第七章基因结构与表达分析的基本策略ppt课件

1、第七章基因构造与表达分析的根本战略Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes主讲人：罗志勇 教授 1. DNA双螺旋构造发现Watson Crick,1953概 论The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1962Presentation Speech by Professor A. Engstrm Dr. Francis Crick, Dr. James Watson, Your discovery of the molecular structure of the deoxyrib

2、onucleic acid, the substance carrying the heredity, is of utmost importance for our understanding of one of the most vital biological processes. Practically all the scientific disciplines in the life sciences have felt the great impact of your discovery. The formulation of double helical structure o

3、f the deoxyribonucleic acid with the specific pairing of the organic bases, opens the most spectacular possibilities for the unravelling of the details of the control and transfer of genetic information. Central Dogma2.中心法那么提出Crick，1958Crick,1916-2004反转录机制阐明 Temin 1970 补充的中心法那么中心法那么： 代表了大多数生物遗传信息储存和

4、表达的规律，奠定了从分子程度研讨生命科学关键问题的实际根底。3.基因表达gene expression： 从DNA到蛋白质，经过转录和翻译，用基因的遗传信息在细胞内合成有功能意义的各种蛋白质。4.基因构造与表达分析技术： Northern blot Real -time RT PCR 基因芯片DNA序列分析 Southern blot FISHDNARNAWestern blot 蛋白质芯片蛋白质讲授内容：()DNA序列分析()核酸分子杂交() 聚合酶链式反响() 基因芯片和微阵列 () Western免疫印迹一双脱氧链末端终止法 (Sanger ,1977)二化学裂解法 (Maxam Gil

5、bert ,1977 )三DNA自动化序列分析一、DNA序列分析DNA测序技术根底： 高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE技术 PAGE能分别长度为300-500个碱基,差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。 (Sanger, UKMaxam Gilbert, USA)共同分享Nobel化学奖(1979)(一双脱氧链末端终止法dideoxy chain termination 以DNA合成反响为根底。(Sanger) ATP、dATP和ddATP的构造ATPdATPddATP DNA合成反响掺入N个核苷酸掺入N+1个核

6、苷酸1. 双脱氧末端终止法原理 DNA合成反响中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5-P端构成3，5-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提早终止于ddNTP 。 末端终止部位DNA单链模板引物延伸的新合成链 掺入ddNTP2. DNA测序主要步骤 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 单链DNA模板的制备 DNA模板与测序引物退火 掺入法标志反响 延伸-终止反响 放射自显影 阅读测序结果测序步骤G反响管A反响管C反响管G反响管T反响管 G A T C 与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程根底上。 二化学裂解法 将待测DNA片段3或5端进展同位素标志，标志的DNA片

7、段分成四个反响，分别用不同的化学试剂处置，呵斥碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。1.化学裂解法原理 化学降解G反响方式图 硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet三DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标志4种ddNTP终止反响产物，替代放射性同位素标志是实现DNA测序自动化的根底。1. DNA自动测序步骤： 4种带有不同荧光染料标志的终止物ddNTPsSanger测序反响反响产物毛细管电泳分别 荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序。 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光2. DNA自动测序结果()核酸分子杂交Nucleic Acid Hy

8、bridization 细胞原位杂交Pardue et al， 1969) Southern印迹杂交: 检测DNASouthern EM ，1975 Northern印迹杂交: 检测RNAStark GR，1977核酸分子杂交技术的建立核酸分子杂交原理 标志的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA部分互补结合构成杂交双链。 运用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。一、Southern印迹杂交(Southern blot hybridization) 将电泳分别的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标志的核酸探针进展杂交的过程。 Paper TowelsSout

9、hern Blotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpinAgarose Gel Electrophoresis_+3二、Northern印迹杂交(Northern blot hybridization) 指将RNA变性及电泳分别后，并转移到固相支持物上，用杂交反响来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 RNA琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S运用举例GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 杂交分析mRNA的表达靶 mRNA三、其他杂交技

10、术(一)斑点杂交 (dot blot hybridization: 将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研讨。二原位杂交in situ hybridization 用标志的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进展定性、定位和相对定量分析。 三液相杂交 (solution hybridization) 1核酸酶S1 维护分析法 (nuclease S1 protection assay 单链DNA探针与待测RNA构成DNA/RNA杂交双链，参与核酸酶S1专注性地降解未构成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂

11、交双链那么遭到维护而不被降解。 2RNA酶维护分析法 RNase protection assay，RPARPA根本程序：待测RNA的分别体外转录标志RNA探针待测RNA与探针RNA进展液相杂交 RNA酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分别 3.抑制消减杂交原理suppression subtractive hybridization，SSH 以杂交为根底，并与PCR技术结合的cDNA消减杂交方法。 运用：差别表达新基因的挑选与克隆。SSH原理 cDNA Chip and Microarray () 基因芯片和微阵列 基因芯片上的阵列是由有规那么陈列的cDNA或寡核苷酸等样本所组成的 。 基因表达

