多肽与蛋白质类药物

1、医学ppt1 第十三章第十三章 多肽与蛋白质类药物多肽与蛋白质类药物 第一节第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法多肽及蛋白质类药物的生产方法 一、蛋白质类药物的分离与纯化一、蛋白质类药物的分离与纯化 （一）材料选择（一）材料选择 蛋白质类药物的原料来源有动植物组织和微生物动植物组织和微生物等，原则原则是要选择富含所需蛋白质多肽富含所需蛋白质多肽成分的、易于获易于获得得和易于提取易于提取的无害生物材料。 对天然蛋白质类药物，为提高质量质量、产量产量和降低生降低生产成本产成本，对原料的种属种属、发育阶段发育阶段、生物状态生物状态、来来源源、解剖部位解剖部位、生物技术产品的宿主菌生物技术产品的宿主菌

2、或细胞细胞都有一定的要求，了解这可使分离纯化工作事半功倍。医学ppt2 （1）种属）种属 牛胰含胰岛素单位比猪胰高，牛为4000IUkg胰脏，猪为3000IUkg胰脏。抗原性抗原性猪比牛的低。前者与人胰岛素人胰岛素相比，只有1个氨基酸个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸个氨基酸的差异。（2）发育生长阶段）发育生长阶段 幼年动物的胸腺胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须胸腺原料必须采自幼龄动物。 HCG在妊娠妇女6070天的尿中达到高峰；到妊娠18周已降到最低水平。然而HMC必须从绝经期的妇女尿中获取。 肝细胞生长因子生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎胎儿、胎猪或胎牛肝中儿、胎猪或胎牛肝

3、中获得的。若用成年动物，必须经过肝脏部分切除手术后部分切除手术后，才能获得富含肝细胞生长因富含肝细胞生长因子子的原料。医学ppt3 （3）生物状态）生物状态 动物饱食后宰杀饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素胆囊收缩素的分泌使胆汁排空胆汁排空，对胆汁的收集不利收集不利。严重再生障碍性贫严重再生障碍性贫血血症患者尿中的EPO含量增加含量增加。 （4）原料来源）原料来源 血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，而稳定性以颚下腺稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶蛋白水解酶。 （5）原料解剖学部位）原料解剖学部位 猪胰脏中，胰尾胰尾部分含激素较多，而胰头胰头部分

4、含消化酶消化酶较多。如分别摘取分别摘取则可提高各产品的收率。 胃膜素胃膜素以采取全胃粘膜全胃粘膜为好，胃蛋白酶胃蛋白酶则以采取胃底部粘膜底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化腺胃底部粘膜富含消化腺。医学ppt4 （6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌宿主受体菌或细胞细胞也应考虑到后处理后处理的问题。大肠杆菌表达大肠杆菌表达，由于其不能将所表达的蛋白质分泌蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类毒素类有害因子。 用枯草杆菌或酵母菌枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏

5、糖基化糖基化等翻译及修饰的缺陷； 用动物细胞和昆虫细胞表达动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。 用肿瘤细胞肿瘤细胞作宿主细胞制成的医药产品还应考虑到其安全性问题安全性问题。医学ppt5（二）蛋白质提纯的一般方法二）蛋白质提纯的一般方法 根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质：分分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对其他分子的子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对其他分子的生物亲和力等。生物亲和力等。1、根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质、根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质 蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质两性电解质，在一定pH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子正、负离子

6、的趋势相等，或解离成两性离子两性离子，其净电荷为零，此时环境的pH值即为该蛋白质的等电点等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、导电性、溶解度、粘度、渗透压等皆最小粘度、渗透压等皆最小，因此可利用蛋白质等电点利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。医学ppt6 两性物质的等电点等电点会因条件不同（如在不同离子离子强度的不同缓冲溶液强度的不同缓冲溶液中，或含有一定的有机溶媒一定的有机溶媒的溶液中）而改变。当盐存在时当盐存在时，蛋白质若结合了较多的阳离子，则等电点向较高的pH值偏移值偏移。反之，蛋白质若结合较多

7、的阴离子，则等电点移向较低的较低的pH值值。 用等电点法沉淀等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作盐析操作，而除去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作热变性操作。 等电聚焦电泳等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质分离蛋白质外，也可用于测定测定蛋白质的等电点等电点。 医学ppt72、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质 蛋白质的一个主要特点是分子大。由此可以用凝胶凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其他小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。注意注意 用超滤法超滤法时，超滤膜截留分子量常与实际情况不一致。分子量相

