化学物质与蛋白质的相互作用-文档资料

1、1第六章第六章 化学物质与蛋白质的相互作用化学物质与蛋白质的相互作用 n在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的70%70%以上，以上，种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆品）、精细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广品）、精细化工

2、（酶催化合成）等领域的应用日益广泛。泛。n在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。用以及化学修饰作用等。 2球状蛋白三级结构的主要特征球状蛋白三级结构的主要特征n绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，白质一旦具有三级结构后，蛋白质内部变

3、得更为紧密，内部的空间约有内部的空间约有7575被原子所充满。这样的密集程度被原子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小分子，可以与一些晶体的情况远远超过在液体中的小分子，可以与一些晶体的情况相比。相比。n可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是“非非极性在内，极性在外极性在内，极性在外”。大量蛋白质的。大量蛋白质的X X射线晶体衍射线晶体衍射分析统计的结果充分证明了这一规律。射分析统计的结果充分证明了这一规律。n存在于蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链，约存在于蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链，约有有6363是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、有

4、氨酸、缬氨是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、有氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；带电的残基，天冬氨酸、谷氨酸、酸和苯丙氨酸等；带电的残基，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有赖氨酸和精氨酸只有4 4。约。约9595的带电的侧链是分的带电的侧链是分布在蛋白质的表面；约布在蛋白质的表面；约1414的亮氨酸、异亮氨酸、缬的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。3n在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的表面也常见到一些疏水的残基。这些的表面也常见到一些疏水的残基。这些“异常异常”分布的残分布的残基，致使肽链

5、的局部结构发生基，致使肽链的局部结构发生“扭曲扭曲”，一些键的张角与，一些键的张角与一般正常的值有所偏离，蛋白质中这些局部的构象具有相一般正常的值有所偏离，蛋白质中这些局部的构象具有相对偏高的能量，相对地处于较不稳定的状态，在外界很小对偏高的能量，相对地处于较不稳定的状态，在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。的扰动作用下，就能发生变化。n原则上，一些相对规则的原则上，一些相对规则的 - -螺旋和螺旋和 - -折叠分布在球状蛋白折叠分布在球状蛋白的内部，而且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结的内部，而且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结构；那些连接构；那些连接 - -螺旋和螺旋和 -

6、-折叠叠的规整性相对差一些的二折叠叠的规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的级结构，转角和环状以及特定的“无规无规”卷曲，则更多地卷曲，则更多地是分布在球状蛋白的外周。是分布在球状蛋白的外周。n还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量不同的水分子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性不同的水分子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性的原子形成氢键。其中一些水分子也参与了蛋白质功能的的原子形成氢键。其中一些水分子也参与了蛋白质功能的行使。行使。n球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，球状蛋白的表面并不是非常光滑的，

7、而是具有很多沟渠，多数球状蛋白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面多数球状蛋白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面积的两倍积的两倍。 4n球状蛋白质分子的立体结构具右高度特异性和高度灵球状蛋白质分子的立体结构具右高度特异性和高度灵敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构象的特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特象的特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特异的结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常异的结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。n在生

8、物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与在生物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受体的小分子激素和神经介质、血红蛋白的体的小分子激素和神经介质、血红蛋白的O O2 2等。因此，等。因此，生物体内的蛋白质是处于一种可以相互转变的多种构生物体内的蛋白质是处于一种可以相互转变的多种构象的平衡态象的平衡态. .n球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”，在，在“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴的周的周围常常是疏水性的：这些围常常是疏水

9、性的：这些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”可能是可能是蛋白质蛋白质( (酶酶) )的活性部位所在。的活性部位所在。5硫氧还蛋白的结构硫氧还蛋白的结构紧密结合水紧密结合水亲水性残基亲水性残基疏水性残基疏水性残基6第一节第一节 化学物质对蛋白质的沉淀作用化学物质对蛋白质的沉淀作用 n由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂过

10、半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。质除去。n根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用。蛋白质会发生沉淀作用。n蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。中沉淀出来。 7沉沉淀淀作作用用的的类类型型可逆沉淀可逆沉淀不可逆沉淀不可逆沉淀抗体抗体- -抗原沉淀抗原沉淀在

11、温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中结构和性质都没有发生变化，在适结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶当的条件下，可以重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。液，又称为非变性沉淀。在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀过程发

