第05章 分子发光湖南大学化学化工学院分析化学仪器部分

1、第五章 分子发光荧光、磷光和化学发光法分析化学（仪器分析部分） 分子发光分子发光Molecular Luminescence 分子荧光 分子磷光 化学发光 生物发光 散射光谱 光致发光光致发光：分子吸收了光能而被激发：分子吸收了光能而被激发至较高能态，在返回基态时，发射出至较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光。种现象称为光致发光。化学发光化学发光：化学反应中，产物分子吸：化学反应中，产物分子吸收了反应过程中释放的化学能而被激收了反应过程中释放的化学能而被激发，在返回基态时发出光辐射。发，在返回基态时发出光辐射。目 录5

2、-1 荧光和磷光光谱法5-1-1 基本原理5-1-2 荧光分析仪器5-1-3 荧光分析方法的特点与应用5-1-4 磷光分析法5-2 化学发光与生物发光分析法5-2-1 基本原理5-2-2 发光反应的类型与应用荧光（荧光（fluorescence）现象的第一次记录：）现象的第一次记录： 1575年，西班牙内科医生和植物学家年，西班牙内科医生和植物学家N. Monardes，观，观察到察到Lignum Nephriticum木头切片的水溶液呈现天蓝色。木头切片的水溶液呈现天蓝色。第一次被提议用于分析：第一次被提议用于分析： 1864年，年，Stokes第一次用于分析：第一次用于分析： 1867年，

3、年，Goppelsrder根据根据Al-桑色素配合物的荧光，建立桑色素配合物的荧光，建立了了Al3+的荧光测定方法。的荧光测定方法。George Gabriel Stokes (1819-1903)参考文献： 陈国珍，黄贤智，郑本梓，许金钩，王尊 本，荧光分析法，科学出版社，北京，1990 Joseph R. Lakowicz, Principle of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999 netLibrary电子图书基态单重态S 激发态单重态S 激发态三重态T 10-8s 1

4、0-4 - 1s 5-1-1 基本原理 5-1-1-1 荧光和磷光的产生1单重态和三重态 基态单重态基态单重态(singlet state)：自旋电子成对：自旋电子成对,只有一种自旋方向只有一种自旋方向,电子自电子自旋总和是零，光谱项的多重性是旋总和是零，光谱项的多重性是1，以，以S0表示表示; 当基态电子激发到某高能级时当基态电子激发到某高能级时, 将有两种激发态：将有两种激发态：即受激电子自旋相反与自旋平行即受激电子自旋相反与自旋平行: h、h。自旋平行多重性为。自旋平行多重性为M=2x1+1=3，称为激受三重态（，称为激受三重态（triplet state）用）用T表示，表示，自旋相反多

5、重性为自旋相反多重性为1，称为激受单重态，用，称为激受单重态，用S表示；表示； 激发单重态激发单重态S与激发三重态与激发三重态T的不同点：的不同点： 激发三重态的能量较激发单重态的能量低激发三重态的能量较激发单重态的能量低 。 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；态到激发三重态的激发为禁阻跃迁； tS = 10-8s, tT = 10-41s； S是抗磁分子，是抗磁分子，T是顺磁分子是顺磁分子；2分子内的光物理过程 辐射跃迁： 荧光：S1最低振动能级S0磷光：ST非辐射跃迁：振动弛豫内转移外转移系间窜跃

6、非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫：振动弛豫：同一同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：内转换：同多重度电子能级中同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。激发单重态的最低振动能级。 外转换：外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转激发分子与溶剂或其他分子之间产生

7、相互作用而转移能量的非辐射跃迁；移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间窜跃：系间窜跃：不同多重态不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由：电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态，基态， 多为多为 S1 S0跃迁跃迁，发射波长为发射波长为 2的荧光；的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长

8、由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；长； 2 2 1 ； 磷光发射：磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态，基态， T1 S0跃迁；跃迁； 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁） S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。5-1-1-2 光谱曲线激发激发 ex max 发射发射 em max 磷光（磷光（phosphorescence）特

9、征：特征：（1）Stokes位移位移（2）ex一般不影响一般不影响em sp的形状的形状（3）吸收光谱与）吸收光谱与em sp的镜像关系的镜像关系Wavelength / nm300350400450Absorbance0.050.100.15 0.0g/mL 1.0g/mL 9.9g/mL47.6g/mL90.9g/mLC1d=1x10-5mol/LpH=5.89ctDNAWavelength / nm380400420440460480500Fluorescence intensity05001000150020002500 0.0g/mL 1.0g/mL 9.9g/mL47.6g/mL9

