南京农大动物生物化学课件17

1、本章主要内容：本章主要内容：4dnadna重组技术重组技术4基因鉴定基因鉴定4核酸技术的应用核酸技术的应用 对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组dnadna技术使人类千百年的梦想变为了现实。技术使人类

2、千百年的梦想变为了现实。一个梦想已成真一个梦想已成真生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠硕鼠”1.dna1.dna重组技术重组技术 dna dna重组技术重组技术是利用多种限制性内切酶和是利用多种限制性内切酶和dnadna连接酶等工具酶，以连接酶等工具酶，以dnadna为操作对象，在细胞外将一种外源为操作对象，在细胞外将一种外源dnadna（来自原核或真核生物）和载体（来自原核或真核生物）和载体dnadna重新组合连接（重组），形成重组重新组合连接（重组），形成重组dnadna，然后将重组，然后将重组dnadna转入宿主细胞转入宿主细胞（如大肠杆菌等）

3、，使外源基因（如大肠杆菌等），使外源基因dnadna在宿主细胞中随宿主细胞的繁殖而增在宿主细胞中随宿主细胞的繁殖而增殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。的遗传性状。“基因工程基因工程”（gene engineeringgene engineering）或）或“分子克隆分子克隆”（molecular cloningmolecular cloning）。）。 基因重组技术的基因重组技术的 两个基本目的两个基本目的1.1.直接利用基因直接利用基因 主导生长的基因、主导生长的基因、 作物的抗性基因、作物

4、的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等指纹图谱等2.2.利用基因的表达产物利用基因的表达产物 疫苗、药物、疫苗、药物、 组织激活物、组织激活物、 生长因子、生长因子、 珍稀蛋白等珍稀蛋白等 50 50年来，核酸酶学的进步为年来，核酸酶学的进步为dnadna的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的核酸酶有：核酸酶有： dnadna聚合酶（聚合酶（dna polymerase dna polymerase ） klenow klenow 片段，片段， taq taq 酶酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endo

5、nuclease restriction endonuclease ） 逆转录酶（逆转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase） s s1 1核酸酶（核酸酶（ s s1 1 nuclease nuclease） 连接酶（连接酶（ligaseligase） 拓扑异构酶（拓扑异构酶（topoisomerasetopoisomerase）等）等核酸酶学核酸酶学限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 一把神奇的一把神奇的“手术刀手术刀”具有内切和甲基化两种功能具有内切和甲基化两种功能能够识别外源的核酸并将它切除能够识别外源的核酸并将它切除有特异的识别位点，通

6、常为有特异的识别位点，通常为4-8对碱基的旋转对称结构对碱基的旋转对称结构在其切口处留下黏性末端（在其切口处留下黏性末端（stickyend）具有互补序列具有互补序列的单股链，或者平头末端（的单股链，或者平头末端（bluntend）有有3种类型，种类型，ii型为主型为主例如：例如：ecori属种品系排序限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下黏性末端黏性末端）目的基因克隆的技术路线目的基因克隆的技术路线 获得目的基因获得目的基因 选择合适的可以携带目的基因的载体选择合适的可以携带目的基因的载体 把目的基因插入到载体中去，得到重组载体把目的基因插入到载

7、体中去，得到重组载体 将重组载体导入宿主细胞进行克隆将重组载体导入宿主细胞进行克隆（通过无性繁殖，随着宿主目的基通过无性繁殖，随着宿主目的基因也得以扩增因也得以扩增） 对重组的克隆进行筛选对重组的克隆进行筛选 使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因黏性末端（如质粒，噬菌体等）（如细菌）目的基因克隆的技术路线目的基因克隆的技术路线利用表型特性，核酸杂交以及免疫化学等方法对克隆进行筛选目的基因的制备目的基因的制备f 直接从染色体中分离直接从染色体中分离f 人工合成人工合成f 逆转录合成逆转录合成cdnacdna cdna cdna文库：用细胞全部文库：用细胞全部m

8、rnamrna经反转录制备全套经反转录制备全套cdnacdna后建库。后建库。f 构建基因文库构建基因文库f pcrpcr扩增扩增 质粒是可以独立复制质粒是可以独立复制并在细菌之间转移的并在细菌之间转移的遗传单位，质粒还能遗传单位，质粒还能赋予宿主菌某种表型赋予宿主菌某种表型其他的基因载体还有其他的基因载体还有如：噬菌体，病毒等如：噬菌体，病毒等目的基因的载体目的基因的载体plasmid dnagenomic dna含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过 规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素） 古埃及一具木