12、生了蛋白质的结构由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，又称为变性沉淀。和性质的变化，又称为变性沉淀。抗体和抗原蛋白通过相互识别抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。这和结合而发生的沉淀现象。这种特殊的沉淀作用是生物体免种特殊的沉淀作用是生物体免疫功能的基础疫功能的基础。81 1，无机物沉淀，无机物沉淀n当向蛋白质溶液中逐渐加入无机盐时，当向蛋白质溶液中逐渐加入无机盐时，开始，蛋白质的溶解增大，这是由于开始，蛋白质的溶解增大，这是由于蛋白质的活度系数降低的缘故，这种蛋白质的活度系数降低的缘故，这种现象称为盐溶。现象称为盐溶。n但当继续加入电解质时，另一种因素但当继续加入电解质时

13、，另一种因素起作用，使蛋白质的溶解度减小，称起作用，使蛋白质的溶解度减小，称为盐析。这是由于电解质的离子在水为盐析。这是由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出水分子就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产生沉淀。就越易产生沉淀。（1 1）盐析）盐析牢固结牢固结合水合水大量溶大量溶剂水层剂水层910n含高价阴离子的盐，效果比含高价阴离子的盐，效果比1 1价的盐好。阴离价的盐好。阴离子的盐析效

14、果有下列次序：子的盐析效果有下列次序：n 柠檬酸盐柠檬酸盐POPO4 43-3-SOSO4 42-2-CHCH3 3COOCOO- -ClCl- -NONO3-3-SCNSCN- -。 n但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫酸镁的效果不如硫酸铵。对于酸镁的效果不如硫酸铵。对于1 1价阳离子则有价阳离子则有下列次序：下列次序：NHNH4 4+ +K K+ +NaNa+ +。 11n因此，最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或因此，最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。但硫酸钠在磷酸钠。但硫酸钠在40C40C 以下溶解度较低，因而仅适以下溶解

15、度较低，因而仅适用于对热稳定的蛋白质。磷酸盐在中性范围内实际上用于对热稳定的蛋白质。磷酸盐在中性范围内实际上是是HPOHPO4 42-2-和和H H2 2POPO4-4-的混合物，其作用比的混合物，其作用比POPO4 43+3+差。硫酸铵差。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定, , 在在2-2-3mol/L (NH4)3mol/L (NH4)2 2SOSO4 4中酶可保存几年。同时由于盐的浓中酶可保存几年。同时由于盐的浓度高，可防止蛋白酶和细菌作用，故是最常用的盐析度高，可防止蛋白酶和细菌作用，故是最常用的盐析剂。硫酸铵的缺点是水解后变酸，在高剂。硫

16、酸铵的缺点是水解后变酸，在高pHpH下会释放出下会释放出氨，腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也氨，腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。12（2 2）金属离子沉淀法）金属离子沉淀法n一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类：为三类：n第一类为第一类为MnMn2+2+，FeFe2+2+，CoCo2+2+，NiNi2+2+，CuCu2+2+，ZnZn2+2+和和CdCd2+2+能能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧和蛋白质分子表面的羧基，

17、氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。链结合。n第二类为第二类为CaCa2+2+，BaBa2+2+，MgMg2+2+和和PbPb2+2+能和蛋白质分子表面能和蛋白质分子表面的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。n第三类为第三类为AgAg+ +，HgHg2+2+和和PbPb2+2+能和蛋白质分子表面的巯基能和蛋白质分子表面的巯基相结合。相结合。13n金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离白质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。子可用离子交换树脂或螯合剂除去。

18、n在这些离子中，应用较广的是在这些离子中，应用较广的是ZnZn2+2+，CaCa2+2+，MgMg2+2+，BaBa2+2+和和MnMn2+2+，而，而CuCu2+2+，FeFe2+2+，PbPb2+2+，HgHg2+2+等较少应等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。如用，因为它们会使产品损失和引起污染。如ZnZn2+2+可用于沉淀杆菌肽可用于沉淀杆菌肽( (作用于第作用于第4 4个组氨酸残个组氨酸残基上基上) )和胰岛素；和胰岛素；CaCa2+2+(CaCO(CaCO3 3) )用于分离乳酸，血用于分离乳酸，血清清蛋白等。清清蛋白等。142 2，等电点沉淀，等电点沉淀n蛋白质与多肽一样

