几个特征：惰性好，不能与待分离惰性好，不能与待分离的物质发生化学反应、吸附作用、离子交换作的物质发生化学反应、吸附作用、离子交换作用或亲和反应等；用或亲和反应等；耐受性好，在高温和有机耐受性好，在高温和有机溶剂的作用下，不发生变形；溶剂的作用下，不发生变形；刚性好，应具刚性好，应具有一定机械强度，能承受一定的操作压力。常有一定机械强度，能承受一定的操作压力。常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶用的凝胶主要有葡聚糖凝胶dextran）、聚）、聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺凝胶polyacrylamide）、琼脂糖）、琼脂糖凝胶凝胶agarose以及聚丙烯酰

47、胺和琼脂糖之以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。下面将分别介绍。聚苯乙烯凝胶等等。下面将分别介绍。 1. 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与交联剂相互交联葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与交联剂相互交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有两大类，商品名分别生产。常见的有两大类，商品名分别为为Sephadex和和Sephacryl。Sephadex又可又可分为分为G型和型和LH型两类。型两类。葡聚糖凝胶中最常见的是葡聚糖凝胶中最常见的是S

48、ephadex G系列，系列，它是葡聚糖与它是葡聚糖与3氯氯1,2环氧丙烷交联剂环氧丙烷交联剂以醚键相互交联而成。结构式图！葡聚以醚键相互交联而成。结构式图！葡聚糖凝胶的交联程度简称交联度由环氧氯丙糖凝胶的交联程度简称交联度由环氧氯丙烷的百分比控制，它与凝胶颗粒网状结构孔径烷的百分比控制，它与凝胶颗粒网状结构孔径的大小有直接关系，交联度越大，网状结构的的大小有直接关系，交联度越大，网状结构的孔径越小，分离的分子量越小；反之，交联度孔径越小，分离的分子量越小；反之，交联度越小，网状结构的孔径越大，分离的分子量越越小，网状结构的孔径越大，分离的分子量越大。大。 Sephadex G的主要型号是G-

49、10 G-200，型号不同，交联度也不同，分离相对分子质量的范围就不同，这就是所谓的分级分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,00070,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。Sephadex G后面的数字除以10表示该凝胶的吸水率吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，不包括颗粒间吸附的水份。单位是ml / g干胶）。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。葡聚糖凝胶是不溶于有机溶剂和水的聚合物，但其结构中含有大量的羟基，因此，Sephadex G的亲水性很好，能迅速在水中和电解质溶液中溶

50、胀，层析过程中与水溶性溶质接触非常容易。不同型号的Sephadex G的吸水率不同，分级分离范围也不同。数字越大的，分级分离范围越大，排阻极限也越大。 排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。它代表该凝胶能有效分离的最大分子量，大于它的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。Sephadex G中排阻极限最大的G-200为6105。Sephadex G在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex G稳定工

51、作的pH一般为为210。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex G与强酸和氧化剂接触。Sephadex G在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。 Sephadex G由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团尤其是碱性蛋白发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex G进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex G与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephad

52、ex G有各种颗粒大小一般有粗、中、细、超细可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex G的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。 另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶。LH型葡聚糖凝胶与G型葡聚糖凝胶相比较区别在于：一般以G型葡聚糖凝胶经水溶液溶胀作为固定相，以水溶液作为流动项，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。而以LH型葡聚糖凝胶经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂溶胀作为

53、固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。LH型葡聚糖凝胶的主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。 Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺N, N-methylene bisacrylamide交联而成。是一种硬性凝胶。Sephacryl与Sephadex相比有很多优点：其一，它的化学和机械稳定性更高，Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可用各种去污剂如SDS）、6mol/L盐酸胍或8mol/L尿素等作为洗脱液；其二，耐高温，在120消毒pH7.0时处理后，层析性质

