大肠杆菌K88相关产品的研制ppt课件

1、.大肠杆菌口服疫苗的研制 汇报人:范群平生物制品实验室.What is vaccine？ 广义的疫苗是 为了预防、控制传染病的发生和流行而接种于机体的预防性生物制品。 生物制品，是指用微生物或其毒素，人或动物的血清、细胞等制备的用来预防、诊断和治疗用的制剂 。预防用的抗体制剂也可以归类为疫苗.What is oral vaccine？口服疫苗，顾名思义，就是经“口途径接种的疫苗，进一步来说是经过消化道途径进展接种的疫苗。.Why choose the oral vaccine？首先，口服疫苗防止了注射疫苗呵斥的惊吓应激，有效维护了动物福利。其次，口服疫苗降低了养殖本钱，例如人力本钱、抗应激产品

2、的本钱。最后，对于许多经肠道和黏膜外表感染的致病微生物有较好的防御才干 。口服疫苗具有宏大的市场前景！.Why do we choose the E.Coli ? 之所以选择大肠杆菌作为研讨对象，就是由于仔猪大肠杆菌病是猪的常见传染病之一，发病率、死亡率高达50%100%，直接给猪场呵斥宏大的经济损失。 治疗不及时，即使恢复也变成僵猪，影响仔猪的生长发育，呵斥饲料的浪费，间接影响猪场的经济效益。.Why is the K88 ?1、大肠杆菌的致病性取决于它在小肠的粘附、定植、增殖以及产生毒素的才干，粘附因子或纤毛决议细菌定植的才干，一旦发生细菌定植，就会快速增值并产生毒素从而导致腹泻的发生。2

3、、经过流行病学调查，我们发现导致仔猪大肠杆菌病的的最主要的粘附因子就是 3、K88几乎100%由蛋白质组成，具有较强的免疫原性。K88.How to prevent and treat the E.Coli disease?最好的方法就是运用为此，根据仔猪免疫系统的发育情况，我们设计了两种抗体运用方案：一、早期直接抗体运用方案鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌K88卵黄抗体的研制二、后期间接抗体运用方案携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的开发及运用抗体.一、鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌K88卵黄抗体的研制.Why do we choose yolk antibodyIgY ?1、抗体程度

4、高 卵黄抗体所含有的抗体滴度大于血清中的抗体滴度，作为饲料添加剂具有更高的免疫维护效率。2、稳定性高 卵黄抗体具有很高的热稳定性，便于机械消费、加工。3、平安性高 卵黄抗体可以用来防治相应的病原体引起的感染并且无药物残留、不产生耐药性。4、用途广泛 纯化的卵黄抗体可以用来诊断疾病并且具有经济省时省力的特点。.Research mathods1、产肠毒素大肠杆菌K88菌株的分别鉴定以及扩展培育培育基+诱导剂 37、220rpm24小时震荡培育.名称猪大肠杆菌猪沙门氏菌培养基猪大肠杆菌培养基疫苗生产用猪沙门氏菌培养基疫苗生产用细菌计数2.5109cfu/ml1109cfu/ml表1：细菌计数结果2

5、、经过SDS实验证明K88粘附素蛋白表达了以后，进展细菌计数，以保证有较高的细菌数来用于疫苗制备。.3、疫苗的制备 1、 菌株的灭活 在菌液浓度为1109cfu/mL的细菌悬液中参与终浓度为3的甲醛溶液，37恒温振荡作用48h。 2、灭活效果鉴定灭活苗12灭活前细菌计数109 cfu/mL109 cfu/mL灭活后细菌计数00.3、疫苗的乳化 将配制好并高压灭菌的油相佐剂与灭活的菌液按照1:1的比例混合，并用匀浆仪乳化，乳化期间不定时抽样检测疫苗的乳化效果乳化好的灭活疫苗呈乳白色牛奶状，滴入清水中时不溶解，不分散，不沉淀。.4、预接种实验 为了检验动物实验设计的科学性和可行性，防止设计不周呵斥