19、，能够发生两性离解，也有等电点。蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。n等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。余的酸除去。n等电点沉淀法的最主要缺点是酸

20、化时，易使蛋白质失等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低活，这是由于蛋白质对低pHpH比较敏感。比较敏感。15pHpH对对 - -乳球蛋白溶解度的影响乳球蛋白溶解度的影响 163 3，有机物沉淀，有机物沉淀n利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中主多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中主要效应是水活度的降低。要效应是水活度的降低。n当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面

21、上荷电当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大。常数降低，因而静电吸力增大。n在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小，别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小，所以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。所以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。 （1 1）有机溶剂）有机溶剂17n有

22、机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机留在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。n一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和

23、丙酮，加量在20%-50%20%-50%（V/VV/V）之间。当蛋白质的溶液）之间。当蛋白质的溶液pHpH接近等电接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。 18（2 2）酚类化合物及有机酸沉淀）酚类化合物及有机酸沉淀n当蛋白质溶液当蛋白质溶液pHpH小于其等电点时，蛋白质颗粒小于其等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。n这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即（即2,

24、4,6-2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。杨酸等。19n单宁是一种多酚类化合物的寡聚单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解离而带体，它们的酚羟基可以解离而带有负电荷，而且分子中的苯环、有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋白质发生非共多个羟基可以与蛋白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的表价相互作用，结合在蛋白质的表面，然后在蛋白质分子之间形成面，然后在蛋白质分子之间形成多点交连而成网络结构，最终导多点交连而成网络结构，最终导致聚集而沉淀致聚集而沉淀 204 4，聚合物沉淀，聚合物沉淀n许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（许多非离子

25、型聚合物，包括聚乙二醇（PEGPEG）可用来进行）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和双水相的相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和双水相的形成有联系。若使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量形成有联系。若使低分子量的蛋白质沉淀，需加入大量PEGPEG；而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。；而使高分子量的蛋白质沉淀，加入的量较小。PEGPEG是是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用而被广泛使用。蛋

26、白质有保护作用而被广泛使用。n一般一般PEGPEG的分子量需大于的分子量需大于40004000，最常用的是，最常用的是60006000和和2000020000。所用的所用的PEGPEG浓度通常为浓度通常为20%20%，浓度再高，会使粘度增大，造，浓度再高，会使粘度增大，造成沉淀的回收比较困难。成沉淀的回收比较困难。PEGPEG对后继分离步骤影响较少，对后继分离步骤影响较少，因此可以不必除去。因此可以不必除去。21（2 2）聚电解质沉淀法）聚电解质沉淀法 n有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。如羧有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等

27、。它们的作甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在pHpH值低于等电点值低于等电点时使蛋白质沉淀。但加入量不能太多，否则会引起胶溶作时使蛋白质沉淀。但加入量不能太多，否则会引起胶溶作用而重新溶解。用而重新溶解。n一些阴离子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一一些阴离子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和以聚苯乙烯为骨架的季胺些阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和以聚苯乙烯为骨架的季胺盐也曾用来沉淀乳清蛋白质。聚丙烯酸能在盐也曾用来沉淀乳清蛋白质。聚丙烯酸能在pH 8.8pH 8.8时沉淀

28、时沉淀90%90%以上的蛋白质，聚苯乙烯季胺盐能在以上的蛋白质，聚苯乙烯季胺盐能在pH 10.4pH 10.4时沉淀时沉淀95%95%的蛋白质。的蛋白质。n聚乙烯亚胺能与蛋白质的酸性区域形成复合物，在中性时聚乙烯亚胺能与蛋白质的酸性区域形成复合物，在中性时带正电，可在污水处理中作絮凝剂，也广泛用于酶的纯化带正电，可在污水处理中作絮凝剂，也广泛用于酶的纯化中。中。 22第二节第二节 化学物质对蛋白质的稳定作用化学物质对蛋白质的稳定作用 n许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋白溶液在某些酶蛋白溶液在37C37C 放置的半衰期仅几个小放置的半衰

29、期仅几个小时。时。n这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。这种现象称为蛋白质的变性。 23一、蛋白质不可逆失活的化学因素一、蛋白质不可逆失活的化学因素n强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的pHpH，引起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基酸残基引起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基酸残基所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白

