2免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计ppt课件

1、HRP标志单抗建立Elisa夹心法测定相应抗原含量 汇报人：闫斯楠 时间：13.7.6一、CEA引见大肠癌组织可产生一种糖蛋白，作为抗原引起患者的免疫反响。此种抗原称为癌胚抗原carcino-embryonic antigen CEA，可广泛存在于内胚叶来源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。 癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判别、病情开展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。二、方案设计常规夹心法CEA抗体1-抗原-CEA抗体2-二抗HRP标志本实验夹心法CEA抗体1-抗原-CEA抗体2HR

2、P标志该方案是直接法与夹心法的有效结合，兼具两者的优点。为目前市面上Elisa检测试剂盒的通用发法。三、主要技术方法双抗夹心法ElisaHRP标志CEA单抗2SephadexG-25层析法1. ElisaA.实验步骤：1.抗原预包被。用包被缓冲液将抗原稀释浓度由预实验确定，每孔参与200微升，37孵育1小时后，4放置16-18小时。2.洗涤。倒尽板孔中液体，加满洗涤缓冲液，静止3分钟后倒掉。反复3次，最后一次尽量拍干板孔中剩余液体。3.加封锁缓冲液每孔200微升，37放置1小时。4.同2步洗涤。5.加被测血清100微升做梯度稀释，并作阳性、阴性及空白对照。37放置1小时或者4过夜。6.同2步洗

3、涤。7.加二抗。50微升每孔参与适宜浓度的二抗，37摄氏度放置1小时。8.同2步一样洗涤，并多反复一次，最后一次反复后一定要排干一切水分，否那么会有假阳性出现。9.显色。每孔参与底物溶液100微升，室温暗处放置10-15分钟，然后用终止液终止显色。10.酶标仪读数。B.需求配制的试剂1.包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸缓冲液，4保管 Na2CO3 0.15g NaHCO3 0.293g 稀释至100ml2.洗涤缓冲液：0.01M pH7.4 PBS-Tween-20，室温保管 NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO412H2O 2.9g 或者Na2HPO4 1.15g

4、Tween-20 0.5ml(用前暂时参与) 稀释至1000ml3.封锁缓冲液：在洗涤缓冲液中参与5%脱脂奶粉或者10%BSA或者0.5%鸡卵清蛋 白。用时现配4.稀释缓冲液：在洗涤缓冲液中参与0.1%BSA。用时现配5.显色终止液：2M H2SO4，室温保管 蒸馏水178.3ml，逐滴参与浓硫酸21.7ml，并边参与边混匀。6.底物缓冲液：pH5.0磷酸棗柠檬酸，4保管 Na2HPO4 7.298g 柠檬酸 4.669g 加水至1000ml7.底物溶液： TMBS底物运用液用时现配，450nm显色 TMBS1mg/ml无水乙醇 1.0ml 底物缓冲液 10ml 1%H2O2 25微升 2.

5、HRP标志CEA单抗2戊二醛二步法和过碘酸钠法.戊二醛二步法A.原理：戊二醛为一种双功能试剂，经过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共 价结合，构成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。B.标志步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反响后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml1分钟，搜集棕色流出液。如体积大于5ml，那么以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。(3)将待标志的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴参与酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。(5)加0

6、.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。(6)在搅拌下逐滴参与等体积饱和硫酸铵，置41小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保管。C. 需求配制的试剂：(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。(2)1

7、.25戊二醛液：取25戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。 (8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体购买。(9)HRP(RZ3.0)购买。D.优缺陷本法标志步骤比较简单，反复性好。缺陷是酶的利用率低，普通只需24的酶与蛋白质结合。.过碘酸钠法A.原理：HRP经NaIO氧化后构

8、成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，构成斯夫氏碱，后者可进一步用NaBH(或乙醇胺)复原生成稳定的酶标志抗体。B.标志步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中参与0.2ml新配的0.1M NaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.09.5，然后立刻参与10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光悄然搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mgml NaBH液，混匀，再置42小时。(

9、6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。(6)在搅拌下逐滴参与等体积饱和硫酸铵，置41小时。(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保管。C.需求配制的试剂(1)0.1M NaIO：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂)溶于蒸馏水10ml中。(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.3

