微生物生理学课程论文微生物碱性蛋白酶的性质研究进展

1、微生物碱性蛋白酶的性质研究进展摘要：综述了微生物碱性蛋白酶的研究状况，包括酶的微生物来源、酶学特性、微生物碱性蛋白酶在国内外的应用研究和现状，并对其前景进行了展望。关键词：碱性蛋白酶 蛋白酶酶学性质 微生物生理1碱性蛋白酶概述蛋白酶（protease），水解蛋白质肽键的一类酶的总称。蛋白酶是一种重要的工业化应用的酶制剂,占酶制剂市场的65%以上1，广泛用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业。蛋白酶执行大量的不同的生理功能，从细胞水平扩展到器官和有机体水平，导致比如止血和发炎等的级联系统。它们负责包括在正常生理功能和在非正常状态下的病理生理功能的复杂过程。它们也

2、存在于致病生物体的生活史中，这就使它们成为一个潜在的发展治疗因子的对象，来治愈如癌症和艾滋病等可怕疾病。此外，蛋白酶应用于食品和清洁剂工业具有悠久的历史。在皮革工业中用于脱毛和皮革软化，来替代以往有毒化学药剂的使用还是一个相对较新的领域，这同时也增加了它的生物化学方面的重要性2。蛋白酶的多样性以及它们特定的功能已经引起了世界范围内对开发它们的生理学和生物工程的的广泛关注。微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广等特点，微生物来源的蛋白酶，由于具有培养简便，产量丰富等特点，适于工业化生产而得以广泛应用。近三十年来，人们对微生物蛋白酶的研究越来越深入，高产工程菌的选育以及对蛋白酶

3、的纯化、结构和性质研究又为大规模工业化生产及应用提供了坚实的基础3。随着生物化学分子生物学、基因工程、蛋白质工程的兴起，蛋白酶的研究和应用进入了一个崭新的阶段。而碱性蛋白酶也因其稳定的生物活性和相对特殊的作用条件而成为目前市场上应用最为广泛的蛋白酶之一。2 蛋白酶的分类蛋白酶是一类复杂的水解酶，它们在生理、生化和催化特性方面有很大的差异。目前，对蛋白酶进行分类主要依据三个标准:裂解反应的类型；裂解位点的化学特征;与结构相关的进化关系。根据国际生物化学和分子生物学命名委员会的建议，微生物蛋白酶根据作用于蛋白酶底物的位点总体上分为内肽酶和外肽酶；外肽酶切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键而游离

4、出氨基酸。其中作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。内肽酶切开蛋白质分子内部肽键，生成分子量较小的多肽类。根据它们的活性中心和必需基团分又可以分为四类：1丝氨酸蛋白酶、2天冬氨酸蛋白酶、3半胱氨酸蛋白酶、4金属蛋白酶，这是目前比较流行的分类方法；根据其最适作用pH还可以分为酸性蛋白酶，中性蛋白酶和碱性蛋白酶。2.1 丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶广泛存在于各种生物体中，这类酶的活性部位又称活性丝氨酸残基，可被二异丙基氟磷酸（DFP）或者苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制，很多丝氨酸蛋白酶也可被PCMB所抑制。该类酶水解时通常分为两步反应，在反应中被切断的氨基酸或肽链片段与酶之间会以共价相

5、连，这一酞基化步骤之后跟随一个去酞基化过程，这一去酞基化过程是一个水的亲核反应，结果是肽链的水解。丝氨酸内肽酶可分为三类:类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、类弹性蛋白酶，它们分别作用于带正电氨基酸残基、疏水残基、小疏水残基，多数丝氨酸蛋白酶的催化基团是Ser-His-Asp的三联体。丝氨酸蛋白酶它们对底物的特异性较小，具低的分子量（18.535KDa）。多数丝氨酸蛋白酶的等电点为4.46.2之间。此类酶几乎全是内肽酶，胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶等都属此类。其中最知名的碱性丝氨酸蛋白酶是由Bacillus licheniformis产生的枯草杆菌蛋白酶。真菌的碱性丝氨酸蛋白酶被认为参与体内激素原的

