食源性致病菌血清学诊断技术ppt课件

1、食源性致病菌血清学检验技术福建省疾病预防控制中心马群飞内容一、血清学检验的概念二、血清学检验的类型三、国家规范运用的血清学检验技术四、血清学检验质量控制根本概念：血清血液凝固析出的淡黄色透明液体。血液放入试管中，不加抗凝剂，那么血液迅速凝固，构成胶冻。凝血块收缩，其周围析出血清，也可于凝血后经离心获得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反响中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以致消逝。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参与凝血反响的

2、物质那么与血浆根本一样。血清蛋白为防止抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。 血清学检验的概念利用抗原-抗体反响的显著特异性，进展细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛等抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。 血清学检验的概念体外抗原抗体反响中的抗体主要来源于血清，其检测多以血清为实验资料，故体外抗原抗体反响亦称为血清学反响serologic reaction或血清学实验、血清学检验。血清学检验的概念血清学检验指根据抗原与相应的抗体在适宜的条件下，能在体外发生特异性结合的原理，在体外用知抗体或抗原检测抗原或抗体。血

3、清学检验是微生物学检验的重要方法之一。也是细菌、病毒性疾病诊断和病原菌鉴定的重要手段之一。血清学反响的普通特点1抗原与抗体的结合具有高度特异性，但当两种不同抗原分子上有共同抗原决议簇存在时，那么与抗体结合时可出现交叉反响。2抗原与抗体结合是分子外表的结合。两者的结合相当稳定，但是可逆的，在一定条件下可发生解离，解离后的抗原、抗体性质不变。3抗原、抗体的结合按一定比例，只需在比例适当时才会出现可见反响。假设抗原、抗体比例不适宜，就会有未结合的抗原或抗体游离于上清液中，不能构成大块免疫复合物，故不能呈现可见反响。4血清学反响可分两个阶段进展，但其间无严厉界限。在第一阶段，抗原和抗体特异性结合，此阶

4、段反响很快，几秒钟或几分钟即可完成，但无可见反响；在第二阶段，反响进入可见阶段，反响进展的很慢，往往需几分钟甚至几非常钟以致数日方可完成。而且常受电介质、温度、pH等诸多外界要素的影响。 血清学检验的类型血清学实验可分为血清学鉴定和血清学诊断两部分。血清学实验既可定性，又可定量。 用知抗体即含特异抗体的免疫血清或单克隆抗体等检测标本中或分别培育物中未知细菌的种、型或细菌抗原，称为血清学鉴定；而用知细菌或特异性抗原检测患者血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，作为某些感染性疾病的辅助诊断，称为血清学诊断。血清学鉴定血清学鉴定常用的血清学实验是凝集实验直接凝集实验和间接凝集实验、沉淀实验、荚膜肿胀

5、实验和毒素-抗毒素中和实验等。凝集反响一、直接凝集反响二、间接凝集反响1、正向间接凝集反响2、反向间接凝集反响3、凝集抑制反响4、协同凝集反响颗粒性抗原凝集素直接凝集反响直接凝集反响指颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现的凝集景象。一玻片凝集实验一种常规的定性实验方法。原理是用知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。取知抗体诊断血清滴加在载玻片上，直接从培育基上刮取待检菌混匀于诊断血清中，数分钟后，如出现细菌凝集成块或肉眼可见的颗粒，即为阳性。方法简便、快速、特异性强，现行国标用于沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌等的鉴定，但不能进展定量测定。 一玻片凝集实验如将含有沙门氏菌抗体的血清与待

6、检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后假设出现肉眼可见的凝集块，即为阳性反响，证明该菌是沙门氏菌。一玻片凝集实验自临床初分别的细菌中，有些细菌外表含有某种外表抗原(如伤寒沙门氏菌的Vi抗原和志贺氏菌属的K抗原等)，这些抗原能阻止菌体抗原(O抗原)与相应抗体发生凝集反响，从而导致错误的断定。此时应将菌悬液于100中隔水煮沸(Vi抗原10030 min、K抗原1001 h)，待细菌外表抗原破坏后，再进展实验。一玻片凝集实验用于鉴定细菌的诊断血清有以下几类：1、多价诊断血清：即混合诊断血清，血清中含有两种以上细菌的相应抗体。普通用于细菌定属或群。2、单价诊断血清：仅含一种(或型)细菌的相应抗体。可用于