9、乃伊的一个古埃及一具木乃伊的一个 dna dna 片段已经得到克隆片段已经得到克隆 打开了人们窥探过去的窗户打开了人们窥探过去的窗户2.基因鉴定聚合酶连锁反应聚合酶连锁反应（pcr,dnapolymerasechainreaction）目的基因可以通过以下系统在试管中得以大规模扩增目的基因可以通过以下系统在试管中得以大规模扩增一个温度和时间可以控制的反应体系一个温度和时间可以控制的反应体系 含有双链含有双链dnadna模板模板耐热的耐热的dnadna聚合酶（如聚合酶（如taqtaq酶）酶）一对设计适当的一对设计适当的rnarna引物，引物，dntpdntp原料，过量原料，过量经经“变性变性-退

10、火退火-延伸延伸”多次循环使目的多次循环使目的dnadna得以扩增得以扩增dnadna核苷酸序列分析核苷酸序列分析 sangersanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法 利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股dnadna或或rnarna片段片段探针探针（probeprobe），）， 可以：可以： 研究研究dnadna之间的亲缘关系；之间的亲缘关系； 发现基因的缺失或突变；发现基因的缺失或突变； 测定某种遗传信息的量；测定某种遗传信息的量； 鉴定某种基因鉴定某种基因 基因治疗等基因治疗等分子杂交分子杂交（molecularhybridizat

11、ion）分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础印迹技术（印迹技术（blotting）southernblot用探针鉴定用探针鉴定dnanorthernblot用探针鉴定用探针鉴定rna原位杂交（原位杂交（hybridizationinsitu）指纹分析（指纹分析（fingerprinting）基因芯片（基因芯片（dnamicroarray）分子杂交等技术可用来筛选重组克隆分子杂交等技术可用来筛选重组克隆 用探针鉴定dna称为southern印迹,鉴定rna称为northern印迹southern-blotsouthern-blot印迹杂交原理示意图印迹杂交原理示意

12、图 染色体的原位杂交基因芯片的应于发育生物学研究在基础研究和应用领域具有广泛用途的dna 芯片同一物种不同生态型之间同一物种不同生态型之间dnadna多态性产生的多态性产生的rflp rflp dnadna指纹指纹（dnafingerprint） dnadna指纹分析应用于刑侦指纹分析应用于刑侦1. 5. 9. marker1. 5. 9. marker，8. 10 8. 10 都是对照都是对照2. 2. 嫌疑人嫌疑人a a血细胞血细胞dnadna3. 3. 被害人衣服上残留精液被害人衣服上残留精液dnadna4. 4. 嫌疑人嫌疑人b b血细胞血细胞dnadna6. 6. 被害人阴道取样被害

13、人阴道取样dnadna7. 7. 被害人血被害人血dnadna8. 8. 实验对照实验对照从上世纪从上世纪9090年代初开始，用了年代初开始，用了1010年时间，人类完成了年时间，人类完成了对自身染色体的对自身染色体的3030亿对碱基的序列测定，这就是所谓亿对碱基的序列测定，这就是所谓的的人类基因组项目（人类基因组项目（hgphgp） 在人类基因组项目基本完成之后，在人类基因组项目基本完成之后，人类蛋白质人类蛋白质组项目组项目将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后基因组

14、时代的新的研究领域，对于人类认识自己，基因组时代的新的研究领域，对于人类认识自己，控制疾病的意义将难以估量。控制疾病的意义将难以估量。3.3.核酸技术的应用核酸技术的应用 在生命科学研究中的应用在生命科学研究中的应用 在动物疾病诊断中的应用在动物疾病诊断中的应用 在动物遗传育种中的应用在动物遗传育种中的应用 在生物制药中的应用在生物制药中的应用 在农业中的应用在农业中的应用 动物生物化学练习（动物生物化学练习（3 3）1.1.氨基酸参与了动物体内一些重要含氨基酸参与了动物体内一些重要含n n 小分子的合成。请指出以下小分子的合成。请指出以下3 3种物种物质的主要功能，它们各由哪些氨基酸为原料转

15、变而成。质的主要功能，它们各由哪些氨基酸为原料转变而成。 a. a. 肾上腺素；肾上腺素； b. b. 磷酸肌酸；磷酸肌酸； c. c. 嘧啶嘧啶 2.dna2.dna的复制包括哪些主要阶段？为什么复制具有半保留性？为什么说子的复制包括哪些主要阶段？为什么复制具有半保留性？为什么说子链的合成是半不连续的？链的合成是半不连续的？ 3.3.转录的终止出现在转录的终止出现在dnadna分子中特定的碱基顺序上。原核分子中特定的碱基顺序上。原核dnadna转录的终止顺转录的终止顺序有明显的结构特点，请予描述。除此以外，还有什么其它的终止转录的序有明显的结构特点，请予描述。除此以外，还有什么其它的终止转录的方式？方式？4. 4. 关于蛋白质多肽链的翻译过程，请你关