12、高通量分析法。DNA微阵列： cDNA微阵列cDNA microarray 寡核苷酸微阵列oligomicroarraycDNA微阵列: 在一微小的基片硅片等外表集成了大量分子识别探针，可以平行分析大量基因转录表达，因此又被称为cDNA芯片。基因表达谱芯片主要技术流程：样品荧光标志芯片制备 芯片杂交芯片洗涤和扫描 扫描图像分析102核酸杂交技术和微阵列芯片克隆DNAcDNA标志阵列(Array,Macroarray)杂交、显影高密度微阵列( Microarray )103CBACy5-标志cDNACy3-标志cDNACBACBACBACBACBACBA样品1样品2Cy5/Cy3荧光标志RNA提

13、取竞争性杂交显示基因表达量差别二种样品竞争性杂交表示图基因表达谱芯片的原理104生物学问题提出，表达基因分析，样本分类与实验预测 .实验设计基因芯片实验图象分析结果规范化基因表达谱芯片研讨运用思绪105某些基因表达异常或存在差别生物学确证和解释分析下一步实验设计 cDNA芯片可定量监测大量基因表达水 平，论述基因功能，探求疾病缘由及 机制、发现诊断及治疗靶基因等。cDNA芯片在医学中的运用 Northern blot或RT-PCR验证。 基因表达数据的生物信息学分析。() Western免疫印迹 Western blot原理与核酸分子杂交类似，只是以偶联标志物的抗体分子作为探针，检测转移到固相

14、支持物上的蛋白质分子。Western blot程序： 蛋白质样品制备 SDS分别 蛋白质转膜 标志抗体与膜上蛋白质抗原杂交 检测并分析标志物信号Western免疫印迹信号检测原理 Luminol化学发光原理 另一种信号显示方法是在洗去一抗后，参与碱性磷酸酶标志的二抗，再用BCIPNBT在膜上直接显色。免疫沉淀技术 是一种抗原抗体反响技术，只是将抗体分子先结合到固相载体如磁珠上，然后与含目的蛋白的细胞裂解液进展液相杂交反响，利用磁场或离心等技术将结含在抗体上的蛋白质搜集起来，电泳分别，用于Western blot分析。() 聚合酶链式反响Polymerase Chain Reaction引言 P

15、CR技术发明1985，Mullis K. PCR及其相关技术开展速度惊人、 运用迅速广泛分子生物学、医学、生物学、考古学等学科领域 获Nobel 化学奖1993， Mullis K. 讲授内容提要:一、PCR技术原理二、耐热DNA聚合酶三、PCR引物及设计原那么四、PCR条件的优化 五、PCR改良技术聚合酶链式反响(PCR) :一、PCR技术原理 Mullis K. 1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 DNA复制半保管复制半不延续复制冈崎片段领头链随从链引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸DNA或RN

16、A片段。DNA复制引物：单链RNA片段PCR引物： 单链DNA片段一PCR根本过程1. PCR循环由三步组成： 变性denaturation退火annealing延伸extensionPCR原理低温退火高温变性中温延伸 在模板DNA、引物、4种dNTP存在条件下，依赖DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 2. PCR定义：3. PCR扩增终产物大小: 介于两条退火引物5末端之间的双链DNA片段。4.什么叫引物延伸产物？ 比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始模板DNA为模板的扩增过程中，以倍数方式扩增(2n)。 Y=A1+En Y: 扩增产物的量 A: 最初靶DN

17、A分子数 E: PCR扩增效率 n: 循环次数5. PCR产量 当E100, A=1时 Y=2n 2n(引物延伸产物的量PCR thermal cyclerRotor-GenePCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析二平台期与平台效应1. 平台效应plateau effect： PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入静止期即平台期。PCR平台效应2. 平台期影响要素： 引物及dNTP底物浓度降低。 酶与模板比例下降。 实践运用提示： 定量PCR应思索平台期效应，选择最适循环次数。二、耐热DNA聚合酶三高保真的耐热DNA聚合酶二Taq DNA聚合酶一PCR耐热DNA聚合酶的发现一

18、PCR耐热DNA聚合酶的发现 2.T4 与T7 DNA聚合酶:热稳定性差。1. 大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段 ： 热稳定性差，不耐高温。 反响温度偏低，产生非特异扩增。3.Taq DNA聚合酶:实现了PCR自动化二Taq DNA聚合酶 从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分别出来。 基因全长:2,496 bp 编码蛋白质: 832个AA, 94 kd C端构造域: 53外切酶活性 N端构造域: 聚合酶活性HOOCNH21.较高的热稳定性 95的半衰期: 40 min 最适温度: 72 80 催化反响速率: 150300核苷酸 / 秒/ 酶分子Taq DNA聚合