7、细菌的定种(或型)。3、因子诊断血清：仅含一种细菌的型特异性抗体的诊断血清称为因子血清。可用于细菌分型。 玻片凝集结果察看沙门氏菌的生物学性状目前根据对某一特定O抗原共同具有的规范，将沙门氏菌属分为AZ和O51 O67共42个O群，58种O抗原，63种H抗原。到1987年底为止，已有2213个血清型。我国已发现26个菌群、161个血清型。沙门氏菌的血清分型沙门氏菌主要有O和H两种抗原。少数菌具有外表抗原Vi。在这些菌群中，对人致病的沙门氏菌，通常为属于AF各O群的常见菌型。故用AF多价O血清对沙门氏菌进展的菌型鉴定，只是对于O抗原的第一步鉴定。假设待测菌型不属于A到F群，仍要继续运用其他沙门氏

8、菌因子血清中的多价O血清继续鉴定。而在确定了所属O群之后，还要进展H抗原的鉴定。必要时，还需进展Vi抗原的鉴定。 沙门氏菌血清实验致病性的沙门氏菌绝大多数血清归在A-F群内，所以检出疑似菌株应先凝集A-F群O多价血清，假设凝集可按常见O因子检出频率，按照O4O10O9O7O8O19O2O11顺序凝集，可节省时间。H抗原可先凝集H多价1H多价4，再逐个凝集某个H多价凝集所含的H单因子血清。伤寒和丙型副伤寒杆菌在A-F群多价血清不凝集情况下，还应做Vi血清凝集。沙门氏菌血清学实验结果察看二试管凝集法一种定量实验方法。多用知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进展流行病学

9、调查。如肥达氏反响就是诊断伤寒、副伤寒的试管凝集实验。由于要测定抗体的含量，故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后参与等量抗原，37或56，24 h察看，血清最高稀释度仍有明显凝集景象的，为该抗血清的凝集效价。 间接凝集反响是将可溶性抗原或抗体吸附于某种与免疫无关一定大小的颗粒载体外表，制成致敏载体，再与相应抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜条件下，被动地使致敏载体凝集，称为间接或被动凝集反响。根据载体不同，还可以分为乳胶凝集、血球凝集、炭凝集、SPA协同凝集等。间接血凝实验表示图：红细胞堆积于孔底；：红细胞堆积于孔底，周围有散在少量凝集；：红细胞构成层凝集，边缘较松散；：红细胞构

10、成片层凝集，面积略大；：红细胞构成片层凝集，均匀布满孔底，或边缘伸展如花边状凝集反响可溶性抗原载体颗粒正向间接凝集反响即将知可溶性抗原吸附于载体颗粒上，然后与相应抗体结合产生颗粒凝集景象，用以检测未知抗体。 抗体可溶性抗原载体颗粒反向间接凝集反响是将知抗体吸附于载体颗粒外表，以检测相应可溶性抗原的凝集反响。 空肠弯曲菌的间接血凝实验间接血凝实验IHA是将抗原或抗体包被于红细胞外表，成为致敏的载体，然后与相应的抗体或抗原结合，从而使红细胞聚集在一同，出现可见的凝集反响。 葡萄球菌肠毒素的乳胶凝集实验乳胶敏化抗体加盐水，再加等体积乳胶制剂，混匀孵育，然后加牛血洁白蛋白。待检菌液制备琼脂上挑取待检菌

11、落，制成菌悬液，离心沉淀细胞，上清液待检。正式实验 在玻片上加待检上清和致敏乳胶，混匀，悄然摇动3min，在斜射光下察看结果，断定规范同普通凝集实验。灵敏度高，且无假阳性结果。间接凝集抑制反响是将知抗体或可溶性抗原先与被测的抗原或抗体混合，然后参与有关抗原或抗体致敏的载体颗粒，如知抗体或可溶性抗原与被测的抗原或抗体相结合，那么不出现颗粒凝集景象。故也可称为正向间接凝集抑制实验或反向间接凝集抑制实验。 凝集凝集抑制待检样品待检样品间接凝集抑制反响协同凝集实验 运用载体是含SPA葡萄球菌A蛋白金黄色葡萄球菌。SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG类抗体的Fc段结合，IgG的Fc段与SPA结合后，I

