第八章DNA重组与转座ppt课件

1、DNA重组与转座概述第一节 同源重组第二节 位点专注性重组第三节 转座作用第四节 逆转录转座子概述： 只需有DNA，就会发生重组减数分裂高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体温暖噬菌体转座子转座 生存变异突变，重组 损伤修复、顺应环境、加速进化 广义遗传重组：任何呵斥基因型变化的基因交流过程 DNA重组 DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合。1同源重组2位点特异性重组3转座重组4异常重组 DNA重组可分为四类DNA序列、蛋白质因子 重组DNA技术 第一节 同源重组1、 同源重组homologous recombination: 发生在同源DNA序列之间一、特征2、 特征： 涉及同源序列

2、间的联会配对，且交换的片段较大 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程 异源双链区的生成 存在重组热点 需求重组酶 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号细线期合线期粗线期双线期终变期 e.g. Euk.减数分裂时 的染色单体之间 的交换 细菌的转化， 转 导，接合，噬菌体 重组双倍体染色体交换二 同源重组的分子模型1.Holliday于1964年提出Holliday模型1两个同源染色体DNA陈列整齐2两DNA分子同一部位两单链发生断裂引发重组3断裂的单链游离末端彼此交换构成Holliday中间体4经过分支迁移产生异源双链DNA分子。5中间体在内切酶和衔接酶作用下，

3、构成拼接重组体和片段重组体。SynapsedchromatidsRecombinationjointHeteroduplex DNA5512片段重组体拼接重组体Holliday中间体3553Meselson-Radding模型单链入侵模型链转移模型置换侵入Loop切除同化 异构化 分支迁移5切割双链断裂修复模型 2、 分枝迁移和Holliday中间体构造的拆分 分枝迁移branch migaration 双螺旋构成的交叉衔接以拉链式效应分散Holliday的异构化产生重组体的拆分Holliday构造一经生成即可不断地处于异构化异源双链 heteroduplex DNA重组结果取决于拆分时配对链

4、上的切口位置1212 Holliday构造的拆分产生含异源双链的片段重组体产生拼接重组体“亲本链-片段重组体“拼接重组体三、原核同源重组E.coli 发生在双方DNA的同源区域 部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间 细菌的转化、结合和转导 1、RecBCD酶和 Chi 位点 RecBCD酶具有ATP依赖的解旋酶活性、依赖于ATP的核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性. 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点 Chi位点含有GCTGGTGG序列,是基因recBCD编码RecBCD酶作用的靶位点3 RecBCD的识别和切割位点a、 R

5、ecBCD结合在DNA的平 头末端产活力制不清楚b、 外切、解链、挪动 ATPc、 兔耳状 loop 构造产生再旋酶活性低于解旋酶活性d、 RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3方46NT处切 断单链单链内切酶 chi位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点 E.coli 含 1000 个、Euk.e、 RecBCD 切割产生3单链末端 2、RecA 蛋白 1 活性a、 RecA 有单、双链 DNA 结合活性 b、 RecA 有 NTPase 活性底物差别活性 与单链 DNA 结合时活性最大-依赖于 DNAc、 RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的才干，即联会

6、同源 DNA 但其靶 DNA 必需有缺口结合DNARecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end. RecA启动的单链入侵RecA引起的链交换和Holliday构造的生成 2RecA 蛋白催化双链和单链 DNA 的反响阶段a、 联会前阶段缓慢 RecA 与单链结合b、 单链与双螺旋的互补链迅速配对，构成双链衔接分子 Holliday5侵入c、

7、从双螺旋构造中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA 反响终了时，RecA 结合到双链上 其中单链同化有固定的方向 入侵单链为53 双链 DNA 的互补链是35 RecBCD 和 RecA 的共同作用 3、原核同源重组的其它蛋白 需求 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的产物 a、 RuvA 识别 Holliday 构造的衔接点b、 RuvB 为分枝迁移提供动力ATPase 1020bp/s c、 RuvC 核酸内切酶-专注性识别 Holliday 构造的衔接点 体外切段衔接点以拆分重组体 E.coli 重组的各阶段 损伤修复损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第