8、近的蛋白质由于在介质中有呈线呈线形溶质或者是球形溶质的区别形溶质或者是球形溶质的区别，可能出现不同的结果。 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团酸性基团，故有较弱的离子较弱的离子交换作用交换作用，此外还有吸附作用吸附作用。在纯化蛋白质时，可采用低浓度的盐溶液（低浓度的盐溶液（0.01molL），或者用与待分离蛋白质相同的标准蛋白质预先使凝胶柱平衡使凝胶柱平衡，以期不损失所分离的蛋白质。医学ppt83、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋自质、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋自质 蛋白质的溶解度溶解度受溶液的pH、离子强度离子强度、溶剂的电解质性质电解质性质及温度温度等多种因素的影响。在同一特定条件下

9、，不同蛋白质有不同的溶解度，适当改变外界条件，可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度溶解度，达到分离的目的。 属于这一类的分离方法有蛋白质的盐溶盐溶与盐析法盐析法、结晶法结晶法和低温有机溶剂沉淀法低温有机溶剂沉淀法。 乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶剂，由于丙酮的介电常数丙酮的介电常数小于乙醇，故丙酮丙酮沉淀能力比乙醇乙醇强。医学ppt94、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质 离子交换剂作为一种固定相固定相，本身具有正离子或负离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。 蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。对

10、蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂离子交换剂。主要是取其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨率等优点。 对已知等电点等电点的物质，在pH高于其等电点时，用阴阴离子交换剂离子交换剂，在低于其等电点时，用阳离子交换剂阳离子交换剂。医学ppt105、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质 主要的手段是亲和层析法亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相应的配体配体进行特异的特异的、非共价键的可逆性结合非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。

11、 注意注意 非专一性吸附主要来自吸附剂上的离子基团离子基团和疏水基团疏水基团。解决这一问题的方法是从制备和选用吸附剂上着手。 固相化金属亲和层析（固相化金属亲和层析（IMAC）是新发展的一种亲亲和层析技术和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基咪唑基和巯基可与一些金属元素（如金属元素（如Cu2、Zn2+等）形成配位结合等）形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。医学ppt116、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质纯化蛋白质 蛋白质分子上有疏水区疏水区，它们主要由酪氨酸、亮酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧氨酸、异亮氨酸、缬

12、氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧链密集在一起形成链密集在一起形成，并暴露于分子表面并暴露于分子表面。这些疏水区，能够与吸附剂上的疏水基团结合吸附剂上的疏水基团结合，再通过降低降低介质的离子强度和极性介质的离子强度和极性，或用含有去垢剂的溶剂含有去垢剂的溶剂，增高洗脱剂的pH值等方法将蛋白质洗脱下来。 用含酚基疏水基团含酚基疏水基团的琼脂糖纯琼脂糖纯化重组人表皮生长因子（rhEGF），纯度可达94%，回收率达82%。医学ppt127、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质质 这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程，称之为逆流分溶

13、逆流分溶。利用逆流分逆流分溶技术溶技术分离垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的。8根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质化蛋白质 蛋白质易受pH、温度、酸、碱、金属离子、蛋白、温度、酸、碱、金属离子、蛋白沉淀剂、络合剂沉淀剂、络合剂等的影响，由于各种蛋白质都存在着差异，可利用这种差异来纯化蛋白质利用这种差异来纯化蛋白质。 白蛋白白蛋白在弱酸性条件下弱酸性条件下加辛酸钠辛酸钠可耐受耐受67的温的温度度，而其他蛋白质将变性。 医学ppt13 球蛋白或白蛋白在碱性条件下碱性条件下，可以和利凡诺利凡诺作用，形成络合物络合物而与其他蛋白质分离。细胞色素

14、C和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉三氯醋酸沉淀淀，而保存其活力。 9、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质 在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷结晶磷酸钙（羟灰石）酸钙（羟灰石）、磷酸钙凝胶磷酸钙凝胶、硅胶硅胶、皂土沸石皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。诸如催产素、胰岛素、HCG、HMG、细胞包素C等都可以通过吸附层析技术吸附层析技术进行纯化。医学ppt1410、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质 对于酶蛋白超氧化物歧化酶（SOD）的提取，因SOD能抵抗蛋

15、白酶的水解能抵抗蛋白酶的水解，可用蛋白水解酶降解其他蛋白质，以便于SOD进一步的纯化。 球蛋白、ACTH在分子中有活性中心，可用蛋白蛋白酶水解酶水解切去与生物活性无关的分子部分，保留活性分活性分子片子片断，使产品纯化产品纯化。 对于无胰岛素生物活性的胰岛素原胰岛素原，用蛋白水解酶可切去胰岛素原分子中的C-肽，使胰岛素激活。 一些活性多肽活性多肽常与其他蛋白质分子结合而不呈现活性或不能够被提取，用蛋白水解酶蛋白水解酶可以使其与其它蛋白质解离，恢复其生物活性和在溶液中的正常性质医学ppt15（三蛋白质的分离和纯化（三蛋白质的分离和纯化1时间因素时间因素 在蛋白质分离和纯化过程中，共同的问题是蛋白质