10、61克50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml50ml) 6.3ml加蒸馏水至2,000ml。(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:NaCO 0.32克NaHCO 0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH溶液(4mgml):临用时称取NaBH4mg溶于1ml蒸馏水中。(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标志法。D.优缺陷本法所获酶标志抗体的产率高，将近70的HRP和Ig结合，99的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无艰苦损失，是目前最常用的方法。3. SephadexG-25层析A.分别原理：当混合样液加到凝胶柱上

11、，随着洗脱剂而经过凝胶柱时，分子大小不同的物质遭到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，遭到的阻滞作用小，挪动速度快，先出层析柱此景象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限；而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层分散，阻滞作用大，流程长，挪动速度慢，因以后出层析柱。在层析柱的出口处，我们用多个试管分步搜集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分别。当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需求进展蛋白质的脱盐任务，我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶G-25

12、，用适当的洗脱剂进展洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分别。B.试剂的配制1.葡聚糖凝胶-25溶胀凝胶方法：按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶，反复34次。操作中防止猛烈搅拌，防止破坏其交联构造。2.BaCl2溶液1%3.考马斯亮蓝G-250称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再参与85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。4.脲6mol/L5.洗脱剂 常规PBSC.操作步骤1.层析柱的预备(1)清洗：每组取一支层析柱，用

13、清水冲洗干净。假设玻璃柱较脏，应卸去塑料安装，先入洗液中浸泡2小时。(2)安装与检查：检查出口安装中尼龙绸或烧结滤板能否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，翻开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管能否通畅等情况。(3)排气泡：坚持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否那么会影响分别结果，排气终了，保管柱内12cm高水位，关紧螺旋夹。(4)标志高度：在距顶端810cm处做一标志，作为衡量灌装层析介质床体高度1517cm的根据。2.装柱每组用50mL烧杯

14、取溶胀的凝胶悬浆2530mL，静置片刻，察看凝胶沉淀与水的体积之比，约为1:1即可，否那么应作调整。悄然搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，翻开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标志上方约2cm为止，凝胶柱内假设有气泡和断层或柱床外表干水和歪斜，都将影响分别效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。3.平衡取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着渐渐流下，不可激动胶平面，翻开出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡终了，胶床上方保管约4cm高水位，封锁出水口。此时，胶床高度15cm为宜。4.预备搜集取6只干净的刻度试管除净试管内残留的水，16编号，并在试管2m

15、L处作一标志，插入试管架上，为搜集洗脱样品作好预备。5.上样与搜集翻开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，封锁出口，用滴管将0.2mL混合样液沿柱内壁渐渐参与，勿激动胶面。上样终了，翻开出水口，开场搜集一号管。每管搜集洗脱液2mL。当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着参与1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再渐渐注入35cm高的洗脱剂。6.洗脱不断向柱内加洗脱剂，坚持胶床上水位35cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至搜集到6号管达2mL时，封锁出口。7.鉴定另取6只干净试管，按搜集顺序将洗脱液一分为二，即每管1mL，依次在试管架上排成

16、二排。第一排每管加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判别SO42-在各管中的浓度。第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，根据蓝色情况，判别蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。假设鉴定的第6号管中，仍有样品，阐明洗脱和搜集不够，需添加7号、8号试管继续洗脱与搜集，同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。管号项目1234567891011白色沉淀量蓝色深浅8.再生鉴定终了，翻开出水口，继续用倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后封锁出口，以备下次运用。四、实验所需购买资料、试剂材料、试剂订购公司价格预计使用量赖氨酸金泰公司（长春）124元/100g100gHRP（辣根过氧化物酶）金泰公司（长春）250元/

17、100mg20mgCEA抗原（L1C00207）上海领潮科技有限公司待询（1mg/mL）1mgCEA IgG1（单抗货号L1C00205）上海领潮科技有限公司待询1mgCEA IgG1（多抗货号L1C00202）上海领潮科技有限公司待询5mgNaIO金泰公司（长春）80元/100g500mgNaBH金泰公司（长春）90元/100g500mgSephadex G-25层析柱(2cm50cm/1cm25cm)杭州三特医药化工有限公司450元-650元/个1个Sephadex G-25郑州勤实科技有限公司300元/25g5g13.7.21日过碘酸钠法标志HRP于鼠单抗标志终了，结果如下：利用BioT