6、浪费，我们设计了预实验 。预实验证明以6 109 cfu的量免疫效果最好，免疫鸡群一开场出现应激反响，采食量下降、精神抑郁，趴卧不起。接种一周后鸡群恢复正常，没有出现实验鸡只死亡。. 免疫170日龄待开产鸡，鸡群分为2组，每组100只，一组 为对照组，一组为实验组。1、首免每羽注射1.0 mL。2、两周左右进展二免，方法同初免，每羽注射1.5ml。3、周围后进展三免，方法同初免，每羽注射2.0ml。4、每周搜集卵黄液，采用试管直接凝集法进展卵黄 液中卵黄抗体效价的测定。5、免疫待开产鸡群，诱导免疫应对，产生高抗体程度的鸡蛋.样品编号12345678910111213抗体效价（log2）3666

7、.57.58989111010106、免疫鸡群的抗体效价变化表3：免疫鸡群大肠杆菌k88抗体效价.免疫鸡群的抗体效价变化以上结果阐明：免疫蛋鸡在免疫后卵黄中的特异性抗体开场明显升高，10周到达顶峰，并继续到13周。. 搜集免疫鸡1013周产的鸡蛋，进展喷干工艺的探求，最后确定喷干时进口温度设定为160，出口温度设定为90，对卵黄抗体滴度无影响，并且易于操作。7、卵黄抗体的喷雾枯燥.指标色泽粒度粗蛋白消化率卵黄抗体粉初产品淡黄色80目12.6%97.6%8、卵黄抗体粉目的测定保管条件：常温下放置半年，卵黄抗体活性无影响。卵黄抗体喷干粉在消费上具有良好的加工和储存性能！表4：卵黄抗体目的.9、小鼠

8、造模饲喂实验5周龄小鼠豢养察看一周后无异常，直肠试纸检测ETEC阴性，感染前,停顿喂食12h，腹腔注射0.2ml菌液，2h后正常喂食。对照组处置的不同之处是把菌液改为生理盐水。感染后对动物的察看:每隔3h察看1次，延续察看24小时并记录。 表5：各实验组小鼠死亡情况.10、k88卵黄抗体的断奶仔猪饲喂实验从表6可见，3个组日增重最好的为实验组达169.72g，最差的为对照组131.94g，料重比最好的为实验组1.48，最差的为对照组达1.92，实验组介于两者之间。腹泻头次以实验组为最小。.对照组的腹泻率最高为16.49%显著高于2个实验组，这阐明合用IgY对有效降低仔猪断奶后腹泻的发生，且在合

9、理范围内随着剂量的添加其腹泻效果越好。但是综合料重比，腹泻呵斥的死亡率等数据来看，根底日粮+1%的k88卵黄抗体粉可以收到最正确的效果.思索到实践消费中，导致仔猪腹泻的情况较为复杂，不只是大肠杆菌K88粘附素，因此我们有做了进一步的任务调整，将携带K88、K99、987P、F41、F18菌毛抗原的几种大肠杆菌还有伤寒沙门氏菌结合在一同制成了大肠杆菌沙门氏菌二联5价卵黄抗体。.二、携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的开发及运用.实验一、重组乳酸菌的PCR鉴定及表达产物的 SDS和West-blot分析.重组菌活化、增菌及质粒的提取鉴定PCR鉴定重组菌的诱导表达Wester

10、n-blotSDS免疫动物多克隆抗体的制备产毒素大肠杆菌疫苗的制备确定为携带诱导肽和抗原基因的重组乳酸菌技术道路.1、重组乳酸菌的分子鉴定PCR鉴定图1:重组乳酸菌核酸PCR分子鉴定M:DL2000；1、4、7:为重组乳酸菌核酸PCR扩增结果.重组菌活化、增菌及质粒的提取鉴定PCR鉴定重组菌的诱导表达Western-blotSDS免疫动物多克隆抗体的制备产毒素大肠杆菌疫苗的制备确定为携带诱导肽和抗原基因的重组乳酸菌.2 大肠杆菌和乳酸菌发酵产物免疫印迹West-bloting结果 1 M 2 3 4M:低分子量蛋白marker;1:大肠杆菌(K88)发酵液；2、4 :乳酸菌发酵上清液3 :乳酸