16、反应达到平衡反应达到平衡所需要的时间需要的时间，而且为避免蛋白质的变性、微生物的污染变性、微生物的污染等，操作常在低温环境中进低温环境中进行行。 为更快达到反应平衡反应平衡，应该考虑到这些因素。通常在在25时时，化学反应的速率是低温化学反应的速率是低温5时的时的34倍倍。这与物质的扩散系数有关，而扩散系数受物质的粘粘度和温度度和温度的影响。蛋白质生物大分子反应与小分子化合物不同，后者是以分、秒和毫秒计时的，而前者要10分钟以上。分钟以上。医学ppt16（四）溶液中蛋白质浓度的测定（四）溶液中蛋白质浓度的测定 溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物理、化学性物理、化学性质质，如折射率、比重、紫外光吸收

17、来测定折射率、比重、紫外光吸收来测定； 化学反应方法化学反应方法，如凯氏定氮、双缩脲反应、福林凯氏定氮、双缩脲反应、福林-酚反应测定酚反应测定；也可用染色法，如氨基黑、考马斯亮氨基黑、考马斯亮蓝测定；蓝测定； 此外还可用荧光激发、氯胺荧光激发、氯胺T、放射性同位素计、放射性同位素计数等灵敏度较高数等灵敏度较高的方法。 上述方法上述方法，紫外吸收法、双缩脲法、福林酚试紫外吸收法、双缩脲法、福林酚试剂法、考马斯亮蓝染色法最为常用剂法、考马斯亮蓝染色法最为常用。医学ppt17（五）纯度检查（五）纯度检查 测定蛋白质的纯度纯度是化学和物理学化学和物理学的概念，它和蛋白质所具有的生物活性生物活性有着更复

18、杂的关系，蛋白质的聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大地影响其生物活性生物活性，而这些因素的影响有些往往是用一般纯度检查的方法所查不出来的，纯度检查的方法有：1、HPLC或或FPLC 这是蛋白质纯度检查常用的有效方法。美国药典已规定把HPLC用于胰岛素纯度的检测项目中。 医学ppt182、电泳法、电泳法 3免疫化学法免疫化学法（适用于产生特异性抗体的蛋白）4生物测定法生物测定法 利用动物体或动物的离体器官、细胞进行生物离体器官、细胞进行生物效价的测定效价的测定，这种方法接近动物临床所产生的生物生物学效应学效应，因此实际意义也更大。5、分光光度法、分

19、光光度法（1）紫外分光光度法）紫外分光光度法（2）红外分光光度法）红外分光光度法 (蛋白分子结构有特别能级，红外提供分子指纹)医学ppt19二、多肽与蛋白质的化学合成二、多肽与蛋白质的化学合成 多肽的合成是50年代开始，在有机溶剂中有机溶剂中进行的均相反应均相反应，因此叫作液相合成法液相合成法，此法在合成分子量不太大的多肽时是比较成功的，但在合成更大的蛋白质时，产物还不能表现出全部活力表现出全部活力且不能结晶不能结晶， 1962年建立的固相合成固相合成的新方法新方法，对小肽的合成是很成功的，对大分子的合成，如124肽肽的核糖核酸酶，还不能达到天然物质的全部活力天然物质的全部活力。 目前试图合成

20、大的蛋白质以及建立快速简便的合建立快速简便的合成方法成方法是多肽合成化学的特征特征。 医学ppt20在多肽合成中，一般需要以下几个主要步骤在多肽合成中，一般需要以下几个主要步骤： 氨基保护和羧基活化氨基保护和羧基活化；羧基保护和氨基活化羧基保护和氨基活化；接肽和除去保护基团。接肽和除去保护基团。 （一）基团保护（一）基团保护 要实现控制多肽合成，如N-末端末端氨基酸残基的自由-NH2、C-末端末端氨基酸残基的自由-COOH以及侧链上的一些活泼基团活泼基团，加以封闭或保护封闭或保护。待肽链形成之后，再将保护基除去。作为保护基，必须既能在必须既能在接肽时起到保护作用，在接肽以后，能很容易地除接肽时

21、起到保护作用，在接肽以后，能很容易地除去，且不致引起肽链的断裂去，且不致引起肽链的断裂。医学ppt21 应用最多的氨基保护剂氨基保护剂是苄氧羰酰氯（苄氧羰酰氯（Cbz-Cl），可用催化氢化法催化氢化法或钠氨法钠氨法（用金属钠在液氨中处理用金属钠在液氨中处理）除去保护基除去保护基，也可用叔丁氧羰酰氯（叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）作保保护剂护剂，用稀盐酸或乙酸稀盐酸或乙酸在室温除去保护基室温除去保护基。 羧基保护剂通常用无水乙醇或甲醇在盐酸存在无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化酯化，使羧基接上烷基接上烷基。除去保护基可在常温下用氢氧化钠皂化法氢氧化钠皂化法。 有些氨基酸氨基酸还有其他功能基团功能基