6、加工过程。2.2 天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸蛋白酶的特性是在低pH（34）条件下具有最大活性，活性中心含有天冬氨酸残基，广泛存在于真菌中，很少在细菌中存在。这类酶对其他三类酶的抑制剂不敏感。大多数天冬氨酸蛋白酶的分子量在3045KDa之间，等电点通常在3.44.6之间。它们要求切点两旁的氨基酸为芳香族氨基酸残基。多数真菌的天冬氨酸蛋白酶在中性pH条件下不稳定。其催化活性依赖于天冬氨酸残基，晶体学研究表明，天冬氨酸蛋白酶的胃蛋白酶家系都具有两叶的分子结合剂如EDTA，该酶的活性位点位于两叶之间，每一叶都为天冬氨酸蛋白酶提供了维持其活性所必须的一对天冬氨酸残基中的一个，这两叶彼此相互同源，通过基因复制

7、得到。胃蛋白酶家系中大部分酶活性位点的天冬氨酸残基都在一个10Asp-Thr-Gly-Xaa的基序中，该基序同时位于两叶的氨基端和羧端，其中Xaa可以是Ser或Thr，其侧链可通过氢键与Asp相连。2.3 半胱氨酸蛋白酶只有少数真菌可产生半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶的催化机制与丝氨酸蛋白酶的极其相似，其中存在的Cys-His-Asn三联体和丝氨酸蛋白酶中的Ser-His-Asp是同源的。这类酶活性部位有一活性半胱氨酸残基，活性可受到氧化剂、烷化剂和重金属的抑制。半胱氨酸、EDTA能够激活酶的活性。多数半胱氨酸蛋白酶的最适作用pH为58。木瓜蛋白酶、菠萝酶、无瓜果酶等植物蛋白酶以及某些链球菌蛋

8、白酶均属此类。2.4 金属蛋白酶金属蛋白酶的活性中心含有Mg2、Zn2、Co2、Fe2、Cu2等金属元素，金属螯合剂如乙二胺四醋酸（EDTA），邻菲绕啉（OP）等能将金属原子从酶蛋白剥离而引起失活，失活的酶重新加入金属离子可使酶活性恢复，这种酶也可受到氰化物及其他金属的强烈抑制。丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂对它们的活性无影响。金属蛋白酶的最适pH为59，在细菌和真菌中均有发现。多数细菌和真菌的金属蛋白酶都含有锌原子，每一个酶分子含一个锌原子。锌原子对酶的活性是必需的，钙离子对稳定酶的结构有作用。属于这一类的蛋白酶包括许多微生物中性蛋白酶、胰羧肽酶A和某些氨肽酶。3 碱性蛋白酶的来源

9、碱性蛋白酶主要存在于细菌，放线菌和真菌中。目前，商业中应用的碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌， 如丹麦酶制剂生产商NovoNordisk 使用的生产菌株就包括地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，缓慢芽孢杆菌Bacilluslentus，其它的碱性蛋白酶商业生产菌株还包括嗜碱性芽孢杆菌Bacillus alcalophilus （Gist-Brocades，荷兰）等。一些革兰氏阴性菌及真菌等也产生碱性蛋白酶。目前碱性蛋白酶生产菌株有Bacillus licheniformis，Bacillus mojavensis，Aspergillus clavatus4等。真菌比细菌产生更

10、多种类的蛋白酶。例如，Aspergillus oryzae产生酸性、中性、和碱性蛋白酶。真菌蛋白酶在一个比较广的pH（411）范围内都具有活性而且显示出显著的底物特异性。然而，它们与细菌相比反应速率较低，耐热性较差。真菌酸性蛋白酶的最适pH为44.5，在pH2.56.0范围内稳定。因为它们较窄的反应pH和稳定特异性，所以在乳酪生产工业中具有特殊的用途。真菌的中性蛋白酶是金属蛋白酶，在pH7.0有活性，且可被螯合剂抑制。真菌碱性蛋白酶也被用作饲料添加剂。4 碱性蛋白酶的性质41分子量碱性蛋白酶的分子量范围多数集中在18-35Kda，少数碱性蛋白酶的分子量例外，达到45Kda或82Kda，也有少数