11、菌菌体沉淀样品18KD28KD45KD60KD100KD图4:大肠杆菌和乳酸菌发酵产物免疫印迹结果.实验二、乳酸工程菌诱变选育及工业化消费条件的探求.重组菌的紫外诱变选育耐酸耐胆盐遗传稳定性检测培育基工业化配方的优化发酵条件的优化中试最正确培育基温度、转速等确定工业化消费最正确发酵条件遗传稳定性检测技术道路.1 重组乳酸菌的诱变选育1.1 紫外诱变结果稀释度对照诱变时间菌落个数致死率10-7300120s6877.4%150s4884%180s2093%10-82790s774%120s966.7%150s966.7%10-90180s0结论：诱变结果阐明，诱变数据符合诱变胜利的前提条件，可以

12、对存活的菌落进展选育。.1.2、重组乳酸菌的选育以活菌下降对数值均小于2为规范，从17株乳杆菌中初步挑选出1株优良菌株，其耐酸和耐胆盐测定结果如表编号耐胆盐测定（log）耐酸(log)原液(log)耐胆盐对数差耐酸对数差147.727.6222247.827.6722347.777.7122447.787.782255.017.757.72265.117.597.6922747.617.8422847.577.612294.697.77.72221047.727.722114.487.697.68221247.887.89221347.987.98221447.97.7822156.147.5

13、87.5322165.267.687.6622174.887.797.7622.2 重组乳酸菌选育株对小鼠肠粘液的体外粘附实验名称活菌数（cfu/mL）原液活菌总数（cfu/mL）体外粘附率粘液11.63 1094.7 10964.2%粘液21.73 1094.7 10963.2%灌肠1.28 1094.7 10972.8%.3 选育株的遗传稳定性实验选育株传10代后，在红霉素培育基里的计数情况，阐明遗传稳定性较好。.重组菌的紫外诱变选育耐酸耐胆盐遗传稳定性检测培育基工业化配方的优化发酵条件的优化中试最正确培育基温度、转速等确定工业化消费最正确发酵条件遗传稳定性检测技术道路.运用消费常用的发酵

14、条件和培育基，没再单独进展优化实验，做好种子液后加到500L发酵罐中，发酵12h后，再转入5吨的发酵罐，每2h取一次样，进展乳酸菌计数和pH值的测定，并绘制生长曲线。.1 选育株的生长曲线测定.2 选育株的菌液PH值变化情况测定在5吨大罐中发酵时间以20小时为宜。.实验三、重组乳酸菌作为口服疫苗对小鼠免疫 目的的影响及免疫维护效果的研讨.小鼠实验进程一览9.10开场动物实验10.19处置第一批小鼠11.6处置第二批11.22处理第三批10.28-30号，延续三天灌胃，同时进展疫苗免疫9.24-26号，延续三天灌胃，同时进展疫苗免疫10.10-12号，延续三天灌胃，同时进展疫苗免疫11.14-1

15、6号，延续三天灌胃，同时进展疫苗免疫12.4攻毒实验12.17处置最后一批.1 小鼠脾脏指数mg/kg测定结果从结果可以看出，各实验组小鼠脾脏指数均高于对照组，且均差别显著P疫苗组LP组生理盐水组。组别乳酸菌大肠杆菌生理盐水组8.94.17LP组8.535.11疫苗组8.834工程菌组8.74.结果阐明：1、在非特异性免疫方面，运用重组乳酸菌对小鼠生长初期的脾脏指数和小鼠肠道内sIgA的分泌有继续的促进作用；2、在特异性免疫方面，重组乳酸菌的效果相比自制的大肠杆菌疫苗效果更加耐久，能长时间刺激机体产生高程度的大肠杆菌K88抗体。.实验四、重组乳酸菌选育株作为口服疫苗对断奶仔猪饲喂效果的研讨.4.1重组乳酸菌对断奶仔猪粪便中sIgA含量的影响 结果阐明，饲喂重组乳酸菌的断奶仔猪粪便中sIgA的含量显著多于对照组。阐明基因工程乳酸菌可以显著提高断奶仔猪的肠道粘膜免疫，加强动物机体的抵抗力。.4.2重