18、ec多功能微孔板检测仪检测标志物的OD280nm及OD403nmOD280nm=0.674OD403nm=0.438IgG量mg/ml=OD280nm-OD403nm*0.3*0.62=0.336412酶量mg/ml=OD403nm*0.4=0.1752克分子比值E/P=酶量*4/IgG量=2.08315 即2.08315个HRP分子结合在一个抗体分子上。酶结合率=酶量*体积/抗体=52.08% 标志率0.6经过多次ELISA验证HRP标志胜利的单抗的可用性0.2780.2321.7691.9381.4681.4891.0041.1110.4010.3361：500稀释包被抗原0.2680.2

19、211.6691.8381.3681.3320.9860.9420.3010.3361：2000稀释包被抗原0.2790.2431.65517711.2641.4750.7650.8050.2890.2951：4000稀释包被抗原阴性对照原浓度单抗1:50稀释单抗1:100稀释单抗1:200稀释单抗HRP标志单抗效价测定间接法：抗原包被+HRP标志的鼠单抗+TMB及终止液显色由以上数据可看出，HRP标志的单抗效价为最高1:100，但由于ELISA阳性值在1以上同时不能过大为最正确选择，故后续实验应选择1:50稀释酶标单抗，这个效价为HRP标志前的单抗效价的50%，即本方法标志单抗导致单抗效价降

20、低50%。运用HRP酶标单抗构建测定抗原羊肚菌菌丝含量的规范曲线抗原捕获量测定双抗夹心法：兔多抗包被+梯度浓度抗原+HPR标志鼠单抗+TMB及终止液显色抗原浓度（ng/ml)025.0450.0875.12100.16125.20150.24175.28200.32平行对照(OD450nm)0.2160.4320.6890.8761.0021.1891.3511.5061.5240.2310.4250.7010.8431.0241.2041.3871.5231.517平均值0.2240.4290.6950.8601.0131.1971.3691.5151.521免疫磁珠在ELISA中的运用及方

21、案设计 汇报人 闫斯楠 日期 2021.9.1目录1.免疫磁珠技术简介2.免疫磁珠技术的运用及优缺陷3.免疫磁珠与ELISA联用的方案设计1.免疫磁珠技术简介1.1 免疫磁珠的构造 免疫磁珠IMB，也称免疫磁性微球，是一种均匀、具有超顺磁性及维护性壳的球形小粒子，根本上有载体微球和免疫配基结合而成。其中心为顺磁性粒子，中心外层包裹一层高分子料，最外层是免疫配基。免疫磁性微球构造免疫磁珠载体微球载体微球磁性物质高分子层功能基金属小颗粒Fe2O3、Fe3O4如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、酶类、多糖淀粉、纤维素、葡聚糖、果胶等、球蛋白和牛血洁白蛋白等如氨基、羧基、羟基，使其表现具有

22、疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同的物理性质免疫配基免疫配基经过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上构成免疫磁珠。由于载体微球制备资料和方法不同，其表现出的物理性质也不同，从而可结合不同的免疫配基，如抗原、抗体、凝集素、DNA和RNA等。配基必需具有生物专注性的特点，而且载体微球与配基结合要不影响或改动配基原有的生物学特性，保证磁珠的特殊识别功能。1.2 免疫磁珠的性质由于免疫磁珠的大小和外形具有均一性，从而可使靶物质迅速和有效地结合到磁珠上，也可使生成的新复合物在磁场中具有一样的磁呼应性，且行为一致磁珠的球形构造可消除与不规那么外形粒子有关的特异性结合顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向挪动，从磁场移出时磁性消除，磁珠分散，由此可方便地进展分别和磁性导向维护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀免疫配基可特异性地结合反响体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质1.3 免疫磁珠技术免疫磁珠IMB技术：是一种以特异的抗原抗体反响为根底的免疫学检测和分别技术。它是以抗体包被的磁珠为载体，经过抗体与反响介质中特异性抗原结合，构成抗原-抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向挪动，从而到达分