8、二次链交换DNApol经过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday衔接点第二节 位点专注性重组一、位点专注性重组 site-specific recombination1、概念：发生在专注序列的DNA分子间的重组,有特异的 重组酶和辅助因子对其识别和作用。噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、位点特异性重组的结果依赖于重组位点的位置和方向二、phage的整合与切除1、实现机制：均是经过-细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组2、特定位点-附着位点attachment site att E.coli attB 含BOB序列 23bp phage attP 含

9、 POP序列 240bp 中心序列 “O区完全一致 同源部分15bp -位点特异性重组发生的地方3、整合过程 整合后的附着位点为 attLBOP attRPOB 整合位点-attB、attP 切除位点-attL、attR 整合过程需求整合酶 integrase Int编码 和寄主的整合宿主因子IHF integration host factor 共同作用溶源性细菌(lysogen)溶菌周期lysis原噬菌体4、整合分子机制 中心序列O全长15bp，富含A-T 发生在O内的重组交换位点相距 7bp 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同) attP位点的负超

10、螺旋为重组所必需-加强了Int和IHF的亲和力 -高剂量的蛋白维持单链重组所必需的构造 Int结合 -中心序列的反向位点切割位置 -结合在att臂上臂与中心区接近intIHFXis 整合体及其作用 整合体intasome- Int和IHF结合到attP时的复合物 整合体捕获attB 阐明- a、attB和attP的最初识别靠Int 识别两序列的才干 b、两序列的同源性在链交换时为 重要要素 Int蛋白能切断DNA，并使它重新衔接，近而使holliday构造拆分 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进展交叉杂交5、整合与切除的控制1 整合 C-促使阻遏蛋白C的产生 -与int ge

11、ne 的PI结合，转录产生Int蛋白 -且PI位于xis基因内，C与PI结合导致xis gene失活2 切除 寄主SOS反响时-RecA大量产生，促使阻遏蛋白C的水解 -把OL和OR从阻遏形状释放出来 -从PL转录使int和xis表达细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白H1和H2转换四、依赖于同源重组的位点特异性的序列代换 -酵母MAT序列的转换1、 酵母结合型的转变-DNA序列的代换，而不是互换 -依赖于序列的同源性 被代换的序列命运是被降解-突变实验2、 同源序列 匣子 W X Y Z1 Z2 total HML 723 704 747 239 88 2501 MAT 723 704

12、 747 239 88 2501 MATa 723 704 642 239 88 2369 HMRa 704 642 239 88 15853、 转换过程 内切酶(HO)识别、切割-Y/Z1交界处-起始MAT序列的转换 (双链断裂) HM匣子受Sir阻遏蛋白的维护 Y区域被降解，直到Y和Ya一样的部分或不断到X区域 四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对 以供体DNA为模板复制Y区域，holliday构造构成 Holliday构造的拆分，产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子4、 特征-同源重组和位点特异性重组特征都具有 需求大范围的同源序列 需求重组酶系rad52基因产物、位点特

13、异性的HO内切酶第三节 转座作用一、转座子概述1、转座子(元)或转座元件(transposon or transposable element): 基因组上不用借助于同源序列就可以挪动的DNA片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点供体和受体转座transposition：转座子的转移过程2、发现和开展 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变 玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理 腾跃基因jumping gene 1947 冷泉港实验室美 Barbara McClintock 基因转座景象的再次发现与证明 在一个支配子

14、中， 与支配基因毗连的构造基因发生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响其后构造基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。 插入型极性突变的发现与机理Operon & Polarity Mutation 极性突变的根本概念A酶活性 O gene Z 基因终止突变位 点离O基因的间隔 I p o Z Y A20世纪60年代末期,在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子1983年Barbara McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖。a) 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b) 转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots (热点)Regional preferen

15、ce ( 在3kb区域内的随机插入) d) 某些转座因子Tn3对同类转座因子的插入具有排他性 免疫性e) 靶序列在转座因子两侧会构成正向反复 f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c) 转座插入的靶位点并非完全随机插入专注型二、Prok.转座子种类 两种类型： 简单转座子simple transposon 插入序列 insertion sequence IS 复合转座子composite transposon 共同特征： a两端有2040bp的IR b具有编码转座酶transposase的基因1、插入序列 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分 命名： I

