防己黄芪汤防治肾间质纤维化的实验研究

1、防己黄茜汤防治肾间质纤维化的实验研究I肾间质纤维化摘要：要:目的:了解防己黄黄汤对胃间质纤维化的作用,以及去除甘草后对其作用的账电,防己黄黄汤来源于金匮要络.具益气除湿之功效，延自疗“风水”、”皮水“、甯风”的代衷方剂，其主的汉防己、黄茜已被发现稗抗肾纤维化作用1-2,但甘草有“助漫”、“中漉忌甘”雌,研究发现可加垂关木通'损害3,本课题采用单碘尿管结K(UUO)致肾间质纤维化大圾模型,观察防己黄黄汤对胃问鹿纤维化的影幽,以及去除甘草后对其作用的影幽,屈隧林，方勤.陈高翔,等.汉防己甲素、川苗涯和苦杏仁芭对人肾成纤维细胞的影幽J1,中华肾版病杂志,2000.16(3):186188.2

2、陈清江,杨丽,瑛,等,黄茜对人骨间质成纤维细胞增殖和转化生长因子061表达的影辆J,郑州大学学报(医字版)z2005f40(5):872-873.3朱少珞,刘招球,刘久波,等,木通与甘草合用对肾防损伤的实脍研究J.勋阳医学院学报,2002,21(5):270-272.4韩洪.防己黄黄汤加减治疗慢性尿酸性肾病32例观察Jd0中医,2004,23(3):155-157,5BlasiER,RochaR,RudolphAEfetal.AldosteronelsaltinducesrenalinflammationandfibrosisinhypertensiveratsJ.KidneyIntf2003

3、t63:1791-1800.6FeriaZPichardoI,JuarezPfetal.TherapeuticbenefitofspironolactoneinexperimentalchoniccyclosporineAnephrotoxicitJ.KidneyIntf2003f63:43-52.7肖培根.新筑中药志(第一卷)，M.北京:化学工业出版社t2002:259-279.注:“本文中所涉及到的图表、注解.公式等内容请以PDF格式阅读原文摘要：目的：了解防己黄苣汤对肾间质纤维化的作用，以及去除甘草后对其作用的影响。方法：采用大鼠单侧输尿管结扎(UUO)模型，用防己黄茜汤以及防己黄葭去甘

4、草汤干预，观察肾功能水平、肾病理以及肾a-平滑肌蛋白(a-SMA)和纤维连接蛋白(FN)蛋白和基因表达。结果：防己黄茜汤可降低UUO大鼠血尿素氮，使血白蛋白升高；减轻肾小管间质纤维化程度；同时，显著降低肾小管和肾间质a-SMA、FN的蛋白和基因表达。去甘草汤组与防己黄葭汤一样,改善了肾间质纤维化的多项指标，而且从数据来看，有进一步下降血尿素氮、以及FN表达的趋势。结论：防己黄茜汤具有抑制肾纤维化、改善肾功能的作用。组方去除日草后没有影响这一作用，甚至有可能更好。关键词：肾间质纤维化；平滑肌肌动蛋白；纤维连接蛋白；防己黄茜汤中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(20

5、08)05-1000-03ExperimentalStudyofFangjiHuangqiTangtoRenalInterstitialFibrosisYUDongrongLYANGRuchunOLWANGJun01fLIJian0qiu02,WANGYong0junl(l.GuangxiangHospitalAffiliatedZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310007,Zhejiang,China;2.ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,Zhejiang,China)Abstra

6、ct:Objective:FangjiHuangqiTangisChinesetraditionalmedicine,usedinrenaldiseasesforthousandsyears.Ithasnotstudiedwhetheritinfluencerenalinterstitialfibrosis.ItincludeFangji,Huangqi,Baishu,Gancao,FangjiandHuangqtwhichcanimproverenalinterstitialfibrosis,whileGancaoisnotreasonableinrenaldisease,becauseof

7、increaseingedemaanddecliningrenaldamagewhichcausedbyGuanmutong.ItneedstobeprovedifFangjiHuangqiTangcanpreventtherenalinterstitialfibrosisrandthemedicineofFangjiHuangqiTangwithoutGancaohasthesameeffect.Methods:RatsweregivenUUOtomakethemodelofrenalinterstitionfibrosis.TheratsweretreatedbyFangjiHuangqi

8、TangzandthemedicineofFangjiHuangqiTangwithoutGancao.Monoprilwereregrdedascontrol.14dayslater,thekidneysamplesofUUOwerestainedinHEandMasson.TheexpressionofproteinandmRNAofa-smoothmuscleactin(a-SMA)andFibronectin(Fn)wereexaminedbyimmunohistochemicalstainandbyRT-PCR.Results:FangjiHuangqiTangcanreducepl