30、质的空间结构发生所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化，造成蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。较大变化，造成蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。n另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易被水解断裂，另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易被水解断裂，天冬酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，改变天冬酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，改变了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重新排了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重新排布，结果导致蛋白质失去活性。布，结果导致蛋白质失去活性。1 1，强酸和强碱，强酸和强碱242 2，氧化剂，氧化剂n各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨各种

31、氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。其中酪氨酸侧链的酚羟酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。其中酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌，后者可以与蛋白质表面的巯基、基可以被氧化成醌，后者可以与蛋白质表面的巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。在碱性条件氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。在碱性条件下，半胱氨酸可以被下，半胱氨酸可以被CuCu2+2+氧化成次磺酸或亚磺酸或磺氧化成次磺酸或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。酸半胱氨酸。n分子氧、分子氧、H H2 2O O2 2以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自由以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自由基等是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧化基

32、等是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧化失活主要是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、过失活主要是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、过氧化氢、过氧化物）来完成的。这些氧化剂的杀菌作氧化氢、过氧化物）来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋白质失活。用主要也是造成蛋白质失活。253 3，去污剂和表面活性剂，去污剂和表面活性剂n去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具有长链疏水尾和亲水的极性头。当少量的阴离子有长链疏水尾和亲水的极性头。当少量的阴离子去污剂（如十二烷基硫酸钠，去污剂（如十二烷基硫酸钠，SDS SDS ）单体加入到）单体加入到蛋白质溶

33、液中时，去污剂与蛋白质表面的疏水区蛋白质溶液中时，去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，随着加入量增加，与蛋白质的结合位点域结合，随着加入量增加，与蛋白质的结合位点达到饱和，这时去污剂则以协同方式结合于蛋白达到饱和，这时去污剂则以协同方式结合于蛋白质其它位点，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水质其它位点，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂结合，直性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂结合，直到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性。到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性。26274 4，变性剂，变性剂n高浓度脲（高浓度脲（8-10mol/L8-10mol/L）和盐酸胍（

34、）和盐酸胍（6 mol/L6 mol/L）常常用）常常用于蛋白质变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质于蛋白质变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键，引起蛋白质不可逆失活。高级结构的氢键，引起蛋白质不可逆失活。 （1 1）脲和盐酸胍）脲和盐酸胍28（2 2）有机溶剂）有机溶剂n水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质失去活性，水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质失去活性，是因为有机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，是因为有机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，并通过疏水作用与蛋白质结合，改变了溶液的并通过疏水作用与

35、蛋白质结合，改变了溶液的介电常数，从而影响维持蛋白质天然构象的非介电常数，从而影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡共价力的平衡 29（3 3）螯合剂）螯合剂n结合金属离子的试剂，如结合金属离子的试剂，如EDTAEDTA等可以使金属酶、等可以使金属酶、金属蛋白失活，这是因为金属蛋白失活，这是因为EDTAEDTA与金属离子形成与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅助因子造成配位复合物，从而使酶失去金属辅助因子造成的。的。n失去金属辅助因子的酶或蛋白质可以引起蛋白失去金属辅助因子的酶或蛋白质可以引起蛋白质构象发生较大改变，导致蛋白质活力不可逆质构象发生较大改变，导致蛋白质活力不可逆的丧失。的

36、丧失。n但是，螯合剂可以螯合对蛋白质有害的金属离但是，螯合剂可以螯合对蛋白质有害的金属离子，使那些不需要金属离子的蛋白质稳定。子，使那些不需要金属离子的蛋白质稳定。 305 5，重金属离子和巯基试剂，重金属离子和巯基试剂n在金属离子对蛋白质的沉淀作用中，一些重金属在金属离子对蛋白质的沉淀作用中，一些重金属离子，如离子，如HgHg2+2+、CdCd2+2+、PbPb2+2+能与蛋白质分子中的半能与蛋白质分子中的半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基以及色氨酸的吲哚基反应，使蛋白质不可逆沉淀而变性失活。哚基反应，使蛋白质不可逆沉淀而变性失活。n巯基试剂，如巯基乙醇