22、团，在合成肽时，都要用适当的保护基团加以保护。例如组氨酸的咪唑基咪唑基、丝氨酸的羟基羟基、酪氨酸的酚基酚基、半胱氨酸的巯基巯基等，都可用苄基（苄基（B2）保护）保护，用钠氨法钠氨法除去。谷氨酸和天门冬氨酸的及-羧基羧基可用-及及-苯甲酯苯甲酯保护，用催化氢化法催化氢化法除去。精氨酸的胍基胍基用对甲基磺酰基对甲基磺酰基（Tos-）保护）保护。医学ppt22（二）肽的液相合成法（二）肽的液相合成法 接肽反应除用缩合剂缩合剂来完成外，还可以用分别活化参与形成肽链的氨基和羧基氨基和羧基的方法来完成。因活活化氨基化氨基的反应激烈，而且常常产生消旋化消旋化，所以，总是采用羧基活化羧基活化的方法，合成肽的常

23、规方法是从C-端向端向N-端进行端进行。 肽的合成法可分为阶梯伸长法阶梯伸长法和片断缩合法片断缩合法。阶梯伸长法是将带有R-O-CO-型保护基型保护基的氨基酸（不是肽）的羧基活化，从肽的C-端开始每次接上一个氨基酸，逐步递增的办法。这是合成比较小的肽或肽段常采用的方法。片断缩合法是由小肽缩合成大肽的方法，为了避免消旋为了避免消旋，常用叠氮法叠氮法接肽。医学ppt232，片断缩合法，片断缩合法 由小肽合成大肽时常用叠氮法叠氮法，因叠氮法有较好的产品光学纯度（不消旋）。 由小肽接成大肽时，为了保证光学纯度，应尽量利用Gly和和Pro这两个氨基酸的C-末端接肽末端接肽。 医学ppt24（三）肽的固相

24、合成法（三）肽的固相合成法 在固相合成中，肽链的延长是在不溶性的聚苯聚苯乙烯树脂载体上进行的乙烯树脂载体上进行的。合成多肽肽的C-末端末端先和氯甲基聚苯乙烯树脂（氯化苄酯树脂）反应形成苄酯苄酯，然后按肽肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基酸逐个加上去，使肽链延长。 固相法比液相法操作简便，时间缩短，可以自动可以自动化化。在我国医药工业用。人工合成催产素、促黄体生成素释放因子（LRH），不仅产量高，而且比天然产品好。医学ppt25医学ppt26第二节第二节 多肽类药物多肽类药物（一）概述（一）概述 活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域，生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺、组织器活性多肽

25、主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的官、分泌细胞和体液中产生或获得的。 许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前蛋白质前体体，经过酶的加工剪切酶的加工剪切转化而来的有共同的来源，相似的结构，保留着若干彼此所特有的生物活性生物活性。 研究活性多肽结构活性多肽结构与功能功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系结构的异同与其活性的关系，将有助于设计和研设计和研制制新的活性多肽药物。医学ppt27 多肽药物的种类多肽药物的种类1、多肽激素、多肽激素2、多肽类细胞生长调节因子、多肽类细胞生长调节因子3、含有多肽成分的其他生化药物、含有多肽成分的其他生化药物 医学ppt28二

26、、主要多肽类药物的制备二、主要多肽类药物的制备（一）胸腺激素（一）胸腺激素（Thymus hormones） 胸腺是一个激素分泌器官胸腺是一个激素分泌器官，对免疫功能免疫功能有多方面的影响。胸腺依赖性胸腺依赖性的淋巴细胞群淋巴细胞群T细胞细胞直接参与有关免疫反应。 胸腺对T细胞发育的控制细胞发育的控制，主要通过由胸腺所产生的一系列胸腺激素一系列胸腺激素，促使T细胞的前身细胞前前T细胞分化、增殖、成熟细胞分化、增殖、成熟为T细胞的各种功能亚群，由此控制调节免疫反应的质与量控制调节免疫反应的质与量。现已知某些免疫免疫缺陷病缺陷病、自身免疫性疾病自身免疫性疾病、恶性肿瘤恶性肿瘤以及老年性退化性病变等

27、皆与胸腺功能胸腺功能的减退及血中胸腺激素胸腺激素水平的降低有关。医学ppt291、胸腺素（、胸腺素（Thymocln） 胸腺激素制剂胸腺激素制剂总的说来都与调节免疫功能有关都与调节免疫功能有关。 （1）结构和性质）结构和性质 胸腺素组分5是由在80热稳定热稳定的4050种多肽种多肽组成的混合物混合物，分子量在分子量在100015000之间之间，等电点在等电点在3.59.5之间之间。 为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较鉴别和比较，根据它们的等电点等电点以及在等电聚焦分离等电聚焦分离时的顺序而命名。共分三个区域三个区域：区区包括等电点低于低于5.0的组分，区区包括等电点在5.07.0之间之间