11、蛋白酶分子量很小，有的甚至只有8Kda5。在一些芽孢杆菌中，碱性蛋白酶的电泳条带呈现出多样性。这种多样性一方面是由于酶蛋白分子中天冬酰胺或谷氨酰胺残基可逆的脱氨基作用造成，另一方面是因为一些蛋白酶也存在自我剪切作用。4.2 最佳pH及温度大部分碱性蛋白酶的最适pH值为911，如Bacillus sp.所产碱性蛋白酶最适pH为1011，少数蛋白酶最适pH可达到更高，如Bacillus clausii GMBE 22 所产蛋白酶最适pH为。碱性蛋白酶的最适温度分布范围较广，分离自嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp B18的蛋白酶最适温度达到85。史劲松等从冰川中分离出一株耐冷菌Bacillus c

12、ereus SYP-A2-3，所产冷适性蛋白酶最适温度为426； 4.3 金属离子对酶活性的影响二价金属离子如Ca2，Mg2，Mn2等能提高碱性蛋白酶活力，此外Ca2能增强绝大多数蛋白酶的热稳定性。研究认为Ca2可以保护这些酶热变性并且在高温情况下保护其防止构象改变。另外，特定的Ca2结合位点还影响到蛋白酶的活性及稳定性。在一些研究中，发现Hg2会阻遏酶活，重金属离子对酶的毒性作用在其他一些文献中也有所论述。大部分二价金属离子对酶活有促进作用，5mmol/L 的Mn2 + ，Fe2 +，Zn2 +，Mg2 +，Co2 +能显著促进Bacillussubtilis 分泌的蛋白酶的活力7，其中Mn

13、2+的作用最为显著，处理后酶活升至167%。5 高产菌株的选育高碱性蛋白酶活力菌株是工业化生产实现的前提和基础，然而从自然界分离得到的碱性蛋白酶菌株酶活力一般都较低，不能直接应用于工业化生产。为此，必须对产酶菌株进行定向或非定向性的改造，以提高原始菌株产酶能力符合工业化生产的要求，一般可以采取以下措施：5.1利用传统的物理、化学因子单独或复合诱变选育高活力菌株早期许多研究表明，通过物理、化学因子单独或复合诱变选育高活力产碱性蛋白酶菌株是一种切实可行的方法，至今仍不失为菌种选育的一种好方法。那淑敏8(1987)利用NTG和紫外线复合诱变地衣芽孢杆菌获得变异株Bacillus lichenifor

14、mis 533-F13，产酶活力达10000U/mL，相对出发菌株酶活提高了近20倍。由此可见，通过物理、化学因子诱变或优化发酵条件选育高活力菌株的确是一个切实可行的办法。5.2 原生质体技术选育碱性蛋白酶高产菌株通过原生质体技术改良碱性蛋白酶菌株有很多成功的研究报道9-10。潘延云9用原生质体融合的方法，将碱性蛋白酶生产菌2709与含有碱性蛋白酶基因克隆载体pDW2的工程菌枯草杆菌BDl05进行原生质融合，得到1株高效表达的高产碱性蛋白酶的工程菌A16，通过双亲的形态学，营养特征和不同抗药性为筛选指标进行观察证明A16携有双亲的遗传物质，表型和生长特征与2709相似，发酵液酶活比2709高5

15、0%100%，摇瓶发酵的产酶水平达到国际领先水平，最高可达30000 U/mL。薛林贵10等人对地衣芽孢杆菌(Bacillus lichniformis)53号菌株在原生质体形成最佳条件下进行原生质体制备并多次紫外线诱变终得一株稳定高产的碱性蛋白酶产生菌53-G38-6，酶活由原来的1104U/mL提高到22080 U/mL，活力提高了近20倍。杨文博11以短小芽孢杆菌Bacillus pumilus C172为出发菌株，采用UV照射、DES和原生质体NTG诱变等复合诱变处理选育出C172-415突变株，碱性蛋白酶摇瓶产酶最高活力达13977 U/mL。原生质体诱变选育高产碱性蛋白酶菌株还有大

16、量报道。实践表明，制备原生体后对其进行诱变能大大提高菌种产酶量或直接原生质融合选育高产碱性蛋白酶菌株不失为一个好的方法。5.3 利用基因工程技术选育高产菌株的选育自1985年Jacobs12第一次通过建立基因文库克隆了第一条碱性蛋白酶基因以来，利用基因工程手段获得高产碱性蛋白酶高产工程菌已成为当前蛋白酶研究的热点之一。利用基因工程技术手段提高菌种的产酶能力，不仅使菌种的产酶量有极大的提高，而且能够改变酶的某些特性以求满足生产需求，促进了理论研究与实践应用的紧密融合，大大缩短了从探索研究到生产应用的周期，同时也克服了传统菌种选育方法的随机性和盲目性，为微生物育种提供了一条新的思路和途径。杨文博1