9、asmaureanitrogenandincreaseplasmaalbuminoftheratsofUUOsignificantly.meanwhileinimprovetheinjuryoftherenalinterstitionsignificantly.Theexpressionofbotha-SMAandFndecreasesignificantlytreatedbyFangjiHuangqiTang.FangjiHuangqiTangwithoutGalcaocanalsoreducetheinjuryoftherenalinterstitionandexpressionofpro

10、tainandmRNAofa-SMAandFn,moreoveritseemsthatitcouldhavebettereffectinrenalinterstitionfibrosis.Conclusion:FangjiHuangqiTangcanpreventtherenalinterstitialfibrosis.FangjiHuangqiTangwithoutGancaohasthesameeffect#maybeitimproverenalinterstitiovfibrosissignificantlycomparedwithFangjiHuangqiTang.Keywords:r

11、enalinterstitialfibrosis;a-smoothmuscleactin;Fibronectin;FangjiHuangqiTang中药在肾间质纤维化方面作用以往研究多集中在单味中药及其有效成分，或自拟方的研究，缺乏对广泛使用于肾病临床经典方的研究。防己黄苗汤来源于金康要略，具益气除湿之功效，是治疗"风水"、"皮水"、"肾风"的代表方剂，具主药汉防己、黄黄已被发现有抗肾纤维化作用1-2,但甘草有"助湿"、"中满忌日"特性，研究发现可加重关木通肾损害3,本课题采用单侧输尿管结扎(U

12、UO)致肾间质纤维化大鼠模型，观察防己黄茜汤对肾间质纤维化的影响，以及去除甘草后对其作用的影响。为临床肾间质纤维化的防治提供新的思路和理论依据。1材料与方法1.1实验动物清洁级SD大鼠(浙江中医药大学动物房提供)56只，雄性，体重(200±3)g01.2药物与试剂中药汉防己、黄葭、白术、甘草购自浙江中医药大学中药饮片厂；蒙诺片由中美施贵宝制药有限公司出品。免疫组化试剂：小鼠抗人a-平滑肌肌动蛋白(alpha-smoothactin,a-SMA)单克隆抗体，抗鼠纤维连接蛋白(Fn)单克隆抗体，均购自武汉博士德生物技术公司。RNA提取试剂及RT-PCR试剂、Trizol试剂盒购自上海生物

13、工程有限公司。本文为全文原貌未安装PDF浏览器用户请先下载安装原版全文L3实验模型制作参照文献报道方法，将大鼠固定于手术台上，左侧腹部切开，分离左侧输尿管，丝线结扎两处，并在两处结扎点间剪断输尿管，制作UUO模型。假手术组仅开腹并游离左侧输尿管，但不结才口剪断。1.4实验分组大鼠随机分5组，每组8只，将假手术组作为正常对照，单侧输尿管结扎大鼠随机分为模型组、防己黄黄汤组、防己黄苣去甘草汤组(简称去甘草汤组八蒙诺对照组。1.5给药方法按方剂学中记录剂量按大鼠体表面积计算给药，即每天剂量为汉防己0.228g、黄茜0.285g、白术0.171g、甘草0.114g,去日草汤组是在上述要出上去日草，对照

14、组给予蒙诺0.19mg(成人剂量10mg/天按大鼠体表面积计算)。煎成2mL汤药或溶解成2mL灌胃，假手术组和模型组以等量生理盐水灌胃。术前1天开始给药。1.6标本采集术后14天将各组大鼠处死，股动脉取血，离心分离血清，用作生化检测；取术侧肾组织一半置于10%福尔马林固定液中，作病理切片和免疫组化实验，另一半置于液氮中冷冻保存，以备作RT-PCR检测。观察将10%福尔马林固定的肾组织常规石蜡包埋切片，经HE、Masson染色后，采用北京航天大学医学图像采集及分析系统，光镜下观察并采集MASSON染色肾脏病理图像，蓝色为纤维化阳性染色区。每张切片随机采集5个不重叠视野，分别测量每个视野中肾小管间

15、质纤维化阳性染色的相对面积，取平均值。1-8免疫组化采用SABC法，2%牛血清白蛋白代替一抗作为阳性对照。光镜下采集免疫组化图像，棕黄色为阳性染色每张切片随机采集5个不重叠视野，分别测量每个视野中肾间质阳性染色总面积，取平均值。1.9RT-PCR检测Trizol法提取总RNA,两步法进行逆转录和聚合酶链扩增反应(RT-PCR)F-action作为内参照，引物序列见表1。PCR反应条件为：955min/9530s,506030sr7230s，共35循环r7210mino扩增产物经1.7%琼脂糖凝胶电泳后，BIO-RAD紫外凝胶成像系统成像，用quanityone软件对特异性条带进行半定量分析，结