28、的组分，区区则指其等电点在7.0以上以上者（此区内组分很少）。对分离的多肽进行免疫活性测定，有活性的称为胸腺素有活性的称为胸腺素。医学ppt30（2）生产工艺：）生产工艺：工艺路线工艺路线医学ppt31工艺过程工艺过程提取提取 匀浆、离心匀浆、离心加热去杂蛋白加热去杂蛋白 提取液80加热加热15min，沉淀沉淀 -10丙酮丙酮， 超滤超滤 取分子量在15000以下的超滤液以下的超滤液。脱盐、干燥脱盐、干燥 超滤液经Sephadex G-25脱盐后，冷冻冷冻干燥干燥得胸腺素。（3）检验方法：）检验方法：活力测定：E-玫瑰花结升高玫瑰花结升高百分数不得低于10；分子量15000以下。（4）作用与用

29、途：）作用与用途：为免疫调节剂。医学ppt322、胸腺肽（、胸腺肽（Thymus peptides）（1）结构和性质）结构和性质：胸腺肽中主要是分子量分子量9600和7000左右的两类蛋白质或肽类，氨基酸组成达15种种，必需氨基酸含量高，还含有RNA 0.20.3mgmg，DNA0.120.18mgmg。对热较稳定对热较稳定，加温80生物活性不降低。经蛋白水解酶蛋白水解酶作用，生物活性消失。医学ppt33（2）生产工艺：）生产工艺： 工艺路线工艺路线 工艺过程工艺过程 超滤、提纯、分装、冻干超滤、提纯、分装、冻干 加加3甘露醇作赋形剂甘露醇作赋形剂。（3）检验方法）检验方法：活力测定同胸腺素。

30、分子量分子量10000以下。（4）作用与用途）作用与用途：胸腺肽可调节细胞免疫功能调节细胞免疫功能，有较好的抗衰老和抗病毒作用。无过敏反应和不良的副作用无过敏反应和不良的副作用。医学ppt34（二）促皮质素（二）促皮质素（Adrenocorticotropic hormone，ACTH）1结构和性质结构和性质: 垂体垂体包括腺垂体和神经垂体腺垂体和神经垂体，可分泌多种激素多种激素。 促皮质素是从垂体前叶垂体前叶提取出来的一种多多肽激素肽激素。易溶于水易溶于水，等电点为等电点为6.6。在干燥和在干燥和酸性溶液中较稳定，虽经酸性溶液中较稳定，虽经100加热，但活力加热，但活力不减不减；在碱性溶液碱

31、性溶液中容易失活。能溶解于能溶解于70%的丙酮或的丙酮或70的乙醇中。的乙醇中。医学ppt35 ACTH为39个氨基酸个氨基酸组成的直链多肽，种属差异仅仅表现在第2533位上位上。ACTH的的24肽即肽即124位的片段（位的片段（ACTH 124）具有全）具有全部活性部活性。这是因为ACTH的第24位氨基酸之后的部分，不参与同受体受体的作用，它仅维持仅维持整个多肽结构的稳定性多肽结构的稳定性。 ACTH可被胃蛋白酶部可被胃蛋白酶部分水解，但仍有活力分水解，但仍有活力，ACTH在溶液中存在着高度的 螺旋螺旋。医学ppt362、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线：（2）工艺过程：）工艺过

32、程：提取提取 分离分离 精制精制CMC（羧甲基纤维素 弱酸） 717处理色、热原、负离子 梯度洗脱。732、717除盐（动态吸附） 医学ppt373、检验方法、检验方法 ACTH粗品每1mg相当于1U以上，用小白鼠胸腺萎缩法测定；ACTH精品每1mg45U以上，用去垂体大白鼠的肾上腺维生素C降低法测定。4、作用与用途、作用与用途 ACTH能维持肾上腺皮质的正常功能正常功能，促进促进皮质激素的合成和分泌合成和分泌。医学ppt38（三）降钙素（三）降钙素（Calcitonin， CT）1、结构和性质、结构和性质 降钙素降钙素是一种调节血钙浓度的多肽激素多肽激素，由甲状甲状腺腺内的滤泡旁细胞滤泡旁细

33、胞（C细胞细胞）分泌。是由32个氨基酸个氨基酸残基组成的单链多肽单链多肽，降钙素肽链的脯氨酸端脯氨酸端与生物活性有密切的关系，去掉脯氨酸则失活脯氨酸则失活。 降钙素分子量约降钙素分子量约3500，溶于水溶于水和碱性碱性溶液，不溶不溶于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳等，难溶于有机酸。水溶液中等，难溶于有机酸。水溶液中27 可保存可保存7天。天。 降钙素降钙素在人及哺乳动物体内，主要存在于甲状腺、甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织中，鱼类则在鲑、鳗、鲑、鳗、鳟等的终鳃体鳟等的终鳃体里含量较多。各种不同动物来源