12、gG的两个Fab段暴露于葡萄球菌菌体的外表，并仍坚持正常的抗体活性，当结合于葡萄球菌外表的知抗体与相应细菌、病毒或毒素抗原接触时，那么出现肉眼可见的凝集景象。方法简便、快速、敏感性高，易于察看结果，已广泛用于细菌的快速鉴定和分群型，如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌、布鲁氏菌、沙门氏菌及志贺氏菌等。 沉淀反响可溶性抗原如细菌的培育滤液、含细菌的患者血清、脑脊液及组织浸出液等与相应抗体相混合，在比例适宜和适量电解质的存在等条件下，构成肉眼可见的沉淀物，称沉淀反响。利用沉淀反响进展血清学实验的方法称为沉淀实验。沉淀反响有环状、絮状和琼脂分散法3种根本类型。抗血清抗原絮状沉淀反响

13、指可溶性抗原与抗体在试管内以适当比例混合后，在电解质存在的条件下，出现絮状的沉淀物。将知抗原与抗体在试管如凹玻片内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反响。 抗原抗体环状沉淀反响将知的抗血清加于细管中，然后沿管壁徐徐参与已适当稀释的待测抗原溶液，使成为分界明晰的二层，孵育530 min后，如在两液面交界处构成肉眼可见的白色环状沉淀物为阳性反响。琼脂分散实验 用琼脂制成半固体的凝胶，使抗原和抗体在凝胶中分散，假设两者比例适当，那么在相遇处构成肉眼可见的白色沉淀物线或环，为阳性反响。每对抗原抗体可构成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别构成几条沉淀线。由于方

14、法简便易行，常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。 (1)单向琼脂分散实验 (2)双向琼脂分散实验(3)对流免疫电泳 (4)免疫电泳 免疫分散技术免疫电泳技术单向分散实验双向分散实验火箭电泳对流电泳免疫电泳分散实验单向分散实验是一种定量实验双向分散实验多用于定性实验。单向分散实验将抗体预先在琼脂中混匀，制成凝胶板，凝固后在琼脂上打孔，孔中参与待试抗原，经一定时间分散后，假设抗原与抗体对应，那么在孔周围比例适当处构成白色沉淀环。 双向分散实验先制备琼脂凝胶板，待凝固后，根据需求在其上面多少个孔，孔间坚持一定间隔，然后将抗原和抗体分别注入小孔中，使两者相互分散。如抗原与抗体相对应，浓度比例适当，经一

15、定时间分散后，在抗原抗体孔之间出现明晰的白色沉淀线。一对相应的抗原抗体只能构成一条线。双向分散实验因此，根据沉淀线的数目即可推测抗原液中有多少种抗原成分，根据沉淀线交融与否及交叉关系，还可鉴定两种抗原能否完全一样，还是部分一样。本法可用于检测未知抗原或抗体、分析和鉴定抗原成分、检测抗体或抗原的纯度、滴定抗血清的效价等。缺点是需时长，敏感性差。 抗原分子量抗体分子量抗原分子量抗体分子量抗原分子量抗体分子量抗原、抗体相对含量测定抗原、抗体相对分子量分析抗原性质分析耐热，经100煮沸30 min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。食物中的肠毒素耐热性更强，普通烹调温度不能将其破坏。218248的油中需3

16、0 min才干被破坏。可引起急性胃肠炎。以猛烈呕吐为特征。葡萄球菌肠毒素根据肠毒素的血清型，可分A、B、CC1、C2、D、E 5 个型。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。其他依次为D、C、B和E型。也有AD、AB、AC、BC等。葡萄球菌肠毒素葡萄球菌肠毒素双向琼脂分散该方法也用在GB/T 4789.62003肠毒素检验。溶血反响与补体结合实验一、溶血反响溶血反响与补体结合实验二、补体结合实验是一种在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素为指示系统的抗原抗体反响。 血清学诊断血清学诊断是指用知抗原或知抗体检测患者血清中相应抗体的方法，以诊断感染性疾病。抗体效价必需明显高于正常人群的程度或随

17、病程递增才有诊断价值。多数血清学诊断需取患者急性期和恢复期双份血清标本，假设后者的抗体效价比前者升高4倍或4倍以上才有诊断意义。在患者血清中检出病原微生物的抗原有诊断意义。国家规范运用的血清学检验技术GB/T 4789.4-2021沙门氏菌检验GB/T 4789.5-2003志贺氏菌检验GB/T 4789.62003致泻大肠埃希氏菌检验GB/T 4789.72021副溶血性弧菌检验GB/T 4789.8-2021 食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB/T 4789.9-2021 食品卫生微生物学检验 空肠弯曲菌检验GB/T 4789.10-2021 食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB/T 4789.11-20