37、等通过还原蛋白质分子内巯基试剂，如巯基乙醇等通过还原蛋白质分子内的二硫键而使蛋白质失去活性，但这个过程一般的二硫键而使蛋白质失去活性，但这个过程一般是可逆的。而低分子量的含二硫键的试剂可与蛋是可逆的。而低分子量的含二硫键的试剂可与蛋白质中的巯基作用，形成混合二硫键，造成蛋白白质中的巯基作用，形成混合二硫键，造成蛋白质结构发生变化，导致其失活。质结构发生变化，导致其失活。 31LysArg水32蛋白质不可逆失活的化学因素蛋白质不可逆失活的化学因素 强酸和强碱强酸和强碱 强的酸碱可强的酸碱可以改变蛋白以改变蛋白质溶液的质溶液的pHpH引起蛋白质引起蛋白质表面必需基表面必需基团的电离，团的电离，使蛋

38、白质的使蛋白质的空间结构发空间结构发生变化，造生变化，造成蛋白质分成蛋白质分子聚集，导子聚集，导致变性。致变性。 氧化剂氧化剂 氧化剂甲硫氧化剂甲硫氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸和胱氨氨酸和胱氨酸残基。酪酸残基。酪氨酸侧链的氨酸侧链的酚羟基可以酚羟基可以被氧化成醌被氧化成醌再与巯基、再与巯基、氨基发生迈氨基发生迈克尔加成反克尔加成反应形成交联应形成交联产物。产物。 表面活性剂表面活性剂变性剂变性剂 重金属离子重金属离子去污剂与蛋去污剂与蛋白质表面的白质表面的疏水区域结疏水区域结合，导致蛋合，导致蛋白质伸展，白质伸展，分子内部的分子内部的疏水性氨基疏水性氨基酸残基暴露酸残基暴露从而使蛋白从而使蛋白质发

39、生不可质发生不可逆变性。逆变性。 脲或盐酸胍脲或盐酸胍与蛋白质多与蛋白质多肽链作用，肽链作用，破坏了蛋白破坏了蛋白质分子内维质分子内维持其二级结持其二级结构和高级结构和高级结构的氢键。构的氢键。有机溶剂也有机溶剂也会引起蛋白会引起蛋白质变性失活质变性失活HgHg2+2+、CdCd2+2+、PbPb2+2+能与蛋能与蛋白质分子中白质分子中的半胱氨酸的半胱氨酸的巯基、组的巯基、组氨酸的咪唑氨酸的咪唑基以及色氨基以及色氨酸的吲哚基酸的吲哚基反应，使蛋反应，使蛋白质不可逆白质不可逆沉淀而变性沉淀而变性失活。失活。 33三、化学物质对蛋白质的稳定作用三、化学物质对蛋白质的稳定作用 n蛋白质的稳定性是指蛋

40、白质抵抗各种因素的影蛋白质的稳定性是指蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活性的能力。根据生物体内蛋响，保持其生物活性的能力。根据生物体内蛋白质等存在的状态，可以利用化学物质或化学白质等存在的状态，可以利用化学物质或化学方法使蛋白质稳定化，以有利于蛋白质在体外方法使蛋白质稳定化，以有利于蛋白质在体外的应用。的应用。n通过研究蛋白质的变性及稳定性，可以了解蛋通过研究蛋白质的变性及稳定性，可以了解蛋白质的结构功能与稳定性的关系等。白质的结构功能与稳定性的关系等。 34n在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以通过化学方法使蛋白质稳定。其中常用的方法以通

41、过化学方法使蛋白质稳定。其中常用的方法有以下几种：有以下几种：n固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载体、高分子载体）；载体、高分子载体）；n添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧化、不添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧化、不受变性剂变性等受变性剂变性等n化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。 35稳定剂稳定剂共溶剂共溶剂 糖类，醇糖类，醇氨基酸及氨基酸及其衍生物其衍生物无机盐，无机盐，甘油，聚甘油，聚乙二醇等乙二醇等常用常用1-4M1-4M浓度共溶浓度共溶剂来稳定剂来稳定蛋白质和蛋白质和细胞器。细胞器。抗氧