34、的降钙素，氨基酸排列顺序有些差异排列顺序有些差异。医学ppt392、生产工艺、生产工艺 制造降钙素的原料主要有猪甲状腺和鲑、鳗的心脏猪甲状腺和鲑、鳗的心脏或心包膜或心包膜。用化学合成化学合成和基因工程技术基因工程技术制备降钙素已获成功。（1）工艺路线：）工艺路线： 提取、分离、精制提取、分离、精制制丙酮粉、离心与过滤（工业考虑）、离子洗脱分离。医学ppt403、检验方法、检验方法 生物活性测定方法生物活性测定方法：样品用经过0.1molL醋酸钠溶液稀释过的0.1白蛋白溶液溶解，取0.2ml样品按倍比稀释法配制，选用雄性大白鼠，静脉注射静脉注射1h收收集血液集血液。血样品的血清钙值采用原子吸收光

35、谱法测定原子吸收光谱法测定，对照采用MRC标准品，该标准品是从猪甲状腺中提取的。将标准品将标准品稀释至所需要的稀释度2.5、5、10和20MRCmU0.2ml，然后用同样方法给大鼠注射用同样方法给大鼠注射，1小时后测定血清钙值。根据标准品测定样品的生物活根据标准品测定样品的生物活性。性。医学ppt414、作用与用途、作用与用途 降钙素的主要功能是降低血钙降低血钙。由于降钙素有抑制破骨细胞活力破骨细胞活力的作用，所以能抑制骨盐的溶解吸收，从而阻止钙从骨中释出阻止钙从骨中释出。 血钙高可促使降钙素降钙素分泌增加，使血钙降低，血钙低时可促使甲状旁腺素甲状旁腺素分泌增加而使血钙升高，两者互相制约，共同

36、维持血钙平衡共同维持血钙平衡。 医学ppt42第三节第三节 蛋白质类药物蛋白质类药物 一、概述一、概述 现正从微生物和动物细胞微生物和动物细胞的表达表达转向基因动植物基因动植物发展。鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的抗原抗原性性、容易失活容易失活、在体内的半衰期短半衰期短、用药途经用药途经受限等难以克服的缺点，对一些蛋白质生化药物进行结构修结构修饰饰、应用计算机图像技术研究蛋白质蛋白质与受体受体及药物的相互作用、发展蛋白质工程蛋白质工程及设计相对简单的小分子来代替某些大分子蛋白质类药物，并且起到增强或增增强或增加选择性加选择性疗效的作用等，已成为前瞻性的重要任务之一。医学ppt43主要蛋白质

37、类药物有以下几类：主要蛋白质类药物有以下几类：1、蛋白质激素2、血浆蛋白质3、蛋白质类细胞生长调节因子4、粘蛋白5、胶原蛋白6、碱性蛋白质7、蛋白酶抑制剂 8、植物凝集素医学ppt44二、主要蛋白质类药物的制备二、主要蛋白质类药物的制备（一）白蛋白（一）白蛋白（Albumin）1、结构和性质、结构和性质 白蛋白白蛋白又称清蛋白清蛋白，是血浆中含量最多的蛋白质，约占总蛋白的总蛋白的55。同种同种白蛋白制品无抗原性无抗原性。主要功能是维持血浆胶体渗透压血浆胶体渗透压。 白蛋白为单链单链，由575个氨基酸个氨基酸残基组成，分子量为65000，pI4.7，沉降系数（沉降系数（S20，w）4.6，电泳迁

38、移电泳迁移率率5.92。可溶于水和半饱和半饱和的硫酸铵溶液中，一般当硫酸铵的饱和度为60以上时析出沉淀析出沉淀。医学ppt45 对酸较稳定对酸较稳定。受热受热后可聚合变性聚合变性，但仍较其他血浆蛋白质耐热耐热，蛋白质的浓度浓度大时热稳定性小热稳定性小。在白蛋白溶液中加入氯化钠氯化钠或脂肪酸的盐脂肪酸的盐，能提高白蛋白的热稳定性热稳定性，可利用这种性质利用这种性质，使白蛋白与其他蛋白质分离。 白人血浆中分离的白蛋白有两种制品两种制品： 一种是从健康人血浆中分离制得的，称人血清白人血清白蛋白蛋白； 另一种是从健康产妇胎盘血胎盘血中分离制得的，称胎胎盘血白蛋白盘血白蛋白。 制剂为淡黄色淡黄色略粘稠的

39、澄明液体澄明液体或白色疏松状白色疏松状（冻干）固体。 医学ppt462、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线： （2）工艺过程：）工艺过程：提取、分离、精制提取、分离、精制利凡诺沉淀利凡诺沉淀 弱酸性，氯化钠 超滤器浓缩 热处理，灭活病毒 除菌（过滤）。医学ppt47（二）干扰素（二）干扰素（Interferon，IFN）1、结构和性质、结构和性质 干扰素（干扰素（IFN）系指由干扰素诱生剂诱导有关生物生物细胞细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质诱生蛋白质。 这类诱生蛋白质诱生蛋白质从细胞中产生和释放产生和释放之后，作用于相应的其他同种生物细胞同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿

40、抗病毒和抗肿瘤瘤等多方面的“免疫力免疫力”。人干扰素按抗原性分为、三型三型。根据氨基酸序列的差异，又分为若干亚型若干亚型。已知IFN有有23个以上的亚型个以上的亚型，IFN-的基因位于第9对染色体上，而IFN-的基因位于第12对染色体上。三种干扰素的理化及生物学性质生物学性质有明显差异，即使是IFN-的各亚型之间，生物学作用也不尽相同。医学ppt482、生产工艺、生产工艺 我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰素的方法，达到106Umg蛋白的水平。基因工程-干扰素我国已于1989年转入中试，1990年获得生产许可证而进入工业化生产阶段；-干扰素中试生产达到年产30g以上的规模。 (1) 工

41、艺路线：工艺路线：医学ppt49（2）工艺过程：）工艺过程：含有ACD抗凝剂抗凝剂塑料袋 氯化铵处理溶血氯化铵处理溶血 起动诱生起动诱生 正式诱生正式诱生 仙台病毒仙台病毒（在10天龄鸡胚中培养4872h，收获尿囊液）3、检验方法、检验方法国际上规定，能保护50细胞免受病毒攻击的浓度即为一个IFN活性单位。我国用微量板染色的病变抑制法测定，具有操作方便、节约材料、快速、结果可靠、重复性好及便于保存标本等优点。医学ppt50本法测定本法测定 、-干扰素可任选用Wish细胞、A549细胞和Hep-2细胞，细胞浓度40万个ml左右，病毒为水泡口炎病毒（VSV）。方法为：将细胞在微量板上培养，分别加测

42、定样品和IFN标准品，待细胞已成单层即可攻毒，约2430h待病毒对照的细胞几乎全部病变时，即可进行染色，在550nm波长比色，计算出IFN单位效价，再将测得的单位校正为国际单位。医学ppt514、作用与用途、作用与用途由于干扰素的抗病毒、抗细胞分裂及免疫调节作用，可用于：（1）病毒性疾病 普通感冒、疱疹性角膜炎、带状疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎。（2）恶性肿瘤 成骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌、鼻咽癌等，可获得部分缓解。（3）用于病毒引起的良性肿瘤可控制疾病发展。医学ppt52细胞破碎的方法细胞破碎的方法1、物理方法：、物理方法：（1）磨切法：）磨切法：工业

43、上：绞肉机、刨胰机、胶体磨、球磨机、万能磨粉机实验室：匀浆机、组织捣碎机、乳钵（加玻璃粉、氧化铝）（2）压力法：）压力法：压榨法：-25-30形成冰晶体，500Mpa高压冲击。高压法：高压法：几百万几千万压力冲击物料。减压法：减压法：反复加压。渗透压法：渗透压法：浓盐中平衡。医学ppt53（3）振荡法：）振荡法：用超声震荡破碎细胞，频率10200KHZ,注意冷却。（4）冻融法：）冻融法：-15以下冻融反复操作，破碎细胞。2、化学方法：、化学方法：稀酸、稀碱、有机溶剂(如胆酸盐、氯化十二烷基吡啶)处理细胞，破坏细胞结构，释放内容物。3、生物方法：、生物方法： 组织自溶法组织自溶法: 酶解法酶解法

44、:噬菌体法：噬菌体法：感染细菌，释放内容物。医学ppt54（三）胰岛素（三）胰岛素（Insrlin） 胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万万个胰岛，胰岛由-、-和和-三种细胞三种细胞组成组成，其中-细胞制造胰岛素胰岛素，-细胞制造胰高血糖胰高血糖素素和胰抗脂肝素胰抗脂肝素，-细胞制造生长激素抑制因子生长激素抑制因子。胰岛素在-细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原前体胰岛素原存在的，进而分解分解为胰岛素进入血液循环。1结构和性质结构和性质 胰岛素由51个氨基酸组成。 不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第链二硫桥中间

45、的第8、9和和10位上的三个氨基酸位上的三个氨基酸及及B链链C末端人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸末端人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸,抗原性比抗原性比其他来源的胰岛素要低。医学ppt55医学ppt56医学ppt57胰岛素的性质有：胰岛素的性质有： 牛胰岛素的分子量为5733，猪为5764，人为5784。胰岛素的等电点为等电点为5.305.35。 胰岛素在pH4.56.5范围内几乎不溶于水范围内几乎不溶于水，易溶于易溶于稀酸或稀碱溶液；在稀酸或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解以下乙醇或丙酮中溶解；在在90%以上乙醇或以上乙醇或80%以上丙酮中难溶以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶乙醚中不溶。 在高浓度锌高