17、3等人将Bacillus pumilus C172-60为受体株，采用原生质体转化技术将携带糖化型-淀粉酶基因(Amy)、Cmr基因，Kmr基因的pBX96质粒成功导入到受体内，并获得能直接利用淀粉作为碳源并保留噬菌体抗性、产碱性蛋白酶的工程菌C172-306(pBX96)。雷虹14等成功利用PCR技术从地衣芽孢杆菌2709菌株的染色体DNA中扩增了2709碱性蛋白酶的编码序列并肯定了2709菌碱性蛋白酶属典型的Sublilisin Carlberg。5.4蛋白质工程技术选育高产菌株的选育蛋白质工程(protein enginerring)是指通过对天然蛋白质或蛋白质衍生物的结构分析，确定其三

18、级结构模型，然后通过分子设计合成突变基因，经筛选突变体DNA，合成相应蛋白质的方法15，主要集中在提高碱性蛋白酶的稳定性，抗氧化性及改变蛋白酶的专一性等方面。我国在蛋白质工程技术选育高产碱性蛋白酶菌株取得了重大的成就。王贤舜16用蛋白质工程的方法在计算机图像系统上对预定的分子改造方案进行了预测，成功地完成了构建1个分泌热稳定性比野生型枯草杆菌蛋白酶E高4倍的工程菌。1998年wells和Estell将BPN酶与底物残基侧链关系密切的三个残基逐步改换成Carlsberg酶底物的残基，同时对于活性部位的Ser221，His64，Asnl55也做了替换，实现了BPN酶的专一性转化为类似于Carlsb

19、erg酶的专一性17。6 研究前景目前，我国碱性蛋白酶研究已经达到了分子水平，利用基因工程手段和蛋白质工程手段定向改造碱性蛋白酶产生菌产酶活力及酶学性质是今后很长时间的一个发展趋势。随着生物技术基础研究的深入和应用技术手段的完善，碱性蛋白酶研究将会进入一个全新的阶段。今后，我国碱性蛋白酶研究方向主要转向：继续运用生物技术和蛋白质手段进一步提高目前工业微生物菌种产酶能力和酶的性质。如构建、克隆高产碱性蛋白酶基因文库并高效表达，选育耐热、耐碱、抗噬菌体和抗氧化高产碱性蛋白酶菌株等。建立新的碱性蛋白酶高产基因宿主系统，为碱性蛋白酶构建更多的表达载体，解决革兰氏阴性胞外酶分泌问题。为蛋白酶的应用开拓新

20、的渠道，特别是在医学(生物制药及化疗等)及生物技术领域中的应用。选育极端碱性蛋白酶产生菌。如低温碱性蛋白酶产生菌、耐高温碱性蛋白酶。综上所述，碱性蛋白酶研究是一个富有前景的领域，同时，也相信随着碱性蛋白酶研究的进一步深入，碱性蛋白酶将会成为一个新的经济增长点。参考文献1 林影，卢荣德.2000.嗜热酶研究进展.极端酶及其工业应用J.工业微生物，30:51-53.2 胡学智. 酶制剂工业概况及其应用进展J.工业微生物,2003,33(4):34-37.3 杨胜远，陆兆新.2004.微生物低温碱性蛋白酶的研究进展，30:93-98.4 Hajji M，Kanoun S，Nasri M，et al.

21、 Purification and characterization of an alkaline serineprotease produced by a new isolated Aspergillus clavatus ES1J. Process Biochemistry，2007，42(5)：791-797.5 Kazunari A，Tetsuya U，Hiroo Y.Isolation and characterization of a serine protease from the sprouts of Pleioblastus hindsii NakaiJ.Phytochemistry，2000，(54)：559-565.6 史劲松，许正宏，吴奇凡等.冰川环境耐冷菌的冷适蛋白酶分离纯化及酶学性质J. 应用与环境生物学报，2006，12(1)：72-75.7 唐雪明，邵蔚蓝，沈微,王正祥,诸葛健,方惠英.地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及序