42、化剂抗氧化剂 底物、辅酶底物、辅酶金属离子金属离子 化学交联剂化学交联剂半胱氨酸，半胱氨酸，2-2-巯基乙醇巯基乙醇还原谷胱甘还原谷胱甘肽，二巯基肽，二巯基赤藓醇等巯赤藓醇等巯基试剂可防基试剂可防止巯基氧化止巯基氧化植物抗氧化植物抗氧化剂如儿茶酚剂如儿茶酚黄酮等也具黄酮等也具有保护作用有保护作用酶可被底酶可被底物辅酶、物辅酶、竞争性抑竞争性抑制剂及反制剂及反应产物等应产物等所稳定。所稳定。金属离子不金属离子不仅可以影响仅可以影响酶的活性，酶的活性，还可以影响还可以影响酶的稳定性酶的稳定性如如CaCa2+2+多位多位点结合使得点结合使得蛋白质分子蛋白质分子成为紧密的成为紧密的活性形式。活性形式。

43、交联剂可在交联剂可在相隔较近的相隔较近的两个氨基酸两个氨基酸残基之间，残基之间，或蛋白质与或蛋白质与其他分子之其他分子之间（如固定间（如固定化载体）发化载体）发生交联反应生交联反应使蛋白质的使蛋白质的构象稳定。构象稳定。36四、化学物质的共价修饰作用四、化学物质的共价修饰作用 n化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物质的生理活性（包括药理、毒理等），如何物质的生理活性（包括药理、毒理等），如何判断化合物与蛋白质分子中的哪类基团作用，判断化合物与蛋白质分子中的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。在体外主要用化合修饰的方法。n该方法是研究蛋白质结构

44、与功能的一种重要的该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手段。基础手段。 37生物体内蛋白质加合物的形成生物体内蛋白质加合物的形成 n许多化学毒物对细胞产生的损害与其亲电代谢产物同许多化学毒物对细胞产生的损害与其亲电代谢产物同细胞大分子的亲核部位细胞大分子的亲核部位( (如蛋白质的巯基如蛋白质的巯基) )发生不可逆发生不可逆结合具有密切关系。结合具有密切关系。n当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分当外源化合物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分子，如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷基化子，如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷基化或芳基化，即导致或芳基化，即导致DNADNA损

45、伤、蛋白质正常功能丧失，损伤、蛋白质正常功能丧失，乃至细胞的损伤或死亡、外源化合物与生物大分子相乃至细胞的损伤或死亡、外源化合物与生物大分子相互作用主要有两种方式：非共价结合和共价结合。互作用主要有两种方式：非共价结合和共价结合。 381 1，可与蛋白质发生反应的化合物，可与蛋白质发生反应的化合物 n除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体除少数烷化剂外，绝大多数外源化合物需经体内代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再内代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细胞内生物大分子中的亲核部位和基团发生与细胞内生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结合，例如蛋白质分子中的亲核基团、共价结合，例如蛋白质

46、分子中的亲核基团、DNADNA、RNARNA及一些小分子物质如谷胱甘肽等的亲及一些小分子物质如谷胱甘肽等的亲核部位等。核部位等。 392 2，蛋白质分子中的可反应基团，蛋白质分子中的可反应基团 n致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子量较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿量较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的环氧化物、丙烯酰胺等，与蛋白质烷和氯乙烯的环氧化物、丙烯酰胺等，与蛋白质作用时，所形成的加合物依赖于外源化合物与各作用时，所形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。种氨基酸反应的相对速率。 40试剂类型试剂类

47、型化合物或前体化合物或前体反应机制反应机制烷基化烷基化芳香基化芳香基化卤代物卤代物亲核取代亲核取代环氧化物环氧化物硫酸烷基酯硫酸烷基酯活泼的烯烃活泼的烯烃1,4-1,4-加成加成羰基化合物羰基化合物醛醛形成席佛碱形成席佛碱酰基化酰基化有机酸酐、酰氯等有机酸酐、酰氯等亲核取代或加成亲核取代或加成磷酰化磷酰化有机磷有机磷亲核取代亲核取代自由基自由基OHOH、CClCCl3 3自由基反应自由基反应具有亲电氮化合物具有亲电氮化合物芳香胺芳香胺亲核取代亲核取代41氨基酸残基侧链基团的修饰氨基酸残基侧链基团的修饰 n蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记

48、试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应而实现的。其中的一个重要作用是发生化合反应而实现的。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。用来探测活性部位的结构。n理想情况下，修饰试剂只是有选则地与某一特定理想情况下，修饰试剂只是有选则地与某一特定的残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构的残基反应，很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。象变化。n在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生在此基础上，从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残物活性所造成的影响，就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能。基在该蛋