16、S编号鉴定类型 长度 7002000bp 特点： a两端IR为转座酶的识别位点突变 b插入靶位点后会出现靶位点的正向反复39bp IS 可以正反方向插入到DNA宿主、质粒或某些噬菌体， 常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应a) Tn / TnA family l 具有IR、转座酶基因、 调理基因解离酶、抗抗生素基因 l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 2.5 kb 20 kb Tn3 IR TnpA R

17、es TnpR AmpR IR 38bp 38bp 转座酶 regulator - 内酰胺酶 2、复合转座子 两种类型 b两端反复序列为IS的复合转座子 e.g. IS插入到功能基因两端，能够构成复合转座因子IS ISIS IS L IS R臂 中心区 臂transposition 当两个IS组件一样时，其中任一个都可行使转座功能 不同时，主要依托一个 两侧的IS既可以是IR，又可以是DR形状IR多3 转座噬菌体 Mu phage 巨型转座子 C repressor for A, BB 33 kd 与转座有关A 70 kd 转座酶U, S 毒性蛋白attL, attR 与寄主同源，反向反复，转

18、座必需 Gin G区倒位酶 att L C A B S U att R 150bp 1.5kb G 倒位区 38kbPgin 以E.coli为寄主的温暖型噬菌体溶源、裂解 Mu的插入途径a 侵入的Mu在溶源化过程中恣意插入寄主DNA 两侧各5bp的靶位点序列反复b 进入裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主 DNA中，并可继续转座构成寄主DNA和Mu的共合体，噬 菌体成熟时，切段共合体包装三、转座子的转作机制及方式 三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座方式 本质：转座子元件被复制并被挪动到受体位点，最终转座过程 扩增了转座子的拷贝供、受点 需两种酶： 转作酶作用于原拷

19、贝两末端 解离酶作用于复制后的拷贝 方式： 两大步 a) 共合体构成 切口衔接复制 b) 拆分 靶位点的DR构成2、非复制型转座方式 供体上最终产生双链断裂 供体位点如不能被修复那么有致 死效应3、保守型转座方式 另一种非复制型 与整合机制类似 其转座酶与整合酶家 族有关4、TnA转座方式 复制型转座 转座酶(tnpA)、 解离酶(tnpR) 解离酶需求特异的内 部位点 双重功能：解离功能 tnpA及本身的阻遏物 拆分位点 res 共合体拆分位点 转座结果产生5bp 的正向反复序列 四、转座子转座频率的调控 每个转座子控制本身转座的中心-控制转座酶的程度 1、Tn10转座机制 Tn10为复合型

20、转座子 IS10R元件提供转座酶活性-合成转座酶的序列 自发转座频率-107 Tn10转座酶程度是控制转座的关键 有两种控制转座的方式 a 经过反义RNA的翻译程度控制 IS10R外侧边缘两个启动子 PIN控制IS10R的转录 弱启动子 POUT强启动子 右向转录宿主DNA INRNA和OUTRNA 有36bp的重叠 稳定性： OUTRNAINRNA 大量OUTRNA作为 INRNA的反义RNA b 甲基化作用控制转座酶合成及其与DNA的结合 Tn10转座酶启动子含有GATC序列其它转座子 E.coli中Dam甲基化酶 作用使启动子相对钝化 只能利用刚刚复制完成 时出现少数转座酶 此外，IS10R的末端 IR也含有GATC， 甲基化的GATC不能 结合转座酶 Tn10在DNA刚刚 复制后发生转座五、转座子的某些遗传学效应1.转座频率10-810-3，引起插入突变；2.插入位置染色体重排而出现新基因；3.影响插入位置临近基因的表达,使宿主表现型改动；4.引起染色体插入位点两侧染色体畸变。 真核生物的转座成分根据转座机制目前分为两类： a) 转座机制与细菌的转座子类似 遗传信息： DNADNA 玉米的Ac-Ds