19、酶特性： 53聚合酶活性； 53外切酶活性； 逆转录酶活性； 较弱的非模板依赖性； 缺乏35外切酶活性。2. 无机离子及抑制剂 Taq DNA聚合酶的活性对Mg 2+ 浓度和单价离子K+或NH4+的性质和浓度较敏感。 最适Mg 2+浓度：2 mmol/L K+浓度：50 mmol/L3. 保真性DNA聚合酶35 外切酶活性核苷酸的错误掺入率T4 DNA聚合酶1/260 000T7 DNA聚合酶1/190 000Klenow片段1/140 000Taq DNA聚合酶1/41 000如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？ 运用Taq DNA聚合酶时，掺入少量具有35外切酶活性的耐热DNA聚合酶,错

20、配率可降为原来的1/10； 使四种dNTP底物浓度相等； MgCl2浓度尽能够低； 减少循环数。三几种高保真的耐热DNA聚合酶 1. Tth DNA聚合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶三、PCR引物及设计原那么一引物设计原那么二引物用量计算一引物设计原那么 引物序列及其与模板特异性结合是决议PCR反响结果的关键。1.引物设计原那么: 引物长度: 1030 Nt 碱基分布: A、T、G、C 随机分布 G+C含量：40 60% Tm=4(G+C)+2(A+T) 引物之间：防止3端互补 引物本身：不应构成二级构造引物5末端碱基:可不与模板 DNA互补 引物3末端碱基：最好

21、选T、 C、 G，不选A引物5端修饰技术附加核酸序列 用 途 限制酶位点 克隆如定向克隆噬菌体启动子 合成RNA探针、测序蛋白质结合序列 产物纯化、检测核糖体结合序列 高效表达加错配碱基呵斥突变 定点诱变2. 简并引物degenerate primers: 针对某一基因编码蛋白的氨基酸区域设计的一组碱基序列不同，但有一样碱基数的寡核苷酸混合物。 简并引物设计及运用： 对纯化的未知蛋白测定一段短 氨基酸序列。 不同物种某一基因编码的保守 氨基酸区域。运用：基于简并引物PCR战略克隆 新基因3.引物设计缺陷而引起的后果 4.优化的引物设计实例上游引物序列： 5GAGAACATGGTGCGCAGGT

22、T 3下游引物序列：5TGCCCATCATCATGACCTGG 35 CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGC

23、CGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG GGTCCAGTACTACTACCCGT AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCCAACTGCGCCGACCCC 31 A260 oligo DNA33gN: 引物碱基数X：合成的oligo DNA A260单位Y：引物的pmol数 106 Ypmol= X33 330 . N X = 105 N (二) 引物用量计算四、PCR条件的优化(一) Taq DNA聚合酶浓度： 1.02.5 U/100 l反响液 (二) dNTP浓度：20200 mol/L (三) Mg2+浓度：0

24、.52.5 mmol/L (四) 引物浓度：0.10.5 mol/LPCR运用举例遗传病诊断：镰状细胞贫血 6 Glu Val (GAG GUG) PCR扩增6 DNA区域传染病诊断：HBV和HIV肿瘤分子标志诊断: bcr-abl PML/RAR个体识别: 亲子鉴定与刑事侦破生物考古五、PCR改良技术一RT-PCR (reverse transcription PCR) 以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进展PCR反响。RT-PCR原理逆转录酶 AMVavian myeloblastosis virus 酶活性最适温度42 MMLVMoloney murine leuk

25、emia virus：最适温度37 二 定量RT-PCRQRT-PCRPCR扩增指数期内极小的扩增效率改动会极大地影响产量。1. 半定量RT-PCR 以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA，在不同引物对引导下共同PCR扩增“看家基因和目的基因cDNA 。 选择内对照基因 组织中普遍表达、表达量比较恒定的“看家基因mRNA。如GAPDH和 -actin mRNA等。 半定量规范 计算PCR 产物 ： 靶cDNA /GAPDH cDNA RT-PCR验证G-Rh2诱导TNFmRNA表达上调25mol/L G-Rh2 12 h 24 h 48 h 72 h + + + + TNFGAPDH 举例2. Real-time RT-PCR原理： PCR体系参与一种双色荧光标志的寡核苷酸探针，根据探针上荧光信号的变化，计算模板DNA的含量。 实时PCR运用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。定量检测PCR产物的指示系统: TaqMan和Molecular Beacon，均依赖荧光共振能量转移fluorescence resonance energy transfer，FRET。 TaqMan Probe 寡核苷酸探针的5端标志一个报告荧光染料reporter fluorescence dye，3端标志一个淬灭染料quencher dye。 当光