46、浓度锌的溶液中，pH68时胰岛素溶解度急剧下降 。2、生产工艺、生产工艺 胰岛素在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定。胰岛素在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定。医学ppt58工艺路线：工艺路线： 医学ppt593、注解、注解（1）离体后离体后，蛋白水解酶蛋白水解酶类能分解胰岛素使之失活。因此，要立即深冻，先在深冻，先在-30以下急冻后转入以下急冻后转入-20保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好。 在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使单独使用可提高收率用可提高收率10 %。（2）胰岛素结构修饰 ，可对胰岛素分子进行修饰和改造，以改变某

47、些性质，如提高降血糖能力提高降血糖能力、延长体内半衰期半衰期、抗热变性抗热变性、抗蛋白水解酶的降解抗蛋白水解酶的降解等。医学ppt60（3）酶促半合成人胰岛素）酶促半合成人胰岛素 。经胰蛋白酶胰蛋白酶的转酰胺作转酰胺作用用，将猪胰岛素猪胰岛素转化为人胰岛素为人胰岛素B30。再用离子交换离子交换层析纯化层析纯化，可得到高纯度人胰岛素。（4）重组DNA技术制造人胰岛素，人工合成的人胰岛素克隆到大肠杆菌中生产人胰岛素。医学ppt61医学ppt62基因表达基因表达容易进行容易进行DNA重组技术操作重组技术操作。 用于基因表达的宿主细胞分为两大类两大类，第一类为原第一类为原核细胞，核细胞，目前常用的有大

48、肠杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌链霉菌等；第二类为真核细胞第二类为真核细胞，常用的有酵母、丝酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞状真菌、哺乳动物细胞等。 宿主细胞的选择宿主细胞的选择（1）大肠杆菌）大肠杆菌 2枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 （3）链霉菌）链霉菌 医学ppt632、真核细胞、真核细胞 （1）酵母）酵母 （2）丝状真菌）丝状真菌 （3）哺乳动物细胞）哺乳动物细胞 4、检验方法、检验方法 胰岛素效价测定，各国药典规定有家免血糖降低法和小鼠血糖降低法。5、作用与用途、作用与用途 胰岛素是调节血糖水平的重要激素，能使血糖降低，医学ppt64（四）生长素（四）生长素（Growth

49、hormone，GH）1、结构和性质、结构和性质 人的生长激素是由一条191个氨基酸个氨基酸的多肽链所构成的蛋白质，等电点等电点4.9，（猪为猪为6.3），沉降系数为沉降系数为S20W2.179。N端的端的1134氨基酸氨基酸段肽链为活性所必需，C端端的一段肽链可能可能起保护作用保护作用，使生长激素在血循使生长激素在血循环中不致被酶所破坏环中不致被酶所破坏。人生长激素分子相当稳定，其活性在冰冻条件下冰冻条件下可保持数年数年，在室温放置室温放置48h无变无变化化。只有灵长类灵长类的生长激素对人有活性对人有活性。医学ppt65 生长激素与催乳素生长激素与催乳素的肽链氨基酸顺序约有近一半近一半是相同

50、的，因此，生长激素具有弱的催乳素活性弱的催乳素活性，而催乳素也有弱的生长激素的活性弱的生长激素的活性 医学ppt662、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线）工艺路线医学ppt67（2）注释：）注释：水、水、0.1mol/L、洗涤，、洗涤，0.25 mol/L抽提。抽提。硫酸铵分级沉淀除杂，分级沉淀除杂， 分子筛分子筛 DEAE-C层析（强碱强碱）用与展层剂相似的展层剂相似的透析外液。透析外液。 hGH的种属特异性很强 。 目前用枯草杆菌系统表达hGH的最高产量达1.5gL。 用大肠杆菌大肠杆菌生产的hGH及用哺乳动物细胞生产的hGH，比垂体提纯的天然比垂体提纯的天然hGH多一个蛋氨酸多一个蛋氨酸，其治疗效果更为显著。医学ppt684、检验方法、检验方法 GH生物测定用鹤子嗉囊法及大白鼠尾骨法。5、作用与用途、作用与用途医学ppt69（五）胃膜素（五）胃膜素（Gastric mucin） 1、结构和性质、结构和性质 胃膜素是从猪胃粘膜胃粘膜中提取的一种一种以粘蛋白粘蛋白为主要成分的药物。 胃膜素着水后膨胀成为粘液胃膜素着水后膨胀成为粘液，遇酸即沉淀遇酸即沉淀，遇热不遇热不凝固凝固，胃膜素水溶液能被被60以上乙醇或丙酮以上乙醇或丙酮沉淀。胃膜素与酸较长时间较长时间作用，能分解分解成各种蛋白质和多糖组分。胃膜素的