16、果以目的条带与内参照p-action条带的积分光密度之比值表示。1 . 10统计各缜用平均数土标准差(土s)表示，应用spssll.0软件对数据进行统计分析，2结果多组间邮交方差齐者采用one-wayANOVA法，组间两两匕喈交用LSD法。2-1血尿素氨肌酊白蛋白检测模型组大鼠血尿素氮较假手术组显著升高,药物干预后，防己黄黄汤组、去甘草组血尿素氮水平显著降低，其中去日草组下降更明显(PwO.01),与蒙诺组比较亦有显著差异(P&0.05)。各组血肌酊匕瞰无显著性差异。模型组大鼠血浆白蛋白下降，药物干预后，防己黄蔑汤组及去甘草组血浆白蛋白上升(P40050.01),蒙诺组无明显变化。见表

17、2。表2各组大鼠血肌酊血尿素氮及血浆白蛋白韵检测(土s)2.2肾组织病理形态学模型组大鼠肾小管明显扩张，上皮细胞肿胀、空泡变性，较多坏死、脱落，甚至小管结构消失，灶性小管萎缩，肾间质区域增宽，水肿，出现灶性纤维化，炎细胞呈片状-多灶性浸润。与模型组比较，防己黄茜汤组、去甘草组、蒙诺对照组明显减轻肾小管间质纤维化。见图loA:假手术组；B:模型组；C:防己黄茜汤组；D:去甘草组；E:蒙诺对照组图1各组大鼠肾组织Masson染色（100倍）2.3各组大鼠肾小管间质中a-SMAFN的表达假手术组大鼠肾组织有极少量的a-SMA.Fn表达，而模型组大鼠肾小管细胞及间质出现大量阳性表达。药物干预后肾小管及

18、间质a-SMA、FN表达明显下降。见图23。A:假手术组;B:模型组;C:防己黄茜汤组；D:去甘草组；E:蒙诺对照组图2各组大鼠肾组织a-SMA免疫组化梁色（100倍）A:假手术组；B:模型组；C:防己黄茜汤组；D:去甘草组；E:蒙诺对照组图3各组大鼠肾组织Fn免疫组化梁色（100倍）2.4各组肾组织a-SMAmRNAFnmRNA表达a-SMAmRNAFnmRNA在造模后大鼠肾组织表达显著上调，与模型组比较，治疗组和蒙诺对照组表达显著降氐，见图40注：与假手术组比较，P<0.05,AP<0.01,与模型组相比，P<0.01;与防己黄苣汤组比较，P<0.05e图4各组大鼠

19、a-SMAFnp-actionmRNA的表达（n=4，士s）3讨论防己黄良汤是治疗肾病的著名经方之一,出自汉代名医张仲景著的金匮要略，在该书“痉湿喝病脉证并治专科第二"记载"风湿，脉浮、身重，汗出恶风者，防己黄茜汤主之。”又在"水气病脉证并治第十三"记述："风水、脉浮、身重、汗出恶风者，防己黄苣汤主之。腹痛加芍药。"千百年来在医疗实践中获得疗效。近来研究发现防己黄苗汤还可改善慢性肾衰患者肾功能水平4,但在抗肾纤维化方面缺乏研究报道。实验采用经典的单侧输尿管结扎（UUO）致肾间质纤维化模型，结果显示，防己黄苣汤可显著降低UUO大鼠血尿素

20、氮，使血白蛋白升高；肾小管间质纤维化程度亦较模型组显著减轻；同时，防己黄葭汤可使UUO大鼠肾小管和肾间质成纤维细胞标志蛋白a-SMA、细胞外基质的重要组成Fn的蛋白和基因表达显著降低，提示防己黄葭汤通过抑制a-SMA表达和Fn的产生，减轻肾间质纤维化。去甘草汤组与原方一样，改善了肾间质纤维化的多项指标，显著下降血尿素氮水平，提示防己黄苣去日草汤可能有更优越的肾保护作用。现代药理研究发现甘草可与盐皮质激素受体结合发生醛固酮作用，出现水钠储留、低钾等症,而醛固酮是纤维化的重要致病因素之一,其受体拮抗剂则具有预防和减轻纤维化作用5-6。因此,这可能是去甘草组进一步改善肾功能、乘肾间质纤维化的机理之一。近年来,屡有研究报道提示甘草有肾保护作用7,本实验与此不符。此与绝大多数研究是采用18-a甘草酸或以18-a甘草酸为主要成分的"甘草酸二胺有关，而甘草的主要成分却是18邛甘草酸。本实验没有进一步发现加甘草与去甘草组间的统计学差异，这可能与本组实验周期较短，没有高剂量之间的比较有关，有待深入研究。血管紧张素转换酶抑制剂具有一定的抗肾纤维化作用，本研究采用血管紧张素转换酶抑制剂苯那普利（蒙诺）作为阳性对照，结果显示防己黄茜汤作用与蒙诺作用相似，但防己黄茜汤能升高UUO大鼠