10、0.9g/mLC1d=1x10-5mol/Lex=376nmpH=5.89ctDNANRRRRNClClHNRR激发光谱与发射光谱的关系a. Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比发射光谱的波长比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。b. 发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级如能级图图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的

11、最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如 2 )。 c. 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级与第一激发态上的各振动能级分布类似；分布类似； 基态上的基态上的零振动能级与零振动能级与第一激发态的第一激发态的二振动能级之二振动能级之间的跃迁几率间的跃迁几率最大，相反跃最大，相反跃迁也然迁也然。 5-1-1-3 荧光的影响因素 1. 分子产

12、生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。量子产率: 荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之荧光物质发射光子数与吸收激发光子数之比（当非辐射跃迁比（当非辐射跃迁A返回基态的概率很小时，返回基态的概率很小时， F接近于接近于1，在通常情况下，在通常情况下， F总是小于总是小于1的）的）吸收激发光的量子数发出荧光的量子数F2荧光与有机化合物的结构（1）跃迁类型：）跃迁类型： * 的荧光效率高，系间跨越过程的速的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：）共轭效应：提高共

13、轭度有利于增加荧光效率并产生红移提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。芳环上有供电基，使荧光增强。3荧光与金属螯合物(1)配体发光配体发光 荧光弱荧光弱荧光强荧光强(2)金属发光金属发光 N NOH HON NOOAl3+NSO3HOHMn(II)d*d4溶剂效应 同一种荧光

14、物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。度可能有明显不同。 一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。红移。5 温度的影响 一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将下光效率和荧光强度将增加，相反，温度升高荧光效率将下降。降。 如荧光素的乙醇溶液在如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低以下每降低

15、10 ，荧光效率，荧光效率增加增加3%，冷至，冷至-80时，荧光效率为时，荧光效率为100%。碰撞碰撞能量转移能量转移O2的作用的作用( (光漂白光漂白) )自熄灭、自吸收自熄灭、自吸收 (内滤效应内滤效应)6荧光熄灭（猝灭） Wavelength (nm)350400450500550600650700750800Absorbance0.00.20.40.60.81.0Fluorescence Intensity0102030405060abcdFluorescence spectra (-) of TPP and absorption spectra (-) of ETH5294 in p

16、lasticized PVC membrane: a. Excitation spectrum of TPP; b. Emission spectrum of TPP; c. Unprotonated ETH5294; d. Protonated ETH5294. 荧光物质分子与溶剂荧光物质分子与溶剂或其它溶质分子相互作用，或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消失引起荧光强度降低、消失或荧光强度与浓度不呈现或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。线性关系的现象。5-1-1-4 荧光强度的定量关系 FkIclclclF23123223302.( .) / ! ( .) / !k 与仪器有关的

17、常数与仪器有关的常数I0 激发光的强度激发光的强度 F 荧光量子产率荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数l 光程长度。光程长度。 根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c之间的关系是： 当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，Parker方程可简化为： FkIclF 230. 19世纪前 肉眼观察 1928年 Jette，West发明光电比色计 1939年 应用光电倍增管（PMT） 1952年 商品化校正光谱仪器 1980年后 计算机化 5-1-2 荧光分析仪器5-1-2-1 荧光分析仪器框图光源激发单色器样品池发射单色器

18、检测器信号处理显示I0 FI15-1-2-2 荧光分光光度计部件理想的荧光分析仪器?1光源：钨灯、汞灯、氙灯、激光 激发光源应具有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定的重现性和精密度；强度：影响测定的灵敏度。2单色器：滤光片、光栅 激发单色器和发射单色器3检测器PMT PhotomultiplierCCD Charge Coupled Device CID Charge Injected Device 4信号处理HITACHI Fluorescence Spectrophotometer F-4500FeaturesThree dimensional contour p

19、lots Phosphorescence In addition to fluorescence and phosphorescence measurements luminescence is included as standard.The intense 150 watt xenon source provides maximum light energy over the entire 200-900 nm wavelength range of the spectrophotometer. Our unique horizontal beam geometry of the exci

20、tation and emission beams increases sensitivity and requires only 0.6 mL of sample in a standard 10mm cuvette. 灵敏度高：灵敏度高：比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高24个数量级；个数量级； 检测下限：检测下限：0.10.1ug/cm-3 相对灵敏度：相对灵敏度：0.05-0.005ppb（0.05M H2SO4) 选择性高选择性高 重现性好重现性好 取样量少取样量少 仪器不复杂仪器不复杂 5-1-3 荧光分析方法的特点及应用 1特点 2应用 检测：金属离子、有机物、生物分

21、子检测：金属离子、有机物、生物分子 生物分子相互作用研究生物分子相互作用研究 疾病诊断疾病诊断（参见附件） 定性分析：定性分析：依据不同结构不同结构的物质所发射的荧光波长不同发射的荧光波长不同；定量分析定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度荧光强度与浓度呈线性关系。呈线性关系。5-1-4 磷光分析法1如何获得较强的磷光 增加试样的刚性增加试样的刚性: 低温冷冻低温冷冻 固体磷光法：固体磷光法：吸附于固相载体（滤纸）吸附于固相载体（滤纸） 分子缔合物的形成：分子缔合物的形成：加入表面活性剂等加入表面活性剂等 重原子效应：重原子效应：加入含重原子的物质，如银盐等加入含重原子的物质，如银

22、盐等 敏化磷光：敏化磷光：通过能量转移产生磷光通过能量转移产生磷光磷光发射：磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级电子由第一激发三重态的最低振动能级基态，基态， T1 S0跃迁；跃迁； 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）2磷光分析仪器 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。光发射的同时测量磷光。 液槽液槽 斩波片斩波片 测量方法：测量方法：（1 1）通常借助于荧光和磷光寿命）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光的差别，采用磷光镜的装置

23、将荧光隔开。隔开。（2 2）采用脉冲光源和可控检测及）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。室温测量时，不需要杜瓦瓶。3. 应用 稠环芳烃和石油产物稠环芳烃和石油产物采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表烃和杂环化合物（致癌物质）；见表 农药、生物碱、生长激素农药、生物碱、生长激素烟碱、降烟碱、新烟碱，烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析等分析 检测限检测限0.01ug/cm-3 药物分析药物分析见表见表5-2 化学与生物发光分析法5-2-1 基本原理1. 化学发光反应

24、（Chemiluminescence） 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行； 化

25、学发光反应如果存在于生物体化学发光反应如果存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光（中，称生物发光（bioluminescence ）。2.化学发光效率化学效率：化学效率：emcecl 参加反应的分子数参加反应的分子数发射光子的分子数发射光子的分子数参加反应分子数参加反应分子数激发态分子数激发态分子数 ce 发光效率：发光效率：激发态分子数激发态分子数产生光子数产生光子数 em 时刻时刻t t 的化学发光强度的化学发光强度( (单位时间发射的光量子数单位时间发射的光量子数) )： tctIddclcl d dc c/d/dt t 分析物参加反应的速率；分析物参加反

26、应的速率；3. 化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多，在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多，对于一级动力学反应：对于一级动力学反应： cttcttIAttcl0cl0cldddd dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。为反应速率常数。定性依据：定性依据：（1 1）在一定条件下，峰值光在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，在一定条件下，曲线下面积为发光总强度曲线下面积为发光总强度(S)，其，其与被与被测物浓度成线性：测物浓度成线性：4. 装置与技术 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室

27、光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；5. 特点 灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的

28、化学发光分析，可测定的化学发光分析，可测定2 10-17mol/L的的ATP，即可检测出一个细菌中的，即可检测出一个细菌中的ATP含量含量 仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；不需要光源、单色器和背景校正； 发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；无背景光、散射光等干扰； 线性范围宽 分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。体中的发光）；机理研究少。 5-2-2 发光反应的类型与应用1. 气相化学发光反应用于大气中用于大气中O3、NO、NO2、H2S、SO2、CO等组分的监测。等组分

29、的监测。a. 一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：发射的光谱范围：600875nm，灵敏度，灵敏度1ng/cm-3；b. 氧原子与氧原子与SO2的发光反应的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：最大发射波长：200nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3； O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：40

30、01400nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3；d. 氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3； c. 氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：e. 乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛： CH2O* CH2O + h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对；对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；f. 火焰中的化学发光反应：火焰中的化学发光反

31、应： 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；一氧化氮一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm； 最大发射波长：最大发射波长：690nm； 在在富氢火焰中：富氢火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 该反应十分迅速；该反应十分迅速；硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等等在富在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2

32、* S2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm； 最大发射波长：最大发射波长：394nm； 灵敏度：灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。2. 液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺（应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程

33、：鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺鲁米诺- H2O2发光反应可检测低至发光反应可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；鲁米诺鲁米诺- H2O2发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等通过测定生成的通过测定生成的H2O2 ，间接测定某些生物试样，如确定，间接测定某些生物试样，如确定氨氨基酸、葡萄糖基酸、葡萄糖含量。含量。 氨基酸氨基酸 + O2

34、 酮酸酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 + H2O2 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 草酸二酯草酸二酯(能量提供体能量提供体)+高浓度双氧水高浓度双氧水+稠环芳烃稠环芳烃(能量接能量接受体受体)+金属离子金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源冷光源)。3. 生物发光（Bioluminescence） 生物发光是化学发光中的一类，特指在生物体内通过化学反应产生的发光现象

35、，主要由酶来催化产生的。多种细菌、昆虫、鱼类等均能发光。可用于环境质量监测。 仿佛地球的迅速旋转，将黑色的大气擦出了火；仿佛风在赶动这具行星磨石，从磨石边上迸出这种瞬息间的火花来。汤玛斯罗维尔贝多士 1824年意大利米兰生物发光原理： 在生物发光分析中，通常同时涉及到酶促反应和发光反在生物发光分析中，通常同时涉及到酶促反应和发光反应。在应。在pH为为7-8的介质中，在荧光虫素酶（的介质中，在荧光虫素酶（E）和）和Mg(II)离子离子的存在下，荧光虫素（的存在下，荧光虫素（LH2）与）与ATP反应，生成磷酸腺苷反应，生成磷酸腺苷（AMP）荧光虫素和荧光虫素酸的复合物及镁的焦磷酸盐）荧光虫素和荧光

36、虫素酸的复合物及镁的焦磷酸盐（ppi）。其反应如下：）。其反应如下： ATP + LH2 + E + Mg2 + pH = 7-8 AMPLH2E + Mgppi + 2H+ 然后复合物与氧反应，发生化学发光反应：然后复合物与氧反应，发生化学发光反应： AMPLH2E + O2 氧化荧光虫素* + AMP + CO2 +H2O 氧化荧光素* 氧化荧光素 + hv（max =562nm） ATP的测定 在在pH 78；荧光素酶；荧光素酶(E)和和Mg2+的存在下，的存在下，荧光素荧光素(LH2)与磷酸三腺甙与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光荧光素和荧光素

37、酸的复合物和镁的焦磷酸盐素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+pH7 - 8复合物与氧反应，产生化学发光：复合物与氧反应，产生化学发光： AMP LH2 E + O2 氧化荧光素* + AMP+CO2 + H2O氧化荧光素* 氧化荧光素 + h最大发射波长最大发射波长562nm； NADH的测定 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应存在下，发生发光反应 ：NADH

38、+ FMA + H+ NAD+ + FMNH2NADH脱氢酶脱氢酶FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h黄素酶黄素酶最大发射波长最大发射波长495 nm；4. 电化学发光/电致发光 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。上包括了电化学和化学发光二个过程。例如：发光剂钌吡啶Ru(bpy)32+和电子供体三丙胺TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+

39、，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的Ru(bpy)33+，使其形成激发态的Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的Ru(bpy)32+发射出波长620nm的光子。该过程可在电极表面周而复始地进行。 电化学发光免疫测定（Electrochemiluminescent immunoassay, ECLIA） 电化学发光免疫测定是继放射免疫、酶免疫、荧光免电化学发光免疫测定是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发

40、光（是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。）和免疫测定相结合的产物。 它的标它的标记物的发光原理与一般的化学发光（记物的发光原理与一般的化学发光（CL）不同，是一种在）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。括了电化学和化学发光二个过程。ECL与与CL的差异在于的差异在于ECL是电启动发光反应，而是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光是通过化合物混合启动发光反应。反应。ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于于DNARNA探

41、针检测。探针检测。以人血清促甲状腺激素 THS检测为例1.三联吡啶钌衍生物 Ru(bpy)32+标记的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。2 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。3蠕动泵将形成的 Ru(bpy)32+抗体抗原抗体磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与Ru(bpy)32+结合的抗体）也被吸出测量室。4蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。5最后，终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。 附录：发 光 原 理 荧光灯荧光灯：当