54、没有明显变化；其三，Sephacryl稳定工作的pH一般为211，在0.2mol/L NaOH溶液中室温处理100小时，其低流速和多孔性没有明显影响；其四，Sephacryl的机械性能较好，比较耐压，可以用较高的流速洗脱，分辨率也较高；其五，它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex的范围。所以它不仅可以用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至是质粒、大的病毒颗粒直径300-400nm）。 2. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 以 丙 烯 酰 胺聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 以 丙 烯 酰 胺acrylamide，简称，简称Acr为

55、单体，甲叉双丙为单体，甲叉双丙烯酰胺烯酰胺N, N-methylene bisacrylamide，简称简称Bis为交联剂，在过硫酸铵为交联剂，在过硫酸铵-TEMED四甲基已二胺或核黄素四甲基已二胺或核黄素-TEMED催化剂的催化剂的作用下交联而成。通过控制丙烯酰胺和甲叉双作用下交联而成。通过控制丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例，就可以得到不同交联度的聚丙烯酰胺的比例，就可以得到不同交联度的聚丙烯酰胺凝胶。最常用的聚丙烯酰胺凝胶层析丙烯酰胺凝胶。最常用的聚丙烯酰胺凝胶层析介质是由介质是由Bio-Rad Laboratories生产的商品生产的商品名为名为Bio-Gel P的系列产品，主要型号有的

56、系列产品，主要型号有Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-300等等10种，后面的种，后面的数字数字103基本代表它们的排阻极限，排阻极基本代表它们的排阻极限，排阻极限最大的限最大的Bio-Gel P-300为为3105。所以数。所以数字越大，表示交联度越小，凝胶孔径越大，分字越大，表示交联度越小，凝胶孔径越大，分级分离的范围也就越大，反之亦然。级分离的范围也就越大，反之亦然。 聚丙烯酰胺凝胶的分级分离范围、吸水率等性能，在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中的稳定性等基本近似于Sephadex。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性比Sephadex好，在pH为110之间比较稳定。但在较强的碱性或较

57、高的温度条件下不如Sephadex稳定，易发生分解。另外，聚丙烯酰胺凝胶是一种化学合成的凝胶，不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物稍有吸附作用，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病就可以克服。 3. 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖。琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖。琼脂由中性链状的琼脂糖和带负电荷的含磺酸基琼脂由中性链状的琼脂糖和带负电荷的含磺酸基和羧基的琼脂胶两部分组成。其制备过程就是去和羧基的琼脂胶两部分组成。其制备过程就是去除琼脂胶留下琼脂糖。琼脂糖是由除琼脂胶留下琼脂糖。琼脂糖是由D半乳糖和半乳糖

58、和3,6脱水半乳糖交替构成的链状多糖。它在脱水半乳糖交替构成的链状多糖。它在100 C时呈液态，当温度降至时呈液态，当温度降至45 C以下时，以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有瑞典的瑞典的Sepharose系列、美国的系列、美国的Bio-gel A系列、系列、英国的英国的Sagavac系列、丹麦的系列、丹麦的Gelarose系列和系列和我国的我国的QT系列等。在系列等。在

59、Sepharose B系列产品中，系列产品中，B前面的数字表示琼脂糖的百分比浓度，例如前面的数字表示琼脂糖的百分比浓度，例如Sepharose 6B表示琼脂糖的浓度为表示琼脂糖的浓度为6%， B前前面的数字越大，表示交联度越大，凝胶孔径越小，面的数字越大，表示交联度越大，凝胶孔径越小，分级分离的范围也就越小，反之亦然。分级分离的范围也就越小，反之亦然。 琼脂糖凝胶的稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。它在室温下保存是很稳定的，工作在pH 49之间是稳定的，另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，因此，使用琼脂糖凝胶作为介质洗脱速度可以

60、更快。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小，排阻极限却很大，分离范围更广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以030 C为宜。 Sepharose与1,3二溴异丙醇反应，形成Sepharose CL型交联凝胶，交联前后的分离性能没有改变，只是热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更广泛的pH范围内应用，稳定工作的pH范围为313。Sepharose CL型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。 4. 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶 该凝胶是利用交联的聚丙烯酰胺作为三维空该凝胶是利用交联的聚丙烯酰胺作为三维空间骨架，再用琼脂糖嵌入其内部组成的混合型间骨