实验八、转基因生物的GUS检测ppt课件

1、技术运用：技术运用：1. Gus基因与目的基因衔接构建交融基基因与目的基因衔接构建交融基因进展组织定位；因进展组织定位； 2. gus基因与启动子衔接来研讨启动子的表达的组织基因与启动子衔接来研讨启动子的表达的组织特异性。特异性。要求：了解经过显色反响检验外源基因的表达情况要求：了解经过显色反响检验外源基因的表达情况的方法，了解报告基因的概念。的方法，了解报告基因的概念。资料：资料： 转化的植物组织、器官、原生质体、转化的植物组织、器官、原生质体、 种子的胚及萌生的幼苗等。种子的胚及萌生的幼苗等。 非转化的一样资料阴性对照。非转化的一样资料阴性对照。试剂：试剂： 5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲

2、哚-葡萄糖苷酸酯葡萄糖苷酸酯XGluc ；N-N-二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺(DMF) ； NaH2PO4； Na2HPO4 ； Na2EDTA ；Triton-100； K3 Fe(CN) 6 铁氰化钾；铁氰化钾；K4 Fe(CN) 6 亚铁氰化钾亚铁氰化钾原理原理 适宜的反响条件下，适宜的反响条件下，- 葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶GUS可将可将XGluc水解成蓝色物质，因水解成蓝色物质，因此具有此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜察看到。蓝色斑点，可用肉眼或显微镜察看到。相关知识链接标志基因 标志基因是协助对转基因生物体进展标志基因是协助对

3、转基因生物体进展挑选和鉴定的一类外源基因，包括选择标挑选和鉴定的一类外源基因，包括选择标志基因和报告基因。志基因和报告基因。 常用的选择标志基因包括有抗生素抗性基常用的选择标志基因包括有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因因和除草剂抗性基因Bar 基因。标志基因。标志基因通常与目的基因构建在同一表达载体基因通常与目的基因构建在同一表达载体上，一同转入生物，但有时，标志基因本上，一同转入生物，但有时，标志基因本身就是目的基因，如除草剂抗性基因。身就是目的基因，如除草剂抗性基因。 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定基因

4、，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调理序列的基因。把它的编码序列和基因表达调理序列相交融构成嵌合基因，或与其它目的基因相交相交融构成嵌合基因，或与其它目的基因相交融，在调控序列控制下进展表达，从而利用它融，在调控序列控制下进展表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，挑选的表达产物来标定目的基因的表达调控，挑选得到转化体。得到转化体。 报告基因是研讨基因调控的有力工具，常用于报告基因是研讨基因调控的有力工具，常用于判别实验基因的转化效率以及基因的调控与功判别实验基因的转化效率以及基因的调控与功能的研讨实验中。能的研讨实验中。报告基因必需具备的条件报告

5、基因必需具备的条件 (1)已被克隆和全序列已测定已被克隆和全序列已测定; (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无类似的内源性表达产物转染的细胞中无类似的内源性表达产物; (3) 报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好，表达产物能进展定量测定。敏度高而且重现性好，表达产物能进展定量测定。 (4) 细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的 检测。检测。常见的报告基因：常见的报告基因： 在植物基因工程研讨领域，已运用的报告基因有

6、在植物基因工程研讨领域，已运用的报告基因有以下几种：以下几种： 常用的报告基因包括常用的报告基因包括葡萄糖苷酸酶报告基葡萄糖苷酸酶报告基因因(gus), 胭脂碱合成酶基因胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶、章鱼碱合成酶基因基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶、新霉素磷酸转移酶(NPTll)、氯霉素乙、氯霉素乙酰转移酶基因酰转移酶基因(cat)、-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-gal，-galactosidase)、萤光素酶、萤光素酶(luc，luciferase)、和、和绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因(gfp，green fluorescence protein)等等. 利用报告基因表达载体的研

7、讨技术的优点：利用报告基因表达载体的研讨技术的优点： 其一，避开内源和外源基因表达程度的影响：对于报告基其一，避开内源和外源基因表达程度的影响：对于报告基因编码产物的检测程度可以准确地反映基因启动子的转录因编码产物的检测程度可以准确地反映基因启动子的转录活性，不会遭到内源性基因表达产物程度的影响活性，不会遭到内源性基因表达产物程度的影响. 第二，易于检测：假设研讨不同基因启动子的转录活性，第二，易于检测：假设研讨不同基因启动子的转录活性，采取本身基因表达产物的检测方法，必需建立各种基因表采取本身基因表达产物的检测方法，必需建立各种基因表达产物的检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不达产物的

8、检测方法，有些基因的表达产物的检测技术还不具备，或者很难建立，而采用报告基因的研讨战略就很容具备，或者很难建立，而采用报告基因的研讨战略就很容易处理这一问题，只需建立稳定的报告基因表达的检测技易处理这一问题，只需建立稳定的报告基因表达的检测技术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研讨。术就可以用于不同基因启动子转录活性的检测和研讨。gus基因简介基因简介gusgus基因是目前常用的一种报告基因，是基因是目前常用的一种报告基因，是D D 葡葡萄糖苷酸酶萄糖苷酸酶(gus)(gus)基因，其表达产物基因，其表达产物-葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸酶酶 (GUS) (GUS)能催化裂解一系列的能催化裂解一

9、系列的葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸 ，它，它可以将可以将5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-葡萄糖苷酸酯葡萄糖苷酸酯X XGlucGluc分解为蓝色的物质分解为蓝色的物质, ,也可以将也可以将4-4-甲基甲基- -伞形花伞形花酮酮-D-D-葡萄糖苷酯葡萄糖苷酯(4-MUG)(4-MUG)分解为蓝色物质。分解为蓝色物质。 其其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。gusgus基因的最大优点是它能测定外源基因表达的详细基因的最大优点是它能测定外源基因表达的详细细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及的。细胞和组织部位，这是其它报告基因所不能及

10、的。药品配方药品配方 1 1X XGlucGluc母液：母液：X-GlucX-Gluc，用，用N-N-N-N-二甲基酰胺二甲基酰胺(DMF)(DMF)配成配成20mM20mM的储存液，分装成每管的储存液，分装成每管100L100L，保，保管于管于-20-20。 2 2X XGlucGluc基液基液50mM PBS50mM PBS， pH7.0 pH7.0。 配制方法：配制方法：50mM NaH2PO40.78g/100ml50mM NaH2PO40.78g/100ml；50mM 50mM Na2HPO4 1.79g/100mlNa2HPO4 1.79g/100ml共同溶解；共同溶解； Na2E

11、DTA Na2EDTA 10mM10mM，372mg372mg，Triton-100Triton-1000.10.1，100l100l, K3 Fe(CN) 6 , K3 Fe(CN) 6 铁氰化钾铁氰化钾0.5mM0.5mM，16.5mg16.5mgK4 Fe(CN) 6 K4 Fe(CN) 6 亚铁氰化亚铁氰化钾钾0.5mM0.5mM，21.1mg21.1mg 染色液：染色液：50l X-Gluc50l X-Gluc母液母液450l450l基液基液染色方法染色方法 将预备好的试材浸泡在染液，于将预备好的试材浸泡在染液，于25372537保温保温1 1小时至过夜。小时至过夜。 叶片等绿色资料转入叶片等绿色资料转入70%70%乙醇中脱色乙醇中脱色2323次，至阴性对照资料呈白色。次，至阴性对照资料呈白色。 肉眼或显微镜下察看，白色背景上的蓝色肉眼或显微镜下察看，白色背景上的蓝色小点即为小点即为GusGus表达位点。表达位点。实验步骤实验步骤 将预备