49、白质分子中的功能。 42巯基的化学修饰巯基的化学修饰 n5,5-5,5-二硫二硫-2-2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸(DTNB)(DTNB)，又称为，又称为EllmanEllman试剂，目前已成为试剂，目前已成为最常用的巯基修饰试剂。最常用的巯基修饰试剂。DTNBDTNB可以与巯基反应形成二硫键，产生的可以与巯基反应形成二硫键，产生的5-5-巯基巯基-2-2-硝基苯甲酸阴离子在硝基苯甲酸阴离子在412nm412nm具有很强的吸收，可以很容易具有很强的吸收，可以很容易通过光吸收的变化来监测反应的程度。通过光吸收的变化来监测反应的程度。n有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的是对氯有机汞试

50、剂是最早使用的巯基修饰试剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，该化合物溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时汞苯甲酸，该化合物溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在在255nm255nm处光吸收具有较大的增强效应。处光吸收具有较大的增强效应。 43氨基的化学修饰氨基的化学修饰 n有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸有许多化合物都可用来修饰赖氨酸残基，三硝基苯磺酸(TNBS)(TNBS)就是其中非常有效的一种。就是其中非常有效的一种。TNBSTNBS与赖氨酸残基反应，与赖氨酸残基反应，在在420 nm420 nm和和367nm367nm能够产生特定的光吸收。能够产生特定的光吸收。

51、 n在蛋白质序列分析中，用于多肽链在蛋白质序列分析中，用于多肽链N-N-末端残基的测定的化末端残基的测定的化合修饰方法合修饰方法-2-2，4-4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFD)(DNFD)法、丹磺酰氯法、丹磺酰氯(DNS)(DNS)法和法和) )苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)(PITC)法都是常用的氨基修饰方法法都是常用的氨基修饰方法。 44羧基的化学修饰羧基的化学修饰 n水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的羧基基团，目前已成为一种应用最普遍的标准羧基基团，目前已成为一种应用最普遍的标准方法，它在比较温和的条件下就可以进行。方法，它在比较温和

52、的条件下就可以进行。 45咪唑基的化合修饰咪唑基的化合修饰 n焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(DPC)(DPC)是最常用的修饰组氨酸残基的是最常用的修饰组氨酸残基的试剂。该试剂在接近中性的情况下表现出比较好的试剂。该试剂在接近中性的情况下表现出比较好的专一性，与组氨酸残基反应使咪唑基上的专一性，与组氨酸残基反应使咪唑基上的1 1个氮羧乙个氮羧乙基化，并且使得在基化，并且使得在240 nm240 nm处的光吸收增加。该取代处的光吸收增加。该取代反应在碱性条件下是可逆的，可以重新生成组氨酸反应在碱性条件下是可逆的，可以重新生成组氨酸残基。残基。 46四、蛋白质光谱探针四、蛋白质光谱探针 n蛋白质的定量测

53、定是生物化学和其他生物学科中经蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物学科中经常涉及的分析内容，也是临床诊断和检验疾病治疗常涉及的分析内容，也是临床诊断和检验疾病治疗效果的重要指标，还是药物和食品分析的常见项目。效果的重要指标，还是药物和食品分析的常见项目。n所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或

54、结构方面的信息。的信息。n蛋白质的定量分析方法很多，但研究最多、应用最蛋白质的定量分析方法很多，但研究最多、应用最广的还是吸光光度法、荧光分析法和共振光散射等广的还是吸光光度法、荧光分析法和共振光散射等分子光谱探针分子光谱探针。 47蛋蛋白白质质吸吸光光探探针针金金属属探探针针双缩脲在碱性溶液中与双缩脲在碱性溶液中与 CuCu2+2+生成紫生成紫红色化合物的反应。肽和蛋白质化红色化合物的反应。肽和蛋白质化合物都有双缩脲反应，生成紫红色合物都有双缩脲反应，生成紫红色化合物，在化合物，在540nm540nm具有光吸收。具有光吸收。 双缩脲法双缩脲法Folin-Folin-LowryLowry法法 将双缩脲试剂和将双缩脲试剂和FolinFolin酚试剂酚试剂( (磷钼磷钼酸盐磷钨酸盐）结合使用，在蛋白酸盐